Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка воздействия β-ситостерола на воспалительные и профибротические модели мезангиальных клеток при хроническом гломерулонефрите с применением сетевого анализа

107 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/73000

⸱

28 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Hemodialysis Room, Hospital of Traditional Chinese Medicine of Qiqihar, 2Department of Nephrology, Ezhou Central Hospital, 3Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, The First Hospital of Qiqihar, 4Department of Nephrology, Shanghai Minhang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данном исследовании используются методы сетевой фармакологии, подтвержденный молекулярный докинг и эксперименты in vitro для оценки потенциальных взаимодействий между компонентами Cordyceps sinensis и процессами, связанными с хроническим гломерулонефритом. Для подтверждения эффективности на уровне отдельных соединений был выбран β-Sitosterol, который, как было обнаружено, ослабляет воспалительную и профибротическую активацию в моделях мезангиальных клеток.

Аннотация

Хронический гломерулонефрит (ХГН) характеризуется стойким воспалительным повреждением и прогрессирующим фиброзным ремоделированием, однако взаимосвязи между соединениями и мишенями, лежащие в основе терапевтического воздействия натуральных продуктов, остаются определены не полностью. В данном исследовании были интегрированы сетевая фармакология, валидированный молекулярный докинг и эксперименты in vitro для оценки потенциальных компонентов Cordyceps sinensis (C. sinensis) в патологических процессах, связанных с ХГН. Был проведен скрининг потенциальных компонентов C. sinensis, а мишени, ассоциированные с соединениями и полученные с помощью платформы анализа и базы данных системной фармакологии традиционной китайской медицины (TCMSP), были сопоставлены с генами, связанными с ХГН. Функциональный обогатительный анализ и анализ белок-белковых взаимодействий использовались для определения приоритетных биологических процессов и ключевых мишеней. PTGS2 был идентифицирован как основная общая мишень. Молекулярный докинг выполнялся с использованием структуры COX-2 в комплексе с целекоксибом. Повторный докинг кокристаллизованного лиганда целекоксиба воспроизвел кристаллографическую позу с RMSD 0,876 Å, что подтверждает правильность протокола докинга. β-ситостерол и линолеил-ацетат продемонстрировали прогнозируемую совместимость с областью докинга COX-2 с энергией связывания −7,2 и −7,5 ккал/моль соответственно. β-ситостерол был выбран для валидации на уровне соединения в клетках мезангия почечных клубочков крыс линии HBZY-1. В концентрациях 0,5–10 µM β-ситостерол не вызывал значительного снижения жизнеспособности клеток. В клетках, стимулированных липополисахаридом (LPS), β-ситостерол снижал экспрессию Tnf, Il6 и Ptgs2, уменьшал выработку простагландина E2 (PGE2) и снижал содержание белка циклооксигеназы-2 (COX-2). В клетках, обработанных трансформирующим фактором роста β1 (TGF-β1), β-ситостерол снижал экспрессию Col1a1 и Acta2, а также уменьшал содержание белка альфа-гладкомышечного актина (α-SMA). Эти результаты предоставляют данные для формирования гипотезы о том, что β-ситостерол модулирует воспалительную и профибротическую активацию в моделях мезангиальных клеток, однако они не устанавливают прямого ингибирования ферментативной активности COX-2 или терапевтической эффективности при ХГН.

Введение

Хронический гломерулонефрит (ХГН) представляет собой гетерогенную группу гломерулярных нарушений, которые могут прогрессировать до хронической болезни почек и терминальной стадии почечной недостаточности1. Он характеризуется стойким повреждением клубочков, воспалительной активацией и прогрессирующим фиброзным ремоделированием2,3. Хотя кортикостероиды и иммуносупрессивные препараты применяются у отдельных пациентов, в многих случаях долгосрочный контроль заболевания остается затруднительным, а побочные эффекты, связанные с лечением, встречаются часто1,4,5. Прогрессирование ХГН включает взаимодействующие патологические процессы, в том числе иммунную активацию, эндотелиальную дисфункцию, окислительный стресс и накопление внеклеточного матрикса3,6,7. Следовательно, идентификация молекулярных узлов, связывающих воспалительные и профиброзные ответы, может помочь в формулировании проверяемых гипотез для стратегий терапевтического вмешательства при данном заболевании.

Cordyceps sinensis (C. sinensis) применялся в клинических и экспериментальных исследованиях заболеваний почек; сообщалось, что он оказывает противовоспалительное, антиапоптотическое и цитопротекторное действие в нескольких моделях заболеваний8,9,10. Однако молекулярные основы взаимодействия его потенциальных компонентов с мишенями, значимыми при гломерулонефрите, остаются недостаточно изученными11. Учитывая многокомпонентную природу C. sinensis и механическую гетерогенность CGN, сетевая фармакология предоставляет полезный инструментарий для приоритизации потенциальных связей «соединение — мишень — путь»12,13.

В данном исследовании для изучения потенциальных молекулярных связей между кандидатными компонентами C. sinensis и патологическими процессами, связанными с CGN, были интегрированы такие методы, как скрининг соединений, поиск мишеней, анализ пересечения «заболевание-ген», функциональное обогащение, анализ сети белок-белковых взаимодействий, молекулярный докинг и валидация in vitro. Простагландин-эндопероксидсинтаза 2 (PTGS2) была определена как ключевая мишень в сети «соединение-заболевание»; ее оценка проводилась с помощью молекулярного докинга с использованием структуры циклооксигеназы-2 (COX-2), связанной с целекоксибом, с последующей валидацией путем повторного докинга. На основании результатов сетевого анализа, анализа докинга и имеющихся данных о противовоспалительной и противофибротической активности в качестве репрезентативного кандидатного соединения для последующей валидации был выбран β-ситостерол14,15,16. Для оценки воспалительной активации и ответа, связанного с COX-2/простагландином E2 (PGE2), использовались мезангиальные клетки, стимулированные липополисахаридом (LPS), а для оценки экспрессии профибротических маркеров применялась модель, индуцированная трансформирующим ростом фактором β1 (TGF-β1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Сетевой фармакологический и биоинформатический анализы основывались на общедоступных базах данных и не предусматривали участия людей или животных. Эксперименты in vitro проводились с использованием установленной клеточной линии и, согласно институциональным требованиям, не требовали этического одобрения.

Скрининг потенциальных компонентов и поиск мишеней

Потенциальные компоненты и соответствующие им мишени были получены из базы данных и аналитической платформы системной фармакологии традиционной китайской медицины (TCMSP) по поисковому запросу «dongchongxiacao» 13 июля 2025 г. Были отобраны соединения с прогнозируемой пероральной биодоступностью не менее 30% и лекарственной пригодностью (drug-likeness) не менее 0,18. Оба критерия скрининга соответствовали семь потенциальных компонентов. Для описательного сравнения из TCMSP были записаны молекулярная масса, пероральная биодоступность, лекарственная пригодность и другие доступные фармакокинетические дескрипторы.

Информация о связях «соединение-мишень» для отобранных компонентов была загружена непосредственно из базы данных TCMSP. При формировании недублированного набора мишеней повторяющиеся записи удалялись вручную, в то время как исходные связи «соединение-мишень» сохранялись для последующего построения сети. Поскольку в TCMSP названия мишеней были представлены в полном виде, а не в форме стандартизированных символов генов, поиск каждой мишени проводился по базе данных UniProt (дата доступа: 14 июля 2025 г.). Выбиралась соответствующая запись для человека, и название мишени преобразовывалось в официальный символ гена. Стандартизированный набор данных «соединение-мишень» использовался для анализа пересечения «заболевание-мишень» и анализа сети «соединение-мишень».

Сбор генов, ассоциированных с гломерулонефритом, и поиск пересечений с мишенями

Гены, связанные с заболеванием, были получены из баз данных GeneCards, DisGeNET, PharmGKB и Therapeutic Target Database по поисковому запросу «glomerulonephritis» 14 июля 2025 года. Для GeneCards были отобраны записи с показателем релевантности выше медианного значения, равного 10. Подходящие записи из других баз данных включались в соответствии с их курируемыми аннотациями «болезнь-мишень». Названия генов были стандартизированы согласно официальным символам генов человека, а дубликаты удалены. В результате этой процедуры было выявлено 1 134 уникальных генов, связанных с гломерулонефритом. Поскольку при поиске использовался более широкий термин «glomerulonephritis», полученный набор данных был рассмотрен как релевантный молекулярным процессам, связанным с хроническим гломерулонефритом, а не специфичный для одного гистопатологического подтипа.

Мишени, связанные с соединениями, полученные из TCMSP, были пересечены с набором генов, связанных с заболеванием, с помощью программы R. Было выявлено двадцать три общих мишени. Диаграммы Венна были построены с использованием пакета R venn, а сеть перекрывающихся мишеней соединений была сконструирована и визуализирована с помощью Cytoscape. Взаимосвязи между потенциальными компонентами и общими мишенями обобщены в Таблице 1.

Анализ функционального обогащения и белок-белковых взаимодействий

Анализ обогащения по Gene Ontology (GO) и Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) проводили в среде R с использованием пакетов clusterProfiler и org.Hs.eg.db. Термины Gene Ontology анализировали по категориям биологических процессов, клеточных компонентов и молекулярных функций. Значения P корректировали для множественного тестирования по методу Бенджамини-Хохберга; были отобраны термины или пути со скорректированными значениями P ниже 0.05. Обогащенные термины и пути представляли в виде независимо построенных столбчатых и точечных диаграмм.

23 перекрывающихся мишени были внесены в базу данных STRING с выбором организма Homo sapiens и минимальным показателем взаимодействия более 0,4. Полученная сеть белок-белковых взаимодействий была импортирована в Cytoscape. Топология сети оценивалась с помощью CytoNCA на основе показателей степени, центральности по посредничеству, центральности по близости, центральности по собственному вектору, локальной средней связности и центральности сети. Узловые мишени определялись как узлы, для которых значения степени, центральности по посредничеству, центральности по близости, центральности по собственному вектору, локальной средней связности и центральности сети превышали соответствующие медианные значения сети. В результате данного анализа было выделено девять узловых мишеней для последующей интерпретации.

Молекулярный докинг и валидация путем редокинга

Молекулярный докинг проводили с использованием структуры циклооксигеназы-2 в комплексе с целекоксибом (PDB ID 3LN1). В качестве рецептора были оставлены цепь A и связанная с ней группа гема, при этом в процессе подготовки рецептора кристаллографические молекулы воды и сокристаллизованный лиганд целекоксиб были удалены. Нативная конформация целекоксиба была извлечена из цепи A отдельно для валидации путем повторного докинга. С помощью AutoDockTools были добавлены полярные атомы водорода и заряды Гастейгера, после чего рецептор был сохранен в формате PDBQT. PDB ID 3LN1 представляет собой структуру мышиной COX-2, связанной с целекоксибом, с разрешением 2.40 Å. Структуры β-ситостерола и линолеил ацетата были получены из PubChem и подготовлены с помощью Open Babel. Были добавлены атомы водорода и парциальные заряды Гастейгера, определены вращающиеся связи, и каждый лиганд был преобразован в формат PDBQT. Докинг целекоксиба, β-ситостерола и линолеил ацетата выполняли с помощью AutoDock Vina с использованием одного и того же рецептора и параметров поиска.

Бокс докинга был центрирован по нативному региону связывания целекоксиба с использованием следующих координат: center_x = 30.9886 center_y = -22.2836 center_z = -16.5072 size_x = 26 Å size_y = 26 Å size_z = 26 Å. Значение полноты поиска (exhaustiveness) было установлено на уровне 16, количество выходных мод — 10, а энергетический диапазон — 3 kcal/mol. Для визуализации была выбрана наиболее высокоранжированная поза с наименьшей расчетной энергией связывания. Для валидации протокола был проведен редокинг нативного целекоксиба при тех же условиях, а среднеквадратичное отклонение (RMSD) тяжелых атомов между кристаллографической и редокированной позами было рассчитано с помощью PyMOL. Значение RMSD ниже 2 Å считалось приемлемым воспроизведением референсной позы. Остатки, расположенные в пределах 4 Å от каждого задокированного лиганда, были определены в PyMOL. Показатели докинга и позы интерпретировались как оценки структурной совместимости, а не как прямое доказательство связывания с мишенью или ингибирования фермента.

Культивирование клеток и приготовление соединений

Гломерулярные мезангиальные клетки крысы HBZY-1 культивировали в модифицированной среде Игла в модификации Дульбекко с высоким содержанием глюкозы, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина, при 37 °C в увлажненных условиях с 5% CO₂. Для всех экспериментов использовали клетки в пассажах 2–7; перед использованием подтверждалось отсутствие микоплазмы. В качестве химически определенных соединений использовали β-ситостерин и целекоксиб. β-ситостерин растворяли в абсолютном этаноле для приготовления стокового раствора с концентрацией 10 mM (приблизительно 4,15 mg/mL). При необходимости для получения визуально прозрачного раствора проводили кратковременную соникацию и нагрев до 50–60 °C. Целекоксиб растворяли в диметилсульфоксиде для приготовления стокового раствора с концентрацией 10 mM (приблизительно 3,81 mg/mL). Стоковые растворы разделяли на аликвоты и хранили при −20 °C. Перед обработкой стоковые растворы разбавляли непосредственно в предварительно нагретой культуральной среде и немедленно перемешивали.

Концентрации растворителя были согласованы внутри каждого эксперимента. В анализе жизнеспособности клеток конечная концентрация этанола была доведена до 0.2% v/v во всех группах, так как максимальная протестированная концентрация β-sitosterol составила 20 µM. В эксперименте по индуцированию воспаления с помощью LPS конечные концентрации этанола и диметилсульфоксида во всех группах были доведены до 0.1% и 0.01% v/v соответственно. В эксперименте по индуцированию профибротического эффекта с помощью TGF-β1 конечная концентрация этанола была доведена до 0.1% v/v во всех группах. В группы Control, LPS и TGF-β1 добавляли эквивалентные объемы соответствующих растворителей.

Анализ жизнеспособности клеток

Клетки высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 5 × 103 клеток на лунку в 100 µL полной среды и оставляли для адгезии на 24 ч. Для оценки диапазона концентраций β-sitosterol клетки инкубировали с 0,5, 1, 5, 10 или 20 µM β-sitosterol в течение 24 ч. Для анализа жизнеспособности клеток при воздействии LPS клетки предварительно обрабатывали β-sitosterol в концентрациях 1, 5 или 10 µM в течение 2 ч, после чего подвергали воздействию 1 µg/mL липополисахарида в течение дополнительных 24 ч.

Группы обработки включали: контрольную группу, β-sitosterol в концентрации 0.5 µM, β-sitosterol в концентрации 1 µM, β-sitosterol в концентрации 5 µM, β-sitosterol в концентрации 10 µM, β-sitosterol в концентрации 20 µM, LPS, LPS с β-sitosterol в концентрации 1 µM, LPS с β-sitosterol в концентрации 5 µM и LPS с β-sitosterol в концентрации 10 µM. В каждую лунку добавляли по 10 µL реагента Cell Counting Kit-8, после чего планшеты инкубировали в течение 2 h. Затем измеряли оптическую плотность при 450 nm. Жизнеспособность клеток определяли путем вычитания значения холостой пробы без клеток и выражали относительно контрольной группы. Для каждого условия использовали шесть технических лунок в каждом из шести независимых биологических экспериментов. Значения технических лунок из каждого эксперимента усредняли для получения одного значения биологического повтора для статистического анализа.

Воспалительная активация, индуцированная LPS

Для экспериментов по воспалительной активации клетки HBZY-1 высевали в 6-луночные планшеты с плотностью 2 × 105 клеток на лунку и подвергали воздействию после достижения примерно 70%–80% конфлюэнтности. Клетки содержали в среде с добавлением 1% фетальной бычьей сыворотки в течение 12 ч до начала обработки. β-Ситостерол или целекоксиб вводили за 2 ч до стимуляции LPS. Затем клетки подвергали воздействию 1 µg/mL LPS в течение 24 ч.

Экспериментальные группы включали контрольную группу, β$\beta$-ситостерол при 10 µM, ЛПС, ЛПС плюс β$\beta$-ситостерол при 1 µM, ЛПС плюс β$\beta$-ситостерол при 5 µM, ЛПС плюс β$\beta$-ситостерол при 10 µM, и LPS с целекоксибом при 1 µMЦелекоксиб был включен в качестве функционального положительного контроля для ингибирования COX-2-зависимого синтеза простагландинов. По завершении обработки собирали супернатанты культур для измерения уровня PGE2. Клетки собирали отдельно для анализа методом количественной ПЦР в реальном времени на Tnf, Il6и Ptgs2 и для вестерн-блот-анализа COX-2.

Профибротическая активация, индуцированная TGF-β1

Для оценки профибротической активации использовали отдельную модель, индуцированную TGF-β1. Клетки HBZY-1 высевали в 6-луночные планшеты с плотностью 2 × 105 клеток на лунку и культивировали в среде с добавлением 1% эмбриональной бычьей сыворотки в течение 12 ч перед обработкой. Клетки предварительно обрабатывали β-ситостеролом в течение 2 ч, после чего стимулировали рекомбинантным TGF-β1 в концентрации 10 ng/mL в течение 48 ч.

Группы лечения включали контрольную группу, β-ситостерол (10 µM), TGF-β1, TGF-β1 + β-ситостерол (5 µM) и TGF-β1 + β-ситостерол (10 µM). По окончании периода обработки клетки собирали для проведения количественной ПЦР в реальном времени для анализа экспрессии Col1a1 и Acta2, а также для вестерн-блот-анализа альфа-гладкомышечного актина (α-SMA).

Количественная ПЦР в реальном времени

Общую РНК выделяли из обработанных клеток с использованием реагента для экстракции РНК на основе фенола и гуанидиния в соответствии с протоколом производителя. Концентрацию и чистоту РНК определяли с помощью спектрофотометра. Для обратной транскрипции использовали только образцы с соотношением A260/A280 от 1.8–2.0. Для каждого образца 1 µg общей РНК подвергали обратной транскрипции в комплементарную ДНК в конечном объеме реакции 20 µL. Полученную комплементарную ДНК перед количественной ПЦР разводили в пять раз водой, свободной от нуклеаз. Количественную ПЦР проводили в общем объеме 20 µL, содержащем 10 µL 2× SYBR Green master mix, по 0.4 µL прямых и обратных праймеров (10 µM), 2 µL разведенной комплементарной ДНК и 7.2 µL воды, свободной от нуклеаз. Условия амплификации включали этап начальной денатурации при 95 °C в течение 30 s, после чего следовали 40 циклов денатурации при 95 °C в течение 5 s и отжига-элонгации при 60 °C в течение 30 s. Затем проводили анализ кривых плавления в диапазоне от 65 °C до 95 °C для проверки специфичности амплификации.

Измерялись уровни экспрессии генов Tnf, Il6, Ptgs2, Col1a1, Acta2 и Gapdh. Ген Gapdh использовали в качестве внутреннего референсного гена. Относительную экспрессию генов определяли методом 2−ΔΔCt, используя группу Control в качестве калибратора. Последовательности праймеров приведены в Дополнительной таблице 1. Каждый образец анализировали в трех технических повторностях; было проведено шесть независимых биологических экспериментов. Значения, полученные в технических повторностях, усредняли перед проведением статистического анализа.

Измерение уровня PGE2 методом иммуноферментного анализа

Супернатанты культур собирали через 24 ч после стимуляции LPS и центрифугировали при 1,000 × g в течение 10 мин при 4 °C для удаления клеточного дебриса. Концентрации PGE2 определяли с помощью имеющегося в продаже набора для иммуноферментного анализа в соответствии с инструкциями производителя.

Стандарты и образцы наносили на планшет для анализа в дубликатах. После завершения этапов связывания антител и проявления цвета регистрировали оптическую плотность при 450 nm с помощью микропланшетного ридера. Концентрации PGE2 определяли по четырехпараметрической логистической стандартной кривой и выражали в pg/mL. Анализировали супернатанты из шести независимых экспериментов с клетками. Перед статистическим анализом значения дубликатов для каждого биологического образца усредняли.

Вестерн-блоттинг

Обработанные клетки лизировали в буфере для радиоиммунопреципитационного анализа с добавлением смеси ингибиторов протеаз. Лизаты инкубировали на льду в течение 30 min и центрифугировали при 12,000 × g в течение 15 min при 4 °C. Концентрацию белка в супернатантах определяли с помощью бицинхонинового метода анализа белков. Равные количества белка (30 µg на лунку) смешивали с буфером для нанесения и денатурировали при 95 °C в течение 5 min. Белки в экспериментах с LPS разделяли на 10% полиакриламидных гелях с додецилсульфатом натрия, тогда как в экспериментах с TGF-β1 использовали 12% гели. Разделенные белки затем переносили на поливинилиденфторидные мембраны.

Мембраны блокировали 5% раствором обезжиренного молока в трис-солевом буфере, содержащем 0.1% Tween 20, в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего инкубировали в течение ночи при 4 °C с первичными антителами к COX-2 (1:1000), α-SMA (1:1000) и GAPDH (1:5000). Анализ COX-2 проводили в образцах из эксперимента с LPS, в то время как α-SMA анализировали в образцах из эксперимента с TGF-β1. После промывки мембраны инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (1:5000), в течение 1 ч при комнатной температуре. Полосы белков визуализировали с помощью усиленного хемилюминесцентного субстрата и фиксировали с использованием системы хемилюминесцентной визуализации. Время экспозиции составило примерно 10 s для COX-2, 10 s для α-SMA и 2 s для GAPDH.

Интенсивность полос количественно определяли с помощью ImageJ. Сигналы COX-2 и α-SMA были нормализованы по соответствующему сигналу GAPDH. Вестерн-блоттинг проводили с использованием образцов белка, полученных в шести независимых экспериментах по культивированию и обработке клеток.

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с помощью программы GraphPad Prism. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартного отклонения. Для каждого количественного анализа было проведено шесть независимых экспериментов по культивированию и обработке клеток, при этом каждый независимый эксперимент представлял собой одну биологическую повторность. Измерения технических повторов, полученные в рамках одного и того же биологического эксперимента, усреднялись перед статистическим анализом и не рассматривались как независимые наблюдения.

Для анализа жизнеспособности клеток в каждом биологическом эксперименте использовали по шесть технических лунок для каждого условия. Реакции количественной ПЦР проводили в трех технических повторностях для каждого биологического образца, а измерения уровня PGE2 — в двух повторностях. Количественный анализ вестерн-блоттинга основывался на шести независимо подготовленных образцах белка. Таким образом, каждый количественный столбец содержит значения шести индивидуальных биологических повторов.

Различия между несколькими группами анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим использованием критерия множественных сравнений Тьюки. Двустороннее значение P < 0.05 считалось статистически значимым. Значения отдельных биологических повторностей представлены вместе со средним значением и стандартным отклонением.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Скрининг потенциальных компонентов, поиск мишеней и определение пересечения мишеней

Рабочий процесс идентификации потенциальных общих мишеней «соединение–заболевание» обобщен на Рисунке 1A. Семь потенциальных соединений C. sinensis соответствовали установленным критериям скрининга (OB ≥30% и DL ≥0.18), в число которых вошли арахидоновая кислота, линолеил-ацетат, β-ситостерин, пероксиэргостерол, церевистерол, холестерилпальмитат и CLR (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В данном исследовании были интегрированы методы сетевой фармакологии, молекулярного докинга с валидацией по референсным лигандам и эксперименты на уровне отдельных соединений для проверки гипотезы, связанной с PTGS2 и основанной на анализе потенциальных компонентов C. sinensis. Семь компонентов соответствовали заранее определенным критериям скрининга TCMSP, и 23 мишени совпали с набором генов, связанных с гломерулонефритом. Анализ белковых взаимодействий позволил выделить девять центральных мишеней, из ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Инструменты на базе искусственного интеллекта (ChatGPT, OpenAI) использовались для помощи в редактировании языка и предварительной разработке схематических рисунков. Генеративный искусственный интеллект применялся для подготовки предварительных графических эскизов к Рисункам 1A и 7, которые впоследствии были проверены и доработаны авторами для обеспечения соответствия описанным методам и результатам. Все результаты, полученные с помощью ИИ, были подвергнуты критической оценке и утверждены авторами. Авторы проверили окончательное содержание рисунков и приняли на себя полную ответственность за целостность и точность рукописи.

Благодарности

Данное исследование было поддержано Интегрированной специальностью по характеристикам нефропатии в традиционной китайской и западной медицине (ZYTSZK2-3) и Исследованием стратегии вмешательства ТКМ при хронической болезни почек с точки зрения управления хроническими заболеваниями (202240169).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Абсолютный этанолSigma-Aldrich/MerckE7023200 proof, неденатурированный этанол степени чистоты для молекулярной биологии; растворитель для стокового раствора β-ситостерола.
AutoDock VinaScripps ResearchVersion 1.1.2Моделирование молекулярного докинга
Бокс биологической безопасностиThermo Fisher Scientific1300 Series A2Стерильные операции по культивированию клеток
ЦелекоксибMedChemExpressHY-14398Селективный ингибитор COX-2, используемый в качестве положительного контроля; стоковый раствор 10 mM в DMSO. 
Cell Counting Kit-8Dojindo Molecular Technologies, Inc.CK04Колориметрический анализ WST-8 для определения жизнеспособности клеток; измерение абсорбции при 450 nm.
Система хемилюминесцентной визуализацииBio-Rad LaboratoriesChemiDoc MPПолучение изображений вестерн-блоттинга
R-пакет clusterProfilerBioconductorVersion 4.10.0Анализ обогащения GO и KEGG
Инкубатор для культур клеток с CO2Thermo Fisher ScientificForma Series II 3111Инкубация культур клеток при 37 °C и 5% CO2
Кроличьи моноклональные антитела к COX-2 (D5H5)Cell Signaling Technology12282Валидированы для вестерн-блоттинга белков COX-2 человека, мыши и крысы; разведение 1:1,000.
Плагин CytoNCACytoscape App StoreVersion 2.1.6Топологический анализ хаб-мишеней
Программное обеспечение CytoscapeCytoscape ConsortiumVersion 3.8.0Визуализация и анализ сетей
ДиметилсульфоксидSigma-Aldrich/MerckD2650Стерильно фильтрованный BioReagent, ≥99.7%; растворитель для стокового раствора целекоксиба.
База данных DisGeNETIntegrative Biomedical Informatics GroupNot applicableПоиск связей «заболевание-ген» для гломерулонефрита
Модифицированная среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM)Gibco/Thermo Fisher ScientificC11995500BTБазальная среда для культивирования клеток HBZY-1
Субстрат для усиленной хемилюминесценцииBeyotime BiotechnologyP0018SВизуализация полос вестерн-блоттинга
Фетальная бычья сывороткаGibco/Thermo Fisher Scientific10099-141CСывороточная добавка для культивирования клеток
Кроличьи моноклональные антитела к GAPDH (D16H11)Cell Signaling Technology5174Контроль нагрузки для вестерн-блоттинга; реактивны с GAPDH человека, мыши и крысы; разведение 1:5,000 после внутренней оптимизации.
База данных GeneCardsWeizmann Institute of ScienceNAПоиск генов, ассоциированных с гломерулонефритом
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 9.0.0.121Статистический анализ данных экспериментов in vitro
Козьи антитела против IgG кролика, конъюгированные с HRPProteintech GroupSA00001-2Вторичные антитела для первичных кроличьих антител
Программное обеспечение ImageJNational Institutes of HealthVersion 1.54Денситометрический анализ вестерн-блоттинга
Инвертированный фазово-контрастный микроскопOlympusCKX53Наблюдение за морфологией клеток
R-пакет org.Hs.eg.dbBioconductorVersion 3.18.0Аннотация генов человека для анализа обогащения
Раствор пенициллина-стрептомицинаGibco/Thermo Fisher Scientific15140122Антибиотическая добавка для культивирования клеток
Набор для определения параметров PGE2R&D Systems, a Bio-Techne brandKGE004BМноговидовой конкурентный ИФА для супернатантов культур клеток; диапазон анализа 39–2,500 pg/mL; колориметрическое детектирование при 450 nm.
База данных PharmGKBPharmacogenomics KnowledgebaseNAПоиск мишеней, связанных с заболеванием
База данных PubChemNational Center for Biotechnology InformationNAПоиск структур лигандов
Мембрана PVDFMillipore/MerckIPVH00010Мембрана для переноса белков при вестерн-блоттинге
Система молекулярной графики PyMOLSchrödinger, LLCVersion 2.6.2Визуализация поз докинга
Программное обеспечение RR Foundation for Statistical ComputingVersion 4.3.2Анализ пересечения и обогащения мишеней
Линия гломерулярных мезангиальных клеток крысы (HBZY-1)Procell Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0117Модель валидации мезангиальных клеток in vitro
Банк данных белков RCSB PDBResearch Collaboratory for Structural BioinformaticsPDB ID: 3LN1Получение кристаллической структуры PTGS2/COX2
Рекомбинантный белок TGF-β1 человекаPeproTech, a Thermo Fisher Scientific brand100-21-10UGРекомбинантный TGF-β1 человека, полученный из HEK293; профибротическая стимуляция при 10 ng/mL. 
Система электрофореза SDS-PAGEBio-Rad LaboratoriesMini-PROTEAN TetraРазделение белков методом SDS-PAGE
База данных STRINGELIXIR/STRING ConsortiumVersion 12.0Построение сети белок-белковых взаимодействий
База данных TCMSPTraditional Chinese Medicine Systems Pharmacology DatabaseNAСкрининг соединений-кандидатов из Cordyceps sinensis
База данных терапевтических мишеней (TTD)Innovative Drug Research and Bioinformatics GroupNAПоиск терапевтических мишеней
Первичные антитела к α-SMAProteintech Group14395-1-APДетекция экспрессии белка α-SMA
β-Ситостерол (чистота >98%)MedChemExpressHY-N0171ACAS 83-46-5; определенное соединение, используемое для обработки клеток; стоковый раствор 10 mM в абсолютном этаноле. 

Ссылки

  1. Kidney Disease: Improving Global Outcomes Glomerular Diseases Work G. KDIGO 2021 Clinical Practice Guideline for the Management of Glomerular Diseases. Kidney Int. 2021;100(4S):S1–S276.
  2. Roccatello D. et al. From inflammation to renal fibrosis: A one-way road in autoimmunity? Autoimmun Rev. 2024;23(4):103466.
  3. Reiss AB. et al. Fibrosis in Chronic Kidney Disease: Pathophysiology and Therapeutic Targets. J Clin Med. 2024;13(7).
  4. Kant S, Kronbichler A, Geetha D. Principles of Immunosuppression in the Management of Kidney Disease: Core Curriculum 2022. Am J Kidney Dis. 2022;80(3):393–405.
  5. El Karoui K, Fervenza FC, De Vriese AS. Treatment of IgA Nephropathy: A Rapidly Evolving Field. J Am Soc Nephrol. 2024;35(1):103–16.
  6. Stenvinkel P. et al. Chronic Inflammation in Chronic Kidney Disease Progression: Role of Nrf2. Kidney Int Rep. 2021;6(7):1775–87.
  7. Tanaka S, Portilla D, Okusa MD. Role of perivascular cells in kidney homeostasis, inflammation, repair and fibrosis. Nat Rev Nephrol. 2023;19(11):721–32.
  8. Liu W. et al. Mechanism of Cordyceps sinensis and its Extracts in the Treatment of Diabetic Kidney Disease: A Review. Front Pharmacol. 2022;13:881835.
  9. Yan G. et al. The effects of Ophiocordyceps sinensis combined with ACEI/ARB on diabetic kidney disease: A systematic review and meta-analysis. Phytomedicine. 2023;108:154531.
  10. Li S, Pang W, Wang Y, Zhang Y. Cordyceps sinensis extract protects against acute kidney injury by inhibiting perforin expression in NK cells via the STING/IRF3 pathway. Aging (Albany NY). 2024;16(7):5887–904.
  11. Zhang Y, Li K, Zhang C, Liao H, Li R. Research Progress of Cordyceps sinensis and Its Fermented Mycelium Products on Ameliorating Renal Fibrosis by Reducing Epithelial-to-Mesenchymal Transition. J Inflamm Res. 2023;16:2817–30.
  12. Zhao L. et al. Network pharmacology, a promising approach to reveal the pharmacology mechanism of Chinese medicine formula. J Ethnopharmacol. 2023;309:116306.
  13. Ru J. et al. TCMSP: a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines. J Cheminform. 2014;6:13.
  14. Bi Y. et al. beta-Sitosterol Suppresses LPS-Induced Cytokine Production in Human Umbilical Vein Endothelial Cells via MAPKs and NF-kappaB Signaling Pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2023;2023:9241090.
  15. Sun Y, Gao L, Hou W, Wu J. beta-Sitosterol Alleviates Inflammatory Response via Inhibiting the Activation of ERK/p38 and NF-kappaB Pathways in LPS-Exposed BV2 Cells. Biomed Res Int. 2020;2020:7532306.
  16. Park YJ. et al. Effects of beta-Sitosterol from Corn Silk on TGF-beta1-Induced Epithelial-Mesenchymal Transition in Lung Alveolar Epithelial Cells. J Agric Food Chem. 2019;67(35):9789–95.
  17. Li DD. et al. RTEC-intrinsic IL-17-driven inflammatory circuit amplifies antibody-induced glomerulonephritis and is constrained by Regnase-1. JCI Insight. 2021;6(13).
  18. Martin-Carro B. et al. Role of Klotho and AGE/RAGE-Wnt/beta-Catenin Signalling Pathway on the Development of Cardiac and Renal Fibrosis in Diabetes. Int J Mol Sci. 2023;24(6).
  19. Naas S, Schiffer M, Schodel J. Hypoxia and renal fibrosis. Am J Physiol Cell Physiol. 2023;325(4):C999–C1016.
  20. Harris RC, Breyer MD. Physiological regulation of cyclooxygenase-2 in the kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 2001;281(1):F1–11.
  21. Calder PC. Eicosanoids. Essays Biochem. 2020;64(3):423–41.
  22. Waldner C, Heise G, Schror K, Heering P. COX-2 inhibition and prostaglandin receptors in experimental nephritis. Eur J Clin Invest. 2003;33(11):969–75.
  23. Pan Y. et al. Myeloid cyclooxygenase-2/prostaglandin E2/E-type prostanoid receptor 4 promotes transcription factor MafB-dependent inflammatory resolution in acute kidney injury. Kidney Int. 2022;101(1):79–91.
  24. Volzke A, Koch A, Meyer Zu Heringdorf D, Huwiler A, Pfeilschifter J. Sphingosine 1-phosphate (S1P) induces COX-2 expression and PGE2 formation via S1P receptor 2 in renal mesangial cells. Biochim Biophys Acta. 2014;1841(1):11–21.
  25. Sawano H. et al. 15-Deoxy-Delta12,14-prostaglandin J2 inhibits IL-1beta-induced cyclooxygenase-2 expression in mesangial cells. Kidney Int. 2002;61(6):1957–67.
  26. Guo B. et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma ligands inhibit TGF-beta 1-induced fibronectin expression in glomerular mesangial cells. Diabetes. 2004;53(1):200–8.
  27. Zou R. et al. PPARgamma agonists inhibit TGF-beta-PKA signaling in glomerulosclerosis. Acta Pharmacol Sin. 2010;31(1):43–50.
  28. Wei J. et al. PP2 Ameliorates Renal Fibrosis by Regulating the NF-kappaB/COX-2 and PPARgamma/UCP2 Pathway in Diabetic Mice. Oxid Med Cell Longev. 2021;2021:7394344.
  29. Yang C, Chen EA, Zhang Y. Protein-Ligand Docking in the Machine-Learning Era. Molecules. 2022;27(14).
  30. Quiroga R, Villarreal MA. Developing Generalizable Scoring Functions for Molecular Docking: Challenges and Perspectives. Curr Med Chem. 2025;32(28):5960–72.
  31. Li J. et al. TGF-beta/Smad signaling in chronic kidney disease: Exploring post-translational regulatory perspectives (Review). Mol Med Rep. 2024;30(2).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Бета-ситостеролсетевая фармакологиямолекулярный докингингибирование COX-2воспалительные путипрофибротическая активацияCordyceps sinensisанализ белок-белковых взаимодействий
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.