Исследовательская статья

Наноструктурированные липидные носители с гидроксимочевиной для повышения цитотоксичности in vitro и эффективности доставки лекарственного препарата

18 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/73012

⸱

22 сентября 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutics, College of Pharmacy, Jazan University, 2School of Health Sciences, University of Petroleum and Energy Studies, 3Center for Global Health Research, Saveetha Medical College, and Hospitals, Saveetha Institute of Medical and Technical Sciences, Saveetha University

В этой статье

Краткое содержание

В данном исследовании были разработаны наноструктурированные липидные носители (NLCs), нагруженные гидроксимочевиной, а также оценены их свойства и противоопухолевая активность in vitro. NX-ST продемонстрировал высокую эффективность инкапсуляции, контролируемое высвобождение и более выраженную цитотоксичность в отношении клеток MCF-7 (IC₅₀ = 225 µg/mL) по сравнению со свободной гидроксимочевиной (IC₅₀ = 722.57 µg/mL).

Аннотация

Гидроксимочевина (HU) является признанным противоопухолевым препаратом, используемым для лечения хронического миелолейкоза, однако ее терапевтическая эффективность ограничена быстрым клиренсом, вариабельной биодоступностью и дозозависимой токсичностью. Целью данного исследования была оптимизация доставки HU путем разработки наноструктурированных липидных носителей (NLCs), нагруженных гидроксимочевиной, с использованием различных комбинаций поверхностно-активных веществ. Были подготовлены три состава, включая NX-ST (Tween 80–SDS), NX-CT (Cremophor EL–Tween 80) и NX-CS (Cremophor EL–SDS), которые оценивались по размеру частиц, индексу полидисперсности (PDI), дзета-потенциалу, эффективности инкапсуляции (EE) и цитотоксической активности. Полученные составы характеризовались наноразмерным диаметром частиц (67.377–110 nm), приемлемым PDI (<0.35), высоким дзета-потенциалом (-30.033–-46.433 mV) и хорошей эффективностью инкапсуляции (78.189–86.626%), что свидетельствует о стабильности формуляций. Профиль высвобождения демонстрировал приблизительно линейный рост в период от 0.5 до 6 h с последующим выходом на плато. Исследования цитотоксичности показали повышенную противоопухолевую активность по сравнению со свободной HU (IC₅₀ = 722.57 µg/mL). Состав NX-ST продемонстрировал самую высокую цитотоксичность (IC₅₀ = 225 ± 21.47 µg/mL), что согласуется с улучшенной доставкой препарата; вклад усиленного клеточного захвата предполагается, но не измерялся непосредственно в данном исследовании. Изученные составы NLC, в частности NX-ST, эффективно повысили терапевтические показатели HU за счет улучшения стабильности, эффективности доставки и противоопухолевой активности.

Введение

Рак остается одной из главных причин смерти во всем мире: в 2022 году было зарегистрировано почти 20 миллионов новых случаев заболевания и 9,7 миллиона смертей от рака. К 2040 году прогнозируется значительный рост этих показателей — до 29,9 миллиона новых случаев и 15,3 миллиона смертей от рака ежегодно1,2. Большинство современных схем противоракового лечения основано на применении высокотоксичных соединений, однако их системная токсичность ограничивает терапевтические концентрации, которые могут эффективно достигать раковых тканей3. Чтобы преодолеть эту проблему, исследователи изучают новые подходы к доставке лекарств для усиления таргетности опухолей и повышения терапевтического индекса химиотерапии.

Одним из важнейших направлений онкологических исследований является разработка передовых систем доставки лекарств для повышения терапевтической эффективности при одновременном снижении побочных эффектов противоопухолевых препаратов. Гидроксимочевина (HU), широко известное химиотерапевтическое и противоопухолевое средство, занимает центральное место в лечении серповидноклеточной анемии, хронического миелолейкоза и некоторых солидных опухолей благодаря ее способности увеличивать выработку фетального гемоглобина и подавлять синтез ДНК путем воздействия на рибонуклеотидредуктазу4,5. Несмотря на клиническую эффективность, терапевтический потенциал HU ограничен такими проблемами, как быстрый клиренс, вариабельная биодоступность и узкий терапевтический индекс, что часто приводит к изменчивой фармакокинетике и дозозависимой токсичности, включая миелосупрессию, желудочно-кишечные расстройства и риск развития вторичных злокачественных новообразований6,7. Для преодоления этих ограничений в качестве перспективных стратегий были предложены передовые системы доставки лекарств, в том числе наноструктурированные липидные носители (NLCs), которые позволяют повысить стабильность, растворимость и контролируемое высвобождение гидроксимочевины, тем самым улучшая профиль ее безопасности и эффективности8.

НЛК (наноструктурированные липидные носители) представляют собой тип наночастиц на липидной основе, обладающих рядом преимуществ по сравнению с традиционными системами доставки лекарств. Они состоят из матрицы твердого липида, стабилизированной поверхностно-активными веществами, и могут инкапсулировать как гидрофильные, так и липофильные препараты. Такая уникальная структура позволяет увеличить емкость загрузки лекарственного средства, обеспечить контролируемое высвобождение и повышенную стабильность9,10. Приготовление НЛК обычно включает такие методы, как гомогенизация под высоким давлением и ультразвуковая обработка, которые способствуют формированию наночастиц с узким распределением по размеру и высокой эффективностью инкапсуляции11,12. Инкапсуляция препарата в НЛК не только повышает его растворимость и стабильность, но и облегчает адресную доставку в раковые клетки, сводя к минимуму побочные эффекты. Недавние исследования продемонстрировали потенциал нагруженных лекарствами НЛК в улучшении терапевтического индекса и профилей пролонгированного высвобождения препарата13,9. Этот механизм контролируемого высвобождения имеет решающее значение для поддержания терапевтических концентраций препарата в течение длительного времени, что снижает частоту введения и повышает приверженность пациента лечению14. Исследования показали, что НЛК, нагруженные такими противоопухолевыми препаратами, как gefitinib15, capecitabine16 и imatinib14, значительно повышают эффективность лекарств за счет улучшения клеточного захвата и накопления в раковых клетках. Например, НЛК с gefitinib продемонстрировали 4,5-кратное увеличение цитотоксичности по отношению к раковым клеткам по сравнению со свободным препаратом, что подчеркивает потенциал НЛК в повышении терапевтического индекса ингибиторов тирозинкиназы, используемых при лечении немелкоклеточного рака легкого и колоректального рака. Аналогичным образом, НЛК с capecitabine улучшают стабильность препарата и контролируемое высвобождение, что крайне важно для поддержания терапевтических концентраций и снижения системной токсичности. НЛК с imatinib также выигрывают от улучшенной адресной доставки, что снижает побочные эффекты и улучшает результаты лечения пациентов с хроническим миелоидным лейкозом. Эти характеристики делают НЛК перспективными кандидатами для клинических испытаний и потенциального применения в персонализированной медицине путем адаптации лечения под индивидуальный профиль пациента. Оценка стабильности нагруженных лекарствами НЛК является еще одним важным аспектом, влияющим на их клиническую применимость. Исследования стабильности часто включают воздействие на рецептуры различных условий окружающей среды для оценки их физической целостности с течением времени.

Ускоренные испытания на стабильность показали, что данные NLC сохраняют свою структурную целостность и содержание препарата в течение длительного времени, что подчеркивает их потенциал для долгосрочного хранения и использования4,17.

Несмотря на эти преимущества, выбор поверхностно-активного вещества (ПАВ) существенно влияет на физико-химические свойства и эффективность наноструктурированных липидных носителей (НЛН). Липидно-сурфактантные системы играют важную роль в повышении стабильности наночастиц, инкапсуляции лекарственных средств и их биодоступности18,19,20. Однако лишь в немногих исследованиях изучалось, как различные комбинации ПАВ влияют на физико-химические характеристики и цитотоксическую активность НЛН, нагруженных гидроксимочевиной. Таким образом, данная работа была направлена на разработку НЛН с гидроксимочевиной (NANOXURIA) с использованием различных систем ПАВ и на систематическую оценку влияния этих вариаций на физико-химическую стабильность, поведение при хранении и противоопухолевую активность. Установив четкую взаимосвязь между дизайном рецептуры и терапевтической эффективностью, авторы данной работы стремятся создать эффективную дисперсную систему на основе наноносителей (коллоидную дисперсию) для характеристики рецептур НЛН с гидроксимочевиной и оценки высвобождения препарата in vitro, цитотоксичности и краткосрочной стабильности при хранении, что позволит получить базовые физико-химические данные и данные об эффективности in vitro для дальнейшей разработки методов доставки HU без изменения самой молекулы лекарственного вещества.

Протокол

Данное исследование не предусматривало участия людей, использования тканей человеческого происхождения или живых животных. Все биологические оценки проводились in vitro с использованием коммерчески доступной линии клеток рака молочной железы человека MCF-7, полученной из Американской коллекции типовых культур (ATCC). Соответственно, одобрение институционального наблюдательного совета (IRB) или комитета по этике для данной работы не требовалось.

Материалы

Гидроксимочевина (HU) (чистота ≥99%), додецилсульфат натрия (SDS) (анионный, чистота 90%), Tween-80 (T80) (неионогенный, содержание олеиновой кислоты ≥58%), Cremophor EL (неионогенный, производное касторового масла, чистота ≥98%), стеариновая кислота (чистота 95–106%) и кунжутное масло использовались в исходном виде. Все остальные использованные химикаты и реагенты имели квалификацию «ч.д.а.» (аналитическая чистота). Полные данные о поставщиках и каталожные номера всех материалов и оборудования приведены в Таблице материалов.

Приготовление NLC, нагруженных гидроксимочевиной (NANOXURIA)

Приготовление NANOXURIA включает три этапа, а именно: приготовление липидной фазы, включение лекарственного вещества и приготовление водной фазы. Липидную фазу получали путем расплавления смеси стеариновой кислоты (500 mg) и кунжутного масла (250 µl). Расплав готовили в стакане на нагревательной плитке. Точно взвешенное количество HU (150 mg) смешивали с липидной фазой. Водную фазу готовили путем растворения поверхностно-активных веществ (Таблица 1) в воде (Millipore) (25 mL). Раствор ПАВ нагревали до той же температуры, что и липидная фаза (70°C), чтобы избежать преждевременного затвердевания. Горячую водную фазу постепенно добавляли к расплавленной липидной фазе при высокоскоростном перемешивании с помощью гомогенизатора. Смесь гомогенизировали на высокой скорости (6,000 rpm) в течение 20 min для создания стабильной горячей эмульсии. Горячую эмульсию охлаждали до комнатной температуры при непрерывном перемешивании. В процессе охлаждения липидная фаза затвердевает, образуя NLCs. Приготовленные NLCs, нагруженные HU, хранили для последующего анализа характеристик и применения.

Характеристика и оценка

Размер частиц, дзета-потенциал (ZP) и индекс полидисперсности (PDI)

Анализ размера частиц и индекса полидисперсности (PDI) NANOXURIA проводили с использованием Zetasizer Nano ZS90. Этот прибор работает по принципу динамического рассеяния света (DLS), который измеряет броуновское движение частиц в суспензии и сопоставляет его с их гидродинамическим диаметром с помощью уравнения Стокса-Эйнштейна. Помимо размера и PDI, с помощью того же прибора оценивали поверхностный заряд NANOXURIA путем измерения дзета-потенциала (ZP). Дзета-потенциал определяли методом электрофоретического рассеяния света (ELS), при котором для расчета поверхностного заряда анализируется скорость частиц в приложенном электрическом поле. Этот параметр имеет решающее значение для оценки коллоидной стабильности NANOXURIA. Измерения проводили в контролируемой среде, помещая разбавленные образцы в кюветы для обеспечения соответствия оптическим и электрическим требованиям прибора. Для повышения достоверности и воспроизводимости результатов все измерения выполняли в трех повторностях.

Морфология

Морфология NANOXURIA изучалась с помощью электронного микроскопа, работающего в режимах просвечивающей и сканирующей микроскопии. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) применялась для изучения внутренней структуры и формы частиц, в то время как полевая эмиссионная сканирующая электронная микроскопия Для исследования морфологии поверхности и распределения частиц использовали сканирующую электронную микроскопию с полевой эмиссией (FE-SEM). Образцы подвергали соответствующей подготовке и анализировали при подходящих ускоряющих напряжениях для получения изображений высокого разрешения. При подготовке образцов дисперсии NANOXURIA разбавляли очищенной водой; для трансмиссионной электронной микроскопии (TEM) каплю разбавленной дисперсии наносили на медную сетку с углеродным покрытием, удаляли излишки, после чего пленку высушивали на воздухе при комнатной температуре перед визуализацией в условиях высокого вакуума при ускоряющем напряжении 60–80 кВ. Для FE-SEM каплю разбавленной дисперсии наносили на алюминиевый держатель (стаб), высушивали на воздухе и покрывали тонким проводящим слоем методом распыления перед визуализацией при 1–3 кВ. Были получены репрезентативные микрофотографии при различных увеличениях.

Анализ эффективности инкапсуляции для рецептур NANOXURIA

Эффективность включения (EE) NANOXURIA оценивали методом ультрафильтрационного центрифугирования с использованием центрифужного фильтра Amicon Ultra-2 mL (предел отсечения по молекулярной массе 3 kDa). Данный метод позволял отделить невключенный HU (приблизительно 6 mg в 1 mL NANOXURIA) от инкапсулированной фракции путем центрифугирования при 4,000 x g в течение 20 min при 25 °C, что обеспечивало эффективную изоляцию. Фильтрат, содержащий свободный HU, разбавляли очищенной водой и анализировали с помощью УФ-видимого спектрофотометра при 213 nm для количественного определения невключенного препарата, используя калибровочный график, основанный на законе Бугера — Ламберта — Бера. % EE рассчитывали следующим образом;

figure-protocol-1

Исследование высвобождения in vitro

Профиль высвобождения HU из NANOXURIA in vitro оценивали методом диффузии через диализный мешок, который является широко применяемым способом анализа контролируемого высвобождения лекарственных веществ. Диализные мешки (12–14 kDa MWCO) предварительно замачивали в дистиллированной воде в течение 12 h для обеспечения надлежащей гидратации и удаления консервантов. Один конец диализного мешка надежно запечатывали, после чего в мешок осторожно вносили 2 mL препарата NANOXURIA, эквивалентных 12 mg HU. Другой конец мешка плотно завязывали узлом для предотвращения утечки. Диализный мешок погружали в стакан с водой (50 mL), которая служила средой для высвобождения. Установку поддерживали при температуре 37 ± 0.5 °C для имитации температуры тела и перемешивали при 50 rpm с помощью магнитной мешалки для обеспечения равномерного смешивания и минимизации эффектов пограничного слоя. Через определенные интервалы времени (0.5, 1, 2, 4, 6, 12 и 24 h) из среды высвобождения отбирали аликвоты объемом 2 mL и немедленно заменяли их равным объемом свежей, предварительно нагретой воды для поддержания условий стока. Собранные образцы фильтровали через шприцевой фильтр 0.45 µm для удаления твердых частиц, обеспечивая чистоту проб для анализа. Мембранный фильтр удерживает частицы, позволяя растворенному HU проходить сквозь него. Поскольку HU легко растворим в воде, свободное лекарственное вещество оставалось в фильтрате, что гарантировало, что удержанный материал представляет собой частицы, а не свободный препарат. Затем отфильтрованные образцы анализировали на содержание HU с помощью УФ-видимого спектрофотометра при длине волны 213 nm, соответствующей максимуму поглощения HU (λmax). Для точного количественного определения концентрации HU был построен калибровочный график.

Культивирование клеток

Исследование проводилось с использованием метастатической клеточной линии рака молочной железы человека MCF-7, полученной из Американской коллекции типовых культур (ATCC). Клетки поддерживали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) для обеспечения роста и жизнеспособности клеток, а также 1% раствора пенициллина-стрептомицина для предотвращения микробиологического загрязнения в процессе культивирования. Затем клетки инкубировали в стандартных физиологических условиях при 37 °C в увлажненном CO₂-инкубаторе, поддерживая pH культуральной среды на уровне 7.4. Данные условия были выбраны для обеспечения оптимального роста, пролиферации клеток и достоверности результатов на протяжении всех исследований цитотоксичности.

Анализ жизнеспособности клеток (MTT-тест)

МТТ-тест был проведен для оценки способности различных составов NANOXURIA индуцировать гибель клеток16,21. Вкратце, клетки MCF-7 высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 1 x 104 клеток/мл и инкубировали в течение 24 ч в CO₂-инкубаторе для обеспечения надлежащего прикрепления и роста клеток. Необработанные клетки служили отрицательным контролем, а лунки, содержащие только культуральную среду, использовали в качестве холостых контролей. После инкубации культуральную среду заменили свежей средой, содержащей различные концентрации исследуемых составов, до 200 µg/mL. Обработанные планшеты инкубировали далее в течение 72 ч в стандартных условиях культивирования. После обработки в каждую лунку добавляли 20 µL МТТ-реагента (5 mg/mL) и инкубировали еще 4 ч для формирования внутриклеточных кристаллов формазана в метаболически активных клетках. Затем добавляли 100 µL диметилсульфоксида (DMSO) для растворения кристаллов, в результате чего получался раствор фиолетового цвета. Оптическую плотность измеряли при 570 nm с помощью планшетного ридера (SpectroStar Nano). Жизнеспособность клеток (%) рассчитывали относительно группы необработанного контроля, используя полученные значения оптической плотности.

figure-protocol-2

Изучение стабильности

Стабильность NANOXURIA систематически оценивали в течение 3 месяцев в контролируемых условиях хранения для определения возможности её длительного использования. Каждую формуляцию NANOXURIA разделяли на аликвоты в герметичные контейнеры из янтарного стекла для минимизации воздействия света и влаги. Контейнеры хранили при постоянной комнатной температуре 25 ± 2 °C и в холодильнике при температуре 4 ± 2 °C. Образцы периодически анализировали через заданные интервалы времени (1, 2 и 3 месяца) на предмет физической и физико-химической стабильности. Базовое измерение проводили сразу после приготовления и перед началом хранения; этот момент был принят за 0 месяцев (исходное состояние). Физическая оценка включала визуальный осмотр на предмет изменений внешнего вида, в том числе признаков агломерации, седиментации, фазового разделения, изменения цвета (например, от почти белого до желтого), консистенции (например, вязкости или текстуры) и запаха (например, прогорклости из-за окисления липидов). Для оценки физико-химической стабильности измеряли основные параметры характеристики, включая размер частиц, индекс полидисперсности (PDI) и дзета-потенциал (ZP).

Статистический анализ

В данном исследовании все экспериментальные результаты представлены в виде средних значений ± стандартного отклонения (SD) (n = 3) для отображения центральной тенденции и вариативности данных. Статистический анализ проводился с использованием парного t-критерия для оценки состава, а также однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим критерием множественных сравнений Тьюки для сопоставления различий между составами. Значение p < 0,05 считалось статистически значимым. Статистический анализ выполнялся с помощью программы GraphPad Prism версии 10.

Результаты

Физико-химические свойства

Физико-химические свойства препаратов NANOXURIA, включая размер частиц, индекс полидисперсности (PDI), дзета-потенциал (ZP), морфологию и эффективность инкапсуляции (EE), представлены в Таблице 2. Результаты оценки морфологии с помощью ПЭМ и СЭМ, дополненные графиками распределения частиц по размеру и дзета-потенциалу, приведены на Рисунках 1, 2 и 3. Сравнение PDI для различных комбинаций поверхностно-активных веществ представлено на Рисунке 4.

Исследование высвобождения

Исследование высвобождения составов NANOXURIA in vitro было проведено для оценки того, как различия в составе влияют на профиль высвобождения препарата в течение 24 h (Рисунок 5). NX-CS продемонстрировал самое быстрое высвобождение, начиная с 55.90% через 0.5 h и достигая 104.05% через 24 h (значения >100% могут быть следствием экспериментальной вариабельности или полного высвобождения с небольшой переоценкой). Профиль высвобождения показал почти линейный рост от 0.5 до 6 h, за которым следовало плато. NX-CT продемонстрировал самое медленное и контролируемое высвобождение, начиная с 46.18% через 0.5 h и достигая 82.99% через 24 h, с плато в интервале 2–12 h (от 54.51% до 59.38%), за которым последовало последующее увеличение. NX-ST показал промежуточный профиль высвобождения, начиная с 54.05% через 0.5 h, достигая пика 90.63% через 12 h и немного снижаясь до 86.23% через 24 h. В целом, кумулятивное высвобождение следовало порядку: NX-CS > NX-ST > NX-CT. NX-CS и NX-ST характеризовались более выраженным начальным «всплеском» высвобождения, в то время как NX-CT показал замедленное высвобождение. Кинетика высвобождения указала на быстрое высвобождение для NX-CS, пролонгированное высвобождение для NX-CT и двухфазное высвобождение для NX-ST.

Анализ цитотоксичности

Цитотоксичность in vitro препаратов NANOXURIA оценивали на клетках рака молочной железы MCF-7 с помощью МТТ-теста; значения Таблица 3 подробно описывают значения IC₅₀. NX-ST продемонстрировал самую высокую цитотоксичность с расчетным значением IC₅₀ 225 ± 21.47 µg/mL (экстраполировано), что указывает на более высокую противоопухолевую активность. Напротив, NX-CS и NX-CT проявили более низкую цитотоксичность со значениями IC₅₀ более 300 µg/mL. Свободная гидроксимочевина (HU) показала самую низкую цитотоксичность со значением IC₅₀ 722.57 µg/mL. Поскольку значения IC₅₀ для NX-CS и NX-CT были указаны только как превышающие 300 µg/mL, их относительная цитотоксичность по отношению друг к другу и по отношению к свободной HU (722.57 µg/mL) не может быть установлена на основе имеющихся данных; только NX-ST может быть однозначно классифицирован как более цитотоксичный, чем свободная HU. Эти результаты показывают, что составы NLC значительно усиливают противоопухолевую активность HU по сравнению со свободным препаратом.

Статистическая корреляция между физико-химическими параметрами и цитотоксичностью

Все исследованные параметры коррелируют между собой, что показано на Рисунке 6. Статистический анализ выявил значимые различия между NLC, нагруженными HU (NX-ST, NX-CT, NX-CS), по дзета-потенциалу, эффективности инкапсуляции (EE) и цитотоксичности (IC₅₀) [F(2,12) = 6.45, p = 0.014], однако различия по размеру частиц или PDI отсутствовали [F(2,12) = 1.27, p = 0.31]. NX-ST продемонстрировал оптимальную цитотоксичность при умеренном уровне EE, в то время как NX-CS и NX-CT характеризовались более высоким EE, но более слабой цитотоксичностью. Значения IC50, превышающие верхний предел диапазона тестируемых концентраций (>300 µg/mL), для эксплораторного корреляционного анализа были приняты равными 300 µg/mL. Эксплораторный корреляционный анализ Спирмена показал положительную связь между дзета-потенциалом и IC₅₀ (ρ = 0.866, p = 0.333). Таким образом, составы с менее отрицательным дзета-потенциалом имели тенденцию к более высоким значениям IC₅₀, тогда как состав NX-ST с более отрицательным зарядом проявил большую цитотоксическую активность.

Изучение стабильности

Стабильность размера частиц

При 25 °C размер частиц всех составов NANOXURIA увеличивался в течение трехмесячного периода хранения, демонстрируя отчетливые тенденции (Рисунок 7). NX-ST (110 nm через 1 месяц) оставался относительно стабильным в течение первых двух месяцев (106.4 nm), но к третьему месяцу его размер увеличился до 150.6 nm. NX-CT, имевший начальный размер 91.9 nm, показал постепенный рост до 102.2 nm за два месяца, после чего последовал резкий скачок до 168.3 nm к третьему месяцу. NX-CS продемонстрировал наибольшие изменения, увеличившись с начальных 67.3 nm до 171.06 nm к третьему месяцу. В целом, во всех составах при 25 °C наблюдался рост размера частиц, при этом степень увеличения следовала порядку: NX-CS > NX-CT > NX-ST.

При 4 °C препараты NANOXURIA продемонстрировали более высокую стабильность по сравнению с 25 °C, при этом за трехмесячный период хранения наблюдалось менее значительное увеличение размера частиц (Рисунок 7). NX-ST сохранял относительную стабильность: размер частиц составлял 110 nm через один месяц, 102 nm через два месяца и 120.96 nm через три месяца. Для NX-CT наблюдалось постепенное увеличение размера частиц от 91.9 nm через один месяц до 116.7 nm через два месяца и 128.5 nm через три месяца. NX-CS продемонстрировал наименьшие колебания: размер увеличился с 67.3 nm изначально до 74.75 nm через два месяца и 89.3 nm через три месяца. В целом, рост размера частиц при 4 °C соответствовал тенденции: NX-CT > NX-ST > NX-CS, что указывает на повышенную стабильность в условиях охлаждения.

Стабильность PDI

При 25 °C индекс полидисперсности (PDI) составов NANOXURIA демонстрировал различные тенденции в течение трехмесячного периода хранения (Рисунок 8). Для NX-ST значения PDI оставались относительно стабильными на протяжении всего исследования, что указывает на постоянное распределение частиц по размеру. Для NX-CT наблюдался рост PDI во второй месяц (0,342), за которым последовало снижение до 0,248 к третьему месяцу. NX-CS продемонстрировал прогрессивное увеличение PDI с течением времени, что свидетельствует о постепенной потере однородности размеров частиц. В целом, NX-ST продемонстрировал наиболее стабильное распределение, NX-CT показал временную вариабельность, а NX-CS проявил нарастающую неоднородность.

При 4 °C значения PDI составов NANOXURIA демонстрировали различные тенденции в течение трехмесячного периода хранения (Рисунок 8). NX-ST демонстрировал относительно стабильные значения PDI, которые снизились с 0,347 через один месяц до 0,269 через два месяца, после чего последовал небольшой рост до 0,349 через три месяца. Для NX-CT наблюдалось прогрессивное увеличение PDI с 0,221 через один месяц до 0,331 через три месяца, что указывает на постепенную потерю однородности частиц. NX-CS также показал тенденцию к росту PDI с течением времени, что свидетельствует о снижении гомогенности. В целом, NX-ST сохранял наиболее стабильное распределение, в то время как NX-CT и NX-CS демонстрировали нарастающую гетерогенность.

Стабильность дзета-потенциала

При 25 °C дзета-потенциал (ЗП) составов NANOXURIA демонстрировал выраженные тенденции в течение трехмесячного периода хранения (Рисунок 9). Для NX-ST исходный ЗП через один месяц составил −46,43 mV, который снизился до −39,37 mV через два месяца и увеличился до −52,33 mV к третьему месяцу. NX-CT показал постепенное увеличение отрицательного заряда, изменившись с −30,76 mV через один месяц до −35,66 mV через два месяца и −37,13 mV через три месяца. NX-CS продемонстрировал рост отрицательного значения ЗП с −30,03 mV изначально до −39,6 mV через два месяца и −52,47 mV через три месяца. В целом, во всех составах наблюдалось снижение значений ЗП с течением времени, при этом NX-ST и NX-CS демонстрировали более высокие значения по модулю, чем NX-CT.

При 4 °C дзета-потенциал (ZP) составов NANOXURIA демонстрировал отчетливые тенденции в течение трехмесячного периода хранения (Рисунок 9). NX-ST сохранял стабильно высокие отрицательные значения ZP на протяжении всего исследования. Для NX-CT наблюдалось постепенное увеличение отрицательного заряда ZP: от −30.76 mV в начале до еще более отрицательных значений к третьему месяцу. NX-CS показал небольшое снижение отрицательного заряда ZP — с −30.03 mV изначально до −28.8 mV через три месяца.

Доступность данных:

Данные, подтверждающие результаты этого исследования, представлены в статье. Необработанные наборы данных, полученные и проанализированные в ходе данного исследования, доступны в дополнительном файле

figure-results-1
Рисунок 1: Морфологическая и физико-химическая характеристика NX-ST. (A) Изображение, полученное с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). (B) Изображение, полученное с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). (C) Распределение частиц по размеру (108.3 nm; PDI = 0.336) (n = 1). (D) Распределение дзета-потенциала (−48.8 mV) (n = 1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Морфологическая и физико-химическая характеристика NX-CT. (A) Снимок СЭМ. (B) Снимок ПЭМ. (C) Распределение частиц по размеру (91.87 nm; PDI = 0.235) (n = 1). (D) Распределение дзета-потенциала (−31.3 mV) (n = 1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3Морфологическая и физико-химическая характеристика NX-CS. (A) СЭМ-изображение. (B) ПЭМ-изображение. (C) Распределение частиц по размерам (74,72 нм; PDI = 0,244) (n = 1). (D) Распределение дзета-потенциала (−36,8 мВ) (n = 1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4: Сравнение PDI составов NANOXURIA с различными комбинациями поверхностно-активных веществ. Приведены значения PDI для составов NX-ST, NX-CT и NX-CS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-5
Рисунок 5: Высвобождение гидроксимочевины in vitro из формуляций NANOXURIA. Показано кумулятивное высвобождение гидроксимочевины из NX-CS, NX-CT и NX-ST в течение 24 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-6
Рисунок 6: Сравнение физико-химических параметров и цитотоксичности составов NANOXURIA.Лепестковая диаграмма, сравнивающая размер частиц, PDI, дзета-потенциал (ZP), эффективность инкапсуляции (EE) и IC₅₀ для NX-ST, NX-CS и NX-CT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот рисунок в большем размере.

figure-results-7
Рисунок 7: Влияние температуры и продолжительности хранения на размер частиц NANOXURIA. (A) Размер частиц при хранении при 25 °C. (B) Размер частиц при хранении при 4 °C. (C) Сравнение размера частиц при 4 °C и 25 °C через 2 и 3 месяца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-8
Рисунок 8: Влияние температуры и продолжительности хранения на PDI NANOXURIA. (A) PDI при хранении при 25 °C. (B) PDI при хранении при 4 °C. (C) Сравнение PDI при 4 °C и 25 °C через 2 и 3 месяца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-9
Рисунок 9: Влияние температуры и продолжительности хранения на дзета-потенциал NANOXURIA. (A) Дзета-потенциал при хранении при 25 °C. (B) Дзета-потенциал при хранении при 4 °C. (C) Сравнение дзета-потенциала при 4 °C и 25 °C через 2 и 3 месяца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

СоставыTween-80 (µL)*Додецилсульфат натрия (ДСН) (мг)Кремофор EL (µL)#
NX-ST50100-
NX-КТ50-100
NX-CS-50100
Плотность (г/мл) = (1,07*, 1,05#)

Таблица 1: Состав поверхностно-активных веществ в препаратах NANOXURIA. Для приготовления составов NX-ST, NX-CT и NX-CS использовались определенные количества Tween-80, додецилсульфата натрия (SDS) и Cremophor EL.

СоставыРазмер частиц (d, нм) (n = 3) (± СКО)PDI (n = 3) (± СО)ZP (мВ) (n = 3) (± СКО) ЭЭ (%) (n = 3) (± СКО)
NX-ST110 ± 1.9970.347 ± 0.011-46.433 ± 8.40478.189 ± 3.49
NX-CT91.947 ± 0.2150.221 ± 0.015-30.767 ± 0.47384.638 ± 5.0
NX-CS67.377 ± 7.1580.302 ± 0.091-30.033 ± 5.86286.626 ± 4.676

Таблица 2: Физико-химическая характеристика составов NANOXURIA. Размер частиц, индекс полидисперсности (PDI), дзета-потенциал (ZP) и эффективность инкапсуляции (EE) для NX-ST, NX-CT и NX-CS при 25 °C. Данные представлены как среднее значение ± SD (n = 3).

РецептурыИЦ50 (µg/mL)ИЦ (иммунохроматографический анализ)50 (µM)
NX-ST225 ± 21.472960
NX-CS>300-
NX-КТ>300-
HU722.579500

Таблица 3: Цитотоксичность составов NANOXURIA и свободного гидроксимочевины in vitro. Значения IC₅₀ для NX-ST, NX-CS, NX-CT и свободной гидроксимочевины (HU) в отношении клеток MCF-7, выраженные в µg/mL и µM.

Дополнительный файл 1: Необработанные данные и расчеты для характеристики наноструктурированных липидных носителей, нагруженных гидроксимочевиной. Файл содержит основные экспериментальные данные и расчеты для составов NX-ST, NX-CT и NX-CS, включая размер частиц, индекс полидисперсности, дзета-потенциал, эффективность инкапсуляции, измерения высвобождения препарата и анализы сравнения составов.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Предлагаемый подход и основные результаты

В настоящем исследовании препарат NANOXURIA был разработан с использованием метода горячей гомогенизации. В качестве твердого липида использовали стеариновую кислоту, при этом температуру приготовления поддерживали на уровне примерно 70 °C, что близко к точке плавления стеариновой кислоты (~69.3 °C); это обеспечивало полное плавление липидов и эффективную гомогенизацию при минимизации избыточного термического воздействия на HU и ПАВ22. Системы ПАВ подбирались на основе их гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ), биосовместимости и пригодности для получения НЛК. Предварительные испытания составов проводились для определения концентраций ПАВ, обеспечивающих получение стабильных нанодисперсий с малым размером частиц и низким PDI, при этом избегались чрезмерные концентрации, которые могли бы отрицательно повлиять на стабильность или цитосовместимость. Перед анализом размера частиц составы надлежащим образом разбавляли водой высокой степени очистки, чтобы минимизировать эффекты многократного рассеяния, которые могут препятствовать точному определению размера и распределения частиц по размерам23.

Три состава, NX-ST, NX-CT и NX-CS, различались главным образом по составу поверхностно-активных веществ (ПАВ). NX-ST содержал T80 и SDS, NX-CT содержал Cremophor EL и T80, а NX-CS содержал Cremophor EL и SDS. Такая стратегия разработки позволила оценить влияние неионогенных и ионогенных ПАВ, а также их концентраций на физико-химические характеристики NLC, нагруженных HU. Результаты показали явные различия в размере частиц, PDI, ZP, EE, профиле высвобождения препарата и цитотоксичности между составами, что указывает на то, что выбор ПАВ является важным определяющим фактором эффективности NLC.

Размер частиц существенно различался между составами (p < 0,05) в следующем порядке: NX-CS < NX-CT < NX-ST. Размер частиц является важным определяющим фактором эффективности наноносителей, поскольку более мелкие частицы могут обеспечивать большую площадь поверхности и влиять на стабильность дисперсии, клеточные взаимодействия, биораспределение и характер высвобождения лекарственного вещества24,25. В составе NX-CS были получены самые мелкие частицы, что может быть связано с высокой эмульгирующей способностью Cremophor EL в сочетании с умеренной концентрацией SDS. Cremophor EL может способствовать образованию более мелких капель за счет снижения межфазного натяжения, в то время как SDS обеспечивает электростатическую стабилизацию. Более низкая концентрация SDS, использованная в NX-CS по сравнению с NX-ST, могла обеспечить достаточную межфазную стабилизацию, не вызывая чрезмерных межфазных эффектов, характерных для более высокой концентрации SDS26,27,28.

NX-CT обеспечил промежуточный размер частиц. Комбинация Cremophor EL и T80 предоставляет два неионогенных ПАВ с взаимодополняющими свойствами межфазной и стерической стабилизации. Cremophor EL способствует эффективному эмульгированию, в то время как T80 может формировать стерический барьер вокруг частиц и снижать их коалесценцию29,30,31. Отсутствие ионного ПАВ также позволяет избежать сильных взаимодействий, опосредованных зарядом, в процессе формирования частиц. Напротив, NX-ST продемонстрировал наибольший размер частиц. Хотя SDS является сильным эмульгирующим ПАВ, его относительно высокая концентрация в NX-ST могла изменить состояние межфазной среды и характер роста частиц. T80 обеспечивает стерическую стабилизацию, однако комбинированный эффект T80 и более высокой концентрации SDS мог привести к менее благоприятному балансу между эмульгированием и стабилизацией, чем тот, который был достигнут в NX-CS.

Исследования морфологии дополнительно подтвердили формирование наноразмерных липидных носителей. СЭМ и ПЭМ показали преимущественно сферические или близкие к сферическим частицы, при этом наблюдаемая морфология в целом соответствовала размерам частиц, определенным методом DLS. Различия между микроскопическими измерениями и данными DLS ожидаемы, поскольку СЭМ исследует высушенные частицы, тогда как DLS измеряет гидродинамический диаметр частиц вместе с ассоциированными с ними гидратирующими и ПАВ-слоями. Таким образом, совокупные результаты микроскопии и DLS подтверждают успешное формирование наноразмерных систем NLC.

PDI предоставил дополнительную информацию об однородности популяций частиц. NX-CT продемонстрировал самое узкое распределение частиц по размерам, в то время как NX-ST показал самое высокое среднее значение PDI. NX-CS имел промежуточное среднее значение PDI, но большую вариабельность между повторными измерениями. В частности, значения повторов для NX-CS указывают на то, что данная рецептура характеризовалась большей вариабельностью, чем NX-ST и NX-CT. Общая тенденция PDI была следующей: NX-CT < NX-CS < NX-ST, хотя зарегистрированная разница не была статистически значимой (p > 0.05). Относительно низкий PDI для NX-CT может быть связан с комбинированной стерической стабилизацией, обеспечиваемой Cremophor EL и T80. Оба ПАВ являются неионогенными и могут стабилизировать поверхность раздела фаз частиц, не создавая сильных электростатических взаимодействий. Cremophor EL способствует эмульгированию, в то время как T80 обеспечивает стерическую защиту, что потенциально способствует формированию более гомогенной популяции частиц32,33. Более высокий PDI для NX-ST может отражать влияние более высокой концентрации SDS. SDS обеспечивает электростатическое отталкивание, однако изменения концентрации ПАВ также могут изменять мицеллообразование и организацию межфазного слоя, что потенциально способствует неоднородности размеров частиц34,35,36. NX-CS продемонстрировал промежуточное значение PDI, что согласуется с комбинированным действием Cremophor EL и более низкой концентрации SDS37.

Составы также различались по поверхностному заряду. NX-ST демонстрировал наиболее высокий отрицательный ZP, что согласуется с наличием более высокой концентрации SDS, за ним следовали NX-CT и NX-CS. Более высокий отрицательный поверхностный заряд систем, содержащих SDS, ожидаем, поскольку SDS является анионным поверхностно-активным веществом. Таким образом, значения ZP указывают на то, что SDS внес существенный вклад в поверхностный заряд NLC, тогда как неионные ПАВ в основном обеспечивали стерическую стабилизацию. Тренд ZP был следующим: NX-ST > NX-CT > NX-CS (p < 0.05). Однако эти различия не следует приписывать исключительно составу ПАВ, так как остаточное количество свободного ПАВ, ионная сила и изменения в организации липидов и ПАВ также могут влиять на измеренный ZP38,39,40.

Эффективность инкапсуляции дополнительно продемонстрировала влияние состава на удерживание HU. Все рецептуры показали относительно высокую EE (>75%), что свидетельствует об успешном включении HU в системы NLC. Самая высокая EE наблюдалась у NX-CS, за которым следовали NX-CT и NX-ST, при этом между рецептурами наблюдались значимые различия (p < 0.05). Cremophor EL мог способствовать эффективной стабилизации межфазной поверхности и удерживанию препарата, в то время как умеренная концентрация SDS в NX-CS могла обеспечить дополнительную стабилизацию без потенциально деструктивных эффектов, связанных с более высокой концентрацией SDS в NX-ST41,42,43. Тем не менее, поскольку HU является гидрофильным, маловероятно, что он полностью растворяется в липидном матриксе. Вместо этого HU может присутствовать в виде тонкодисперсного препарата, ассоциированного с границей раздела липид-вода, или располагаться внутри несовершенного липидного матрикса и богатой сурфактантом межфазной области.

Профили высвобождения продемонстрировали зависимость от состава формуляции: кумулятивное высвобождение HU через 24 h происходило в следующем порядке: NX-CS > NX-ST > NX-CT . NX-CS характеризовался относительно быстрым высвобождением с начальным резким выбросом с последующим выходом на плато, что соответствует кинетике, близкой к первому порядку, тогда как NX-CT показал самое медленное и контролируемое высвобождение, приближенное к кинетике, близкой к нулевому порядку; NX-ST продемонстрировал промежуточный бифазный профиль высвобождения. Вероятно, высвобождение определяется диффузией HU с поверхности частиц и из обогащенного ПАВ межфазного слоя с последующей более медленной диффузией инкапсулированного препарата через липидный матрикс. Более быстрое высвобождение из NX-CS может быть связано с меньшим размером частиц, большей площадью поверхности и комбинированным действием Cremophor EL и SDS, при этом SDS увеличивает гидрофильность межфазного слоя, а Cremophor EL способствует сольватации препарата. Напротив, сочетание Cremophor EL и T80 в NX-CT может обеспечивать более стабильный межфазный барьер, ограничивающий начальную диффузию препарата и обеспечивающий более пролонгированное высвобождение, в то время как NX-ST показал промежуточный бифазный характер, обусловленный противоположным влиянием облегчающего высвобождение SDS и стабилизирующего T80. Данные интерпретации согласуются с предполагаемой ролью ПАВ в модулировании взаимодействий между липидным матриксом и средой высвобождения41,44,45,46,47,48. Вода использовалась в качестве среды высвобождения для установления базовых характеристик диффузии, однако она не воспроизводит ионный состав и физиологические условия биологических жидкостей. Электролиты, присутствующие в физиологических буферах, могут изменять электрический двойной слой, организацию ПАВ, агрегацию частиц и проницаемость мембран, что потенциально может модифицировать кинетику высвобождения.

Результаты анализа цитотоксичности продемонстрировали явное различие между свободным HU и составами NLC, при этом свободный HU с наиболее высоким значением IC₅₀ и NX-ST, проявивший наибольшую цитотоксическую активность. Более низкое значение IC50₅₀ значения, полученные для составов НЛК, указывают на то, что включение HU в липидный носитель изменило его активность in vitro в отношении клеток MCF-7. Особенно сильный ответ NX-ST может отражать комбинированный вклад его система ПАВ SDS/T80, относительно высокий отрицательный ζ-потенциал и промежуточный профиль двухфазного высвобождения, которые в совокупности могут влиять на доступность препарата на границе раздела с клетками и временную экспозицию клеток по отношению к высвобожденному HU49,50Интересно, что меньший размер частиц и более высокая эффективность инкапсуляции (EE) NX-CS не привели к увеличению цитотоксичности. Это подчеркивает, что размер частиц и степень захвата препарата сами по себе не определяют биологическую активность; скорее, на ответ может совместно влиять совокупность таких факторов, как клеточные взаимодействия, характер высвобождения препарата, действие сурфактантов и доступность препарата.51,52,53Таким образом, более низкую цитотоксичность NX-CT и NX-CS по сравнению с NX-ST не следует интерпретировать просто как худшие характеристики состава, тем более что NX-CT продемонстрировал наиболее контролируемое высвобождение.

Исследование стабильности при хранении продемонстрировало хорошую физическую стабильность, так как в любой из формуляций на протяжении всего периода хранения не наблюдалось видимой агломерации, седиментации, расслоения фаз, изменения цвета, вязкости или текстуры, а также отсутствовал аномальный или прогорклый запах. Однако данные о физико-химической стабильности представили более дифференцированную картину. При 25 °C увеличение размера частиц и/или PDI указывало на прогрессирующие изменения в коллоидных системах, при этом степень и статистическая значимость этих изменений варьировались в зависимости от состава формуляции. NX-ST выиграл за счет сильного электростатического вклада SDS, в то время как NX-CT, стабильность которого в основном обеспечивалась стерическим действием Cremophor EL и T80, проявил большую подверженность изменениям характеристик частиц. NX-CS, несмотря на сочетание электростатической и стерической стабилизации, также демонстрировал изменения при хранении, что указывает на то, что наличие двух механизмов стабилизации не предотвращает полностью зависящую от времени структурную перестройку системы NLC. Хранение при 4 °C в целом обеспечивало лучшую физико-химическую сохранность, что согласуется со снижением молекулярной подвижности и более медленными структурными изменениями липидов; NX-CS показал сравнительно более высокую стабильность размера частиц, в то время как NX-ST сохранял относительно неизменные характеристики. Тем не менее, в NX-CT продолжались прогрессирующие изменения PDI, что указывает на то, что одной стерической стабилизации может быть недостаточно для длительного хранения. Изменения ZP в процессе хранения дополнительно свидетельствуют о зависящей от времени реорганизации интерфейса «липид-сурфактант», что может быть связано с десорбцией сурфактанта, рекристаллизацией липидов и структурными изменениями, связанными с HU, которые не были установлены напрямую47,48,54. 

Развитие области

Ранее было показано, что препараты на основе НЛК с другими противоопухолевыми средствами, включая гефитиниб, капецитабин и иматиниб, обеспечивают более эффективную доставку по сравнению со свободным лекарственным веществом14,15,16, однако сравнительные данные о том, как различные комбинации ПАВ влияют на физико-химический и цитотоксический профиль НЛК, нагруженных конкретно гидроксимочевиной, были ограничены43,44,55. Путем систематического сравнения трех систем ПАВ в рамках одной платформы НЛК в данной работе приводится прямое внутреннее контролируемое сравнение, разъясняющее, как ионный характер и концентрация ПАВ совместно влияют на размер частиц, коллоидную стабильность, удержание препарата и противоопухолевую активность in vitro для небольшого высокогидрофильного лекарственного вещества — комбинации, которая менее представлена в литературе по НЛК, чем липофильные нагрузки51,54,56,57. Эти результаты расширяют данные предыдущих отчетов об инкапсуляции HU в наноносители на основе липидов и альбумина53,58, выявляя пару ПАВ (T80–SDS), которая обеспечивает наибольшее усиление цитотоксичности in vitro.

Ограничения исследования

Данное исследование имеет несколько ограничений, которые следует учитывать при интерпретации полученных результатов. Во-первых, биологическая оценка была ограничена одним тестом MTT in vitro на клетках рака молочной железы MCF-7; несмотря на то, что HU применяется в клинической практике при хроническом миелолейкозе и серповидноклеточной анемии, представленные данные не позволяют сделать выводы, специфичные для этих состояний, и требуется подтверждение на соответствующей модели лейкоза (например, на клетках K562) и in vivo. Во-вторых, предложенные объяснения механизмов наблюдаемых физико-химических и цитотоксических различий (например, десорбция ПАВ, рекристаллизация липидов, изменение клеточного захвата) не были продемонстрированы напрямую и должны рассматриваться как гипотезы; для их обоснования потребовались бы такие методы, как DSC, XRD и Cryo-TEM23,41, наряду с исследованиями кинетики клеточного захвата и высвобождения. В-третьих, высвобождение in vitro оценивали в воде, а не в физиологическом буфере, что считается важным этапом для прогнозирования поведения препарата in vivo59. В-четвертых, химическая стабильность HU в процессе приготовления не была количественно определена, а специальная оценка утечки лекарственного вещества в водную фазу при хранении не проводилась; учитывая высокую растворимость HU в воде, такая утечка возможна и должна быть изучена. Наконец, данная лекарственная форма предназначена для парентерального введения, и предложенные здесь интерпретации механизмов следует рассматривать как предварительные до проведения дальнейшей характеризации, что согласуется с более широкой литературой по NLC, подчеркивающей необходимость строгой физико-химической валидации32.

Альтернативные подходы

Несколько альтернативных стратегий характеризации и валидации могли бы усилить будущие исследования в этой области. Методы анализа твердого тела (например, DSC, XRD) и криоэлектронная микроскопия (cryo-TEM) помогли бы уточнить физическое состояние HU в липидной матрице и напрямую проверить механизмы десорбции ПАВ и рекристаллизации липидов, предложенные для объяснения наблюдаемых тенденций стабильности36,60,61. Тестирование высвобождения в физиологическом буфере или имитированных биологических жидкостях, а не только в воде, позволило бы точнее предсказать поведение высвобождения in vivo, а прямая количественная оценка клеточного захвата (например, с помощью флуоресцентного мечения и проточной цитометрии) позволила бы проверить объяснение повышенной цитотоксичности NX-ST, основанное на захвате, вместо того чтобы делать выводы только на основании дзета-потенциала62,63,64. Подтверждающее тестирование на второй, клинически значимой клеточной линии (например, K562 для хронического миелолейкоза) и оценка в формальных условиях ускоренной стабильности дополнительно помогли бы перенести настоящие результаты in vitro на создание клинически применимой лекарственной формы.

Значимость и потенциальные области применения

Эти результаты имеют значение для более широких усилий по улучшению доставки гидроксимочевины, клиническое применение которой в настоящее время ограничено быстрым клиренсом, вариабельной биодоступностью и дозозависимой токсичностью. Продемонстрировав, что состав поверхностно-активных веществ можно настраивать для получения либо более мелких, более стабильных частиц с более высокой эффективностью инкапсуляции (NX-CS, NX-CT), либо частиц с более высокой цитотоксической активностью in vitro (NX-ST)41,65, данная работа создает практическую основу для выбора или дальнейшей оптимизации состава NLC в соответствии с параметром доставки, приоритетным для конкретного применения, без модификации самой молекулы HU. Регулируемые платформы наноносителей такого типа могут быть применимы и к другим малым гидрофильным лекарственным препаратам, имеющим аналогичные ограничения по доставке.

Перспективы дальнейших исследований

В дальнейших работах следует уделить приоритетное внимание количественной валидации предложенных здесь физико-химических механизмов с помощью методов твердотельного анализа и визуализации; тестированию высвобождения лекарственного вещества в физиологически релевантных условиях; прямому измерению клеточного захвата и его связи с цитотоксичностью; тестированию на дополнительных, клинически значимых клеточных линиях и, в конечном итоге, на моделях in vivo; проведению формальных исследований ускоренной и долгосрочной стабильности для определения срока годности; а также количественной оценке химической стабильности HU и утечки при хранении. Решение этих вопросов поможет установить, трансформируются ли выявленные физико-химические преимущества в значимый терапевтический эффект.

Выводы

В данной работе решаются основные проблемы терапии HU, включая низкую эффективность доставки из-за быстрого клиренса, вариабельную биодоступность и дозозависимую токсичность, путем разработки наноструктурированных липидных носителей (NANOXURIA). Результаты показывают, что состав поверхностно-активных веществ и условия хранения оказывают критическое влияние на физико-химическую стабильность, цитотоксическую активность и общую эффективность доставки. Среди протестированных составов NX-ST продемонстрировал наилучшие результаты: его цитотоксическая активность в 3,2 раза превышала активность свободного HU, что указывает на усиление клеточного захвата и доставки препарата. Столь высокая эффективность обусловлена сбалансированными характеристиками частиц, контролируемым высвобождением и эффективной электростатической стабилизацией.

Напротив, составы, основанные преимущественно на неионогенных поверхностно-активных веществах, продемонстрировали сравнительно более низкую стабильность и эффективность, что подчеркивает важность комбинированных механизмов стабилизации. Условия хранения существенно влияли на поведение составов: при 25 °C наблюдался рост частиц и неоднородность, тогда как при 4 °C лучше сохранялись стабильность, однородность и поверхностный заряд.

В целом, данное исследование восполняет выявленный пробел в знаниях, демонстрируя, что рационально разработанные системы NLC могут улучшить доставку HU без модификации самого препарата. Результаты подчеркивают, что оптимальные комбинации липидов и сурфактантов, а также соответствующие условия хранения необходимы для создания стабильных, эффективных и клинически значимых систем доставки лекарственных средств.

Раскрытие информации

Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Авторы выражают благодарность Деканату последипломного образования и научных исследований Университета Джазана за финансирование данной исследовательской работы в рамках проекта номер: JU-RSP2026. Авторы также выражают искреннюю благодарность фармацевтическому колледжу Университета Джазана (Джазан, Саудовская Аравия) за предоставление необходимых ресурсов, способствовавших успешному завершению данного проекта.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Центрифужный фильтр Amicon Ultra-2 mL (MWCO 3 kDa)Millipore, IrelandUFC200324
Медная сетка с углеродным покрытием (подложка для образцов ПЭМ)N/A
Кремофор EL (неионогенное ПАВ, производное касторового масла, чистота ≥98%)MedChemExpress, NJ, USAHY-Y1890
Диализные мешки (MWCO 12-14 kDa)Spectrum Laboratories, CA, USA08-670-3BB
Диметилсульфоксид (DMSO)Fisher Chemicals, UK10162090
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Gibco, Paisley, UK10270-106
Полевой эмиссионный сканирующий электронный микроскоп (FE-SEM), Apreo 2Thermo Fisher-FEI, USA1229000
Гомогенизатор, HG 15DWiseTis, GermanyDH.WHG02020
Гидроксимочевина (HU) (чистота ≥99%)Sudair Pharma, Riyadh, Saudi Arabia21L001
Линия клеток рака молочной железы человека MCF-7American Type Culture Collection (ATCC), USAHTB-22
Считыватель микропланшетов, SpectroStar NanoBMG LABTECH, Ortenberg, Germany601-101
МТТ-реагент (5 mg/mL)Invitrogen Corporation, San Diego, CA, USAM6494
Раствор пенициллина-стрептомицинаSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAP4333
Среда RPMI 1640Gibco, Grand Island, NY, USA11875093
Кунжутное маслоLocal merchant, Jazan, Saudi ArabiaN/A
Додецилсульфат натрия (SDS) (анионное ПАВ, чистота 90%)PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany28312
Стеариновая кислота (чистота 95-106%)Himedia, Mumbai, IndiaGRM1425
Шприцевой фильтр (0.45 µm)Merck, SASLHV033RS
Просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ), TalosThermo Fisher, USAN/A
Tween-80 (T80) (неионогенное ПАВ, содержание олеиновой кислоты ≥58%)Loba Chemie, Mumbai, IndiaArt. No. 06420
УФ-видимый спектрофотометрShimadzu, Kyoto, Japan220-92961-01
Zetasizer Nano ZS90Malvern Panalytical, Malvern, UKZEN3690

Ссылки

  1. Kushwaha AK, et al. A descriptive cross-sectional study on clinical epidemiology of different types of cancer in a tertiary care centre: insights from Eastern India. Cureus. 2024;16(6):e62529.
  2. National Cancer Institute. Cancer statistics. 2024. Available from: https://www.cancer.gov/about-cancer/understanding/statistics
  3. Bai X, et al. Sustained drug release from smart nanoparticles in cancer therapy: a comprehensive review. Micromachines. 2022;13(10):1623.
  4. Rajendra PKM, Balan AP, Selvaraj J, Jawahar N. Formulation and optimization of hydroxyurea loaded nanostructured lipid carriers using design of experiment for the effective treatment of ovarian cancer. Int J Appl Pharm. 2022;14(5):137-43.
  5. Bell V, Varzakas T, Psaltopoulou T, Fernandes T. Sickle cell disease update: new treatments and challenging nutritional interventions. Nutrients. 2024;16(2):258.
  6. Ware RE. How I use hydroxyurea to treat young patients with sickle cell anemia. Blood. 2010;115(26):5300-11.
  7. Lanzkron S, et al. Systematic review: hydroxyurea for the treatment of adults with sickle cell disease. Ann Intern Med. 2008;148(12):939-55.
  8. Pouton CW, Porter CJH. Formulation of lipid-based delivery systems for oral administration: materials, methods and strategies. Adv Drug Deliv Rev. 2008;60(6):625-37.
  9. Khan MS, et al. Potential of lipid-based nanocarriers against two major barriers to drug delivery-skin and blood-brain barrier. Membranes. 2023;13(3):343.
  10. Alam MI, et al. Nanostructured lipid carrier containing CNS acting drug: formulation, optimization and evaluation. Curr Nanosci. 2011;7(6):1014-27.
  11. Azhar SNAS, Ashari SE, Zainuddin N, Hassan M. Nanostructured lipid carriers-hydrogels system for drug delivery: nanohybrid technology perspective. Molecules. 2022;27(1):289.
  12. Haider M, Abdin SM, Kamal L, Orive G. Nanostructured lipid carriers for delivery of chemotherapeutics: a review. Pharmaceutics. 2020;12(3):288.
  13. Müller RH, Radtke M, Wissing SA. Nanostructured lipid matrices for improved microencapsulation of drugs. Int J Pharm. 2002;242(1-2):121-8.
  14. Makeen HA, et al. Preparation, characterization, and anti-cancer activity of nanostructured lipid carriers containing imatinib. Pharmaceutics. 2021;13(7):1086.
  15. Makeen HA, et al. Gefitinib loaded nanostructured lipid carriers: characterization, evaluation and anti-human colon cancer activity in vitro. Drug Deliv. 2020;27(1):622-31.
  16. Sultan MH, et al. Capecitabine-loaded NLC for breast cancer treatment: preparation, characterization, and in vitro evaluation. Curr Drug Deliv. 2025;22(7):968-82.
  17. Coache D, et al. Stability evaluation of compounded hydroxyurea 100 mg/mL oral liquids using a novel analytical method involving chemical derivatization. PLoS One. 2022;17(6):e0270206.
  18. Yasir MS, et al. Microemulsified gel formulations for topical delivery of clotrimazole: structural and in vitro evaluation. Langmuir. 2021;37(46):13767-77.
  19. Siddique MY, et al. Formulation of gelled microemulsion for effective permeation of celecoxib across the skin barrier. ChemistrySelect. 2024;9(3):e202302841.
  20. Naseem K, et al. Enzymes encapsulated smart polymer micro assemblies and their tuned multi-functionalities: a critical review. Int J Polym Mater Polym Biomater. 2024;73(9):785-816.
  21. Syam S, Abdelwahab SI, Al-Mamary MA, Mohan S. Synthesis of chalcones with anticancer activities. Molecules. 2012;17(6):6179-95.
  22. Lide DR. CRC handbook of chemistry and physics. CRC Press; Boca Raton, FL; 2009.
  23. Pei Y, Hinchliffe BA, Minelli C. Measurement of the size distribution of multimodal colloidal systems by laser diffraction. ACS Omega. 2021;6(22):14049-58.
  24. Mok ZH. The effect of particle size on drug bioavailability in various parts of the body. Pharm Sci Adv. 2024;2:100031.
  25. Zhang M, et al. Influencing factors and strategies of enhancing nanoparticles into tumors in vivo. Acta Pharm Sin B. 2021;11(8):2265-85. doi:10.1016/j.apsb.2021.03.033.
  26. Zhang Y, et al. Sodium dodecyl sulfate improved stability and transdermal delivery of salidroside-encapsulated niosomes via effects on zeta potential. Int J Pharm. 2020;580:119183.
  27. Westesen K, Bunjes H, Koch MHJ. Physicochemical characterization of lipid nanoparticles and evaluation of their drug loading capacity and sustained release potential. J Control Release. 1997;48(2-3):223-36.
  28. Bjørnestad VA, Lund R. Pathways of membrane solubilization: a structural study of model lipid vesicles exposed to classical detergents. Langmuir. 2023;39(11):3914-33.
  29. Rao VRS, Shao J. Self-nanoemulsifying drug delivery systems (SNEDDS) for oral delivery of protein drugs. Int J Pharm. 2008;362(1-2):2-9.
  30. Weiszhár Z, et al. Complement activation by polyethoxylated pharmaceutical surfactants: Cremophor-EL, Tween-80 and Tween-20. Eur J Pharm Sci. 2012;45(4):492-8.
  31. Khan ZU, et al. Physicochemical characterizations and pharmacokinetic evaluation of pentazocine solid lipid nanoparticles against inflammatory pain model. Pharmaceutics. 2022;14(2):409.
  32. Beloqui A, et al. Nanostructured lipid carriers: promising drug delivery systems for future clinics. Nanomedicine. 2016;12(1):143-61.
  33. Samari-Kermani M, Jafari S, Rahnama M, Raoof A. Ionic strength and zeta potential effects on colloid transport and retention processes. Colloid Interface Sci Commun. 2021;42:100389.
  34. Duplâtre G, Ferreira Marques MF, Da Graça Miguel M. Size of sodium dodecyl sulfate micelles in aqueous solutions as studied by positron annihilation lifetime spectroscopy. J Phys Chem. 1996;100(41):16608-12.
  35. Hanafy AS, Farid RM, ElGamal SS. Complexation as an approach to entrap cationic drugs into cationic nanoparticles administered intranasally for Alzheimer’s disease management: preparation and detection in rat brain. Drug Dev Ind Pharm. 2015;41(12):2055-68.
  36. Witayaudom P, Klinkesorn U. Effect of surfactant concentration and solidification temperature on the characteristics and stability of nanostructured lipid carrier prepared from rambutan kernel fat. J Colloid Interface Sci. 2017;505:1082-92.
  37. Öztürk K, Kaplan M, Çalış S. Effects of nanoparticle size, shape, and zeta potential on drug delivery. Int J Pharm. 2024;666:124799.
  38. Lavagna, E., Bochicchio, D., De Marco, A.L., Güven, Z.P., Stellacci, F. and Rossi, G., 2022. Ion-bridges and lipids drive aggregation of same-charge nanoparticles on lipid membranes. Nanoscale, 14.(18), pp.6912-6921.
  39. Ye J, et al. Comparative colloidal stability of commercial amphotericin B nanoformulations using dynamic and static multiple light scattering techniques. Int J Nanomedicine. 2022;17:6047-64.
  40. Honary S, Zahir F. Effect of zeta potential on the properties of nano-drug delivery systems-a review (Part 2). Trop J Pharm Res. 2013;12(2):265-73.
  41. Doktorovova S, Souto EB, Silva AM. Nanotoxicology applied to solid lipid nanoparticles and nanostructured lipid carriers-a systematic review of in vitro data. Eur J Pharm Biopharm. 2014;87(1):1-18.
  42. Bnyan R, et al. Surfactant effects on lipid-based vesicles properties. J Pharm Sci. 2018;107(5):1237-46.
  43. Adepu S, Ramakrishna S. Controlled drug delivery systems: current status and future directions. Molecules. 2021;26(19):5905.
  44. Müller RH, Mäder K, Gohla S. Solid lipid nanoparticles for controlled drug delivery-a review of the state of the art. Eur J Pharm Biopharm. 2000;50(1):161-77.
  45. Das S, et al. Formulation design, preparation and physicochemical characterizations of solid lipid nanoparticles containing a hydrophobic drug: effects of process variables. Colloids Surf B Biointerfaces. 2011;88(1):483-9.
  46. Naseri N, Valizadeh H, Zakeri-Milani P. Solid lipid nanoparticles and nanostructured lipid carriers: structure, preparation and application. Adv Pharm Bull. 2015;5(3):305-13.
  47. Pardeike J, Hommoss A, Müller RH. Lipid nanoparticles in cosmetic and pharmaceutical dermal products. Int J Pharm. 2009;366(1-2):170-84.
  48. Chauhan I, et al. Nanostructured lipid carriers: a groundbreaking approach for transdermal drug delivery. Adv Pharm Bull. 2020;10(2):150-65.
  49. Ali A, et al. Solid lipid-based nanoparticular system for sustained release and enhanced in vitro cytotoxic effect of 5-fluorouracil on skin melanoma and squamous cell carcinoma. PLoS One. 2023;18(2):e0281004.
  50. Miyazawa T, et al. A critical review of the use of surfactant-coated nanoparticles in nanomedicine and food nanotechnology. Int J Nanomedicine. 2021;16:3937-99.
  51. Garg J, Pathania K, Sah SP, Pawar SV. Nanostructured lipid carriers: a promising drug carrier for targeting brain tumors. Future J Pharm Sci. 2022;8(1):25.
  52. Raza F, et al. Recent advances in the targeted delivery of paclitaxel nanomedicine for cancer therapy. Mater Adv. 2022;3(5):2268-90.
  53. Alam MI, et al. Determining the anticancer effect of gefitinib-loaded NLCs through investigating the inflammatory cytokine (JAK-STAT) pathway. Res J Pharm Technol. 2024;17(11):4968-74.
  54. Akbari A, et al. Development and characterization of nanoliposomal hydroxyurea against BT-474 breast cancer cells. Adv Pharm Bull. 2020;10(1):39-45.
  55. Iqbal MA, et al. Nanostructured lipid carriers system: recent advances in drug delivery. J Drug Target. 2012;20(10):813-30.
  56. Heeney MM, et al. Chemical and functional analysis of hydroxyurea oral solutions. J Pediatr Hematol Oncol. 2004;26(3):179-84.
  57. Santos SS, Dos Santos IG, Da Silva CV, Cazedey ECL. Qualitative analysis of hydroxyurea. Drug Anal Res. 2020;4(1):18-21.
  58. Tazhbayev Y, Mukashev O, Burkeev M, Kreuter J. Hydroxyurea-loaded albumin nanoparticles: preparation, characterization, and in vitro studies. Pharmaceutics. 2019;11(8):410.
  59. Sato H, Yamada K, Miyake M, Onoue S. Recent advancements in the development of nanocarriers for mucosal drug delivery systems to control oral absorption. Pharmaceutics. 2023;15(12):2708.
  60. Mehnert W, Mäder K. Solid lipid nanoparticles: production, characterization and applications. Adv Drug Deliv Rev. 2001;47(2-3):165-96.
  61. Danaei M, et al. Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of lipidic nanocarrier systems. Pharmaceutics. 2018;10(2):57.
  62. Fröhlich E. The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles. Int J Nanomedicine. 2012;7:5577-91.
  63. Zhang W, et al. Effects of morphology and size of nanoscale drug carriers on cellular uptake and internalization process: a review. RSC Adv. 2023;13(1):80-114.
  64. Wang HX, et al. Surface charge critically affects tumor penetration and therapeutic efficacy of cancer nanomedicines. Nano Today. 2016;11(2):133-44.
  65. Musielak E, Feliczak-Guzik A, Nowak I. Optimization of the conditions of solid lipid nanoparticles synthesis. Molecules. 2022;27(7):2202.

Перепечатки и разрешения

Теги

Доставка гидроксимочевиныэффективность инкапсуляцииразмер частицдзета-потенциалкомбинации поверхностно-активных веществпротивоопухолевая активностьклеточный захват
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.