Нефропротекторное действие N-ацетилцистеина и монтелукаста при применении после введения контрастного вещества на модели острого повреждения почек, индуцированного контрастным веществом, у крыс

Краткое содержание

В данном протоколе представлена модель острого повреждения почек у крыс, вызванного введением контрастного вещества, и оценивается эффективность последующего введения N-ацетилцистеина и монтелукаста по отдельности и в комбинации. Режимы лечения были связаны с менее выраженной почечной дисфункцией, окислительным стрессом, воспалением и гистопатологическими повреждениями, хотя комбинированная терапия не демонстрировала стабильного превосходства над монотерапией.

Аннотация

Контраст-индуцированное острое повреждение почек (КИ-ОПП) является серьезным осложнением при использовании йодсодержащих контрастных веществ, при котором окислительный стресс и воспалительные процессы способствуют повреждению почек. В данном исследовании была создана экспериментальная модель КИ-ОПП на крысах и изучены эффекты терапии, начатой после введения контрастного вещества, с использованием N-ацетилцистеина (NAC), монтелукаста или их комбинации. Взрослые самцы крыс линии Wistar подвергались ограничению в воде с последующим последовательным внутривенным введением Nω-нитро-L-аргинин-метилового эфира (L-NAME), индометацина и иогексола. Терапию начинали через 1 h после завершения введения иогексола (примерно через 1,5 h после введения L-NAME) и продолжали один раз в сутки в течение 3 последовательных дней. Были оценены показатели функции почек, параметры окислительного стресса, воспалительные цитокины, биомаркеры повреждения почек и гистопатология почек. В группе КИ-ОПП без лечения наблюдались выраженная почечная дисфункция, неблагоприятный профиль окислительного стресса и воспаления, а также значительные гистопатологические повреждения. По сравнению с группой КИ-ОПП без лечения, животные, получавшие NAC, монтелукаст или комбинированную терапию, в целом демонстрировали улучшение биохимических и гистопатологических показателей. Уровни глутатиона (GSH) были наиболее высокими, а средние баллы гистопатологического повреждения — количественно самыми низкими в группе комбинированного лечения; однако комбинированная терапия не показала стабильного превосходства над монотерапией по всем оцениваемым параметрам. Данный протокол предоставляет контролируемую доклиническую основу для оценки постконтрастных вмешательств при КИ-ОПП, и полученные результаты обосновывают дальнейшие экспериментальные исследования NAC и монтелукаста, не устанавливая при этом клиническую эффективность или специфическое преимущество комбинации.

Введение

Острое повреждение почек (ОПП) часто осложняет течение заболеваний у госпитализированных пациентов и способствует росту заболеваемости, смертности и затрат ресурсов здравоохранения. Поскольку йодсодержащие контрастные вещества регулярно применяются при диагностической визуализации и интервенционных процедурах, ухудшение функции почек после воздействия контраста стало важной клинической проблемой. Современная номенклатура разграничивает контраст-ассоциированное острое повреждение почек (CA-AKI), которое включает любой эпизод ОПП, возникший после введения контраста, и контраст-индуцированное острое повреждение почек (CI-AKI), при котором повреждение почек причинно связано с воздействием контрастного вещества. В контролируемых экспериментальных моделях, где воздействие контраста может быть напрямую связано с повреждением почек, термин CI-AKI по-прежнему широко используется^1,2.

Пациенты с хронической болезнью почек, сахарным диабетом, пожилым возрастом, сердечной недостаточностью или другими сердечно-сосудистыми сопутствующими заболеваниями особенно подвержены развитию CI-AKI. У многих пораженных пациентов функция почек восстанавливается; однако в более тяжелых случаях могут наблюдаться стойкое нарушение функции почек, необходимость проведения заместительной почечной терапии и повышенный риск летального исхода. CI-AKI также ассоциируется с более длительной госпитализацией и повышенным использованием ресурсов системы здравоохранения. Эти неблагоприятные последствия подчеркивают сохраняющуюся необходимость разработки эффективных профилактических и терапевтических подходов к лечению контраст-индуцированного повреждения почек^1,3,4,5.

Развитие контраст-индуцированной острой почечной недостаточности (CI-AKI) включает несколько взаимосвязанных процессов, в том числе нарушение почечной перфузии, дисбаланс кислорода в мозговом веществе, окислительный стресс, воспаление и прямое токсическое воздействие на канальцы. Воздействие контрастного вещества смещает внутрипочечный сосудистый тонус в сторону вазоконстрикции, одновременно ослабляя вазодилатирующие ответы, что приводит к снижению почечного кровотока. Наружный слой мозгового вещества особенно уязвим, поскольку доступность кислорода в этой области и в физиологических условиях ограничена. Таким образом, дальнейшее снижение доставки кислорода после введения контрастного вещества может спровоцировать гипоксическое повреждение канальцев^2,6,7.

Гипоксия почек после воздействия контрастного вещества сопровождается усилением образования активных форм кислорода (АФК), что вносит существенный вклад в повреждение почек. Когда продукция АФК превышает эндогенную антиоксидантную способность, может развиться окислительное повреждение клеточных липидов, белков и ДНК, при этом одновременно усиливается воспалительная сигнализация. Как в экспериментальных, так и в клинических условиях введение контрастного вещества было связано с повышением параметров окислительного стресса и нарушением антиоксидантной защиты. Молекулярные пути, вовлеченные в этот ответ, включают никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADPH)-оксидаза-зависимое образование радикалов и активацию ядерного фактора каппа-B (NF-κB)^1,6,8,9.

Вклад воспаления указывает на то, что CI-AKI нельзя объяснить одними лишь гемодинамическими нарушениями. Последние данные также свидетельствуют о роли ферроптоза, нитрозативного стресса и внеклеточных ловушек нейтрофилов в повреждении почек после введения контрастного вещества. Распознавание этих дополнительных механизмов расширило спектр молекулярных мишеней, исследуемых для профилактики и лечения CI-AKI¹.

Для диагностики контраст-индуцированной острой почечной недостаточности (CI-AKI) обычно используют уровни креатинина в сыворотке крови и объем выделяемой мочи, однако оба этих показателя могут измениться только после того, как повреждение почек уже развилось. Это ограничение стимулировало поиск более ранних индикаторов, включая молекулу повреждения почек-1 (KIM-1), которая отражает тубулярное повреждение, и цистатин C, связанный с изменениями клубочковой фильтрации. Данные экспериментальных и клинических исследований указывают на то, что изменения этих биомаркеров могут стать заметными на ранней стадии CI-AKI и, следовательно, способствовать более ранней оценке повреждения почек^9,10,11.

Достижения в понимании патофизиологии контраст-индуцированной острой почечной недостаточности (КИ-ОПН) стимулировали изучение фармакологических вмешательств, направленных на окислительные и воспалительные пути. Адекватная гидратация остается основным методом профилактики, в то время как сообщаемые преимущества лекарственных подходов варьировались в различных исследованиях. Следовательно, ни одно фармакологическое лечение еще не продемонстрировало достаточной и стабильной эффективности, чтобы быть принятым в качестве стандартного клинического вмешательства при КИ-ОПН^1,4,12,13.

N-ацетилцистеин (NAC) широко изучался как фармакологический метод ограничения CI-AKI. Его предполагаемые ренопротективные эффекты связаны с нейтрализацией активных форм кислорода и восстановлением запасов глутатиона. Первые клинические данные были получены в ходе знакового исследования пациентов с хронической болезнью почек, в котором NAC снизил частоту возникновения контраст-индуцированной почечной дисфункции¹⁴. Однако последующие клинические испытания и обзоры доказательств дали противоречивые результаты: в одних исследованиях сообщалось о пользе, в то время как в других не было выявлено значимого клинического эффекта. Таким образом, эффективность NAC при CI-AKI остается неопределенной^12,15,16,17.

Монтелукаст селективно блокирует рецептор 1 цистеиниловых лейкотриенов и давно используется для лечения астмы и аллергических заболеваний. Экспериментальные данные также указывают на то, что этот препарат оказывает противовоспалительное, антиоксидантное и антиапоптотическое действие. В различных моделях повреждения почек введение монтелукаста ассоциировалось со снижением перекисного окисления липидов, усилением эндогенной антиоксидантной защиты, менее выраженными гистопатологическими повреждениями и ослаблением поражения почек^{18,19,20,21,22}.

Данные, специально касающиеся применения монтелукаста при CI-AKI, остаются ограниченными. Имеющиеся экспериментальные результаты позволяют предположить, что его почечные эффекты могут быть связаны с модуляцией окислительных и воспалительных сигнальных путей. Снижение экспрессии NADPH-оксидазы 4 (NOX4), p22phox и NF-κB было предложено в качестве одного из механизмов, посредством которых монтелукаст может уменьшать повреждение почек, вызванное контрастированием⁹.

NAC и монтелукаст воздействуют на частично различающиеся, но перекрывающиеся пути, участвующие в повреждении почек. NAC преимущественно поддерживает антиоксидантную защиту, тогда как монтелукаст обладает как противовоспалительным, так и антиоксидантным действием. Таким образом, одновременное введение этих препаратов может влиять на несколько компонентов патофизиологии CI-AKI; однако вопрос о том, вызывает ли их взаимодействие аддитивный или синергетический эффект, в экспериментальных моделях еще не решен^{18,19,20,21,22}.

Предыдущие исследования были преимущественно сосредоточены на оценке вмешательств, проводимых до введения контрастного вещества, в то время как данные о лечении, начатом после экспозиции, остаются ограниченными. В частности, ограниченное внимание в экспериментальных моделях CI-AKI было уделено применению монтелукаста совместно с NAC после введения контраста. Таким образом, в настоящем исследовании оценивалось влияние монтелукаста и NAC, вводимых после экспозиции контрастным веществом как по отдельности, так и в комбинации, на функцию почек, параметры окислительного стресса и антиоксидантную защиту, биомаркеры повреждения почек и воспаления, а также на гистопатологические изменения в крысиной модели CI-AKI.

Протокол

Все экспериментальные процедуры с использованием животных проводились в соответствии с международно признанными рекомендациями по уходу и использованию лабораторных животных и соответствовали руководству по проведению исследований на животных: отчетность об экспериментах In Vivo (ARRIVE). Протокол эксперимента был одобрен Локальным комитетом по этике экспериментов на животных Университета Ahi Evran, Кырышехир, Турция (решение № 2, заседание № 12, дата: 12 июня 2025 г.). Были предприняты все усилия для минимизации страданий животных и сокращения их количества, использованного в ходе исследования. Подробная информация о всех использованных реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

Приготовление химических реагентов

В данном исследовании использовались Nω-нитро-L-аргининметиловый эфир (L-NAME), индометацин, иогексол, монтелукаста натрий и NAC. Раствор L-NAME с концентрацией 10 mg/mL готовили в стерильном 0,9% физиологическом растворе, используя 1 g L-NAME на 100 mL. Раствор готовили непосредственно в день введения и использовали без последующего хранения. Для индукции экспериментальной модели CI-AKI L-NAME вводили внутривенно (IV) в дозе 10 mg/kg. Для крысы весом примерно 220 g расчетное количество составило приблизительно 2,2 mg, что соответствует объему введения около 0,22 mL. Индометацин готовили в 5% растворе бикарбоната натрия с концентрацией 10 mg/mL, растворяя 100 mg в конечном объеме 10 mL. Препарат перемешивали на вортексе до достижения визуальной гомогенности. Конечный pH приготовленного раствора индометацина во время эксперимента не измеряли, поэтому он не мог быть определен ретроспективно. Специфическая процедура стерилизации или фильтрации приготовленного раствора индометацина в экспериментальных записях не была задокументирована и, следовательно, не может быть представлена ретроспективно. Формальный интервал стабильности не устанавливался и не оценивался; раствор готовили непосредственно перед использованием и применяли в тот же день. Для индукции экспериментальной модели CI-AKI индометацин вводили внутривенно в дозе 10 mg/kg. Для крысы весом примерно 220 g расчетное количество составило приблизительно 2,2 mg, что соответствует объему введения около 0,22 mL.

Коммерческий препарат иогексола, содержащий 647 mg иогексола/mL и эквивалентную концентрацию йода 300 mg/mL, вводили без дополнительного разведения. Точная температура иогексола на момент инъекции не регистрировалась. Значение осмоляльности конкретного препарата не удалось достоверно подтвердить по имеющимся экспериментальным записям, поэтому оно не приводится. Для индукции экспериментальной модели CI-AKI иогексол вводили внутривенно в дозе 3 g йода/kg. Для крысы весом примерно 220 g эта доза составила приблизительно 0,66 g йода, что соответствовало объему инъекции около 2,2 mL.

Суспензия монтелукаста натрия была приготовлена в 0,5% карбоксиметилцеллюлозе (CMC). Она готовилась непосредственно в день каждого введения и перемешивалась на вортексе перед дозированием для обеспечения равномерного распределения взвешенных частиц. Доза монтелукаста, необходимая для каждого животного, рассчитывалась отдельно на основании массы тела, зафиксированной в начале исследования, по следующей формуле: необходимая доза (mg) = масса тела (kg) × 10 mg/kg. Для животного весом примерно 220 g расчетная доза составила примерно 2,2 mg и вводилась путем перорального зондирования. Перед каждым введением суспензию подвергали визуальному осмотру, и любой препарат с признаками седиментации повторно перемешивали на вортексе перед использованием.

NAC вводили группам лечения в виде коммерческой формы препарата без дальнейшего разбавления внутрибрюшневно в дозе 100 mg/kg. Для каждого животного необходимая доза рассчитывалась индивидуально на основании массы тела, зафиксированной в начале исследования. Для животного весом примерно 220 g это соответствовало примерно 22 mg NAC и объему введения приблизительно 0.15 mL. Перед введением раствор подвергали визуальному осмотру; использовали только прозрачные препараты без видимых частиц.

Каждый препарат проходил визуальный осмотр перед введением. Растворы L-NAME, индометацина, иогексола и NAC проверяли на наличие изменения цвета и видимых частиц. Непосредственно перед введением суспензию монтелукаста перемешивали на вортексе и визуально проверяли на однородность. Любой препарат, не соответствующий этим критериям приемлемости, не использовался. При подготовке и введении всех химических веществ использовались лабораторные халаты, защитные перчатки и средства защиты глаз. Все процедуры проводились в соответствии с требованиями учреждения по лабораторной и биологической безопасности.

Подбор животных, содержание, экспериментальные группы и рандомизация

Тридцать взрослых самцов белых крыс линии Wistar (возраст 8–12 недель; масса тела 200–220 g) были получены из Лаборатории исследований экспериментальных животных Университета Ахи Эвран, Кырышехир, Турция. Самцы были выбраны для сохранения методологической согласованности с ранее опубликованными экспериментальными моделями CI-AKI и во избежание влияния стадии эстрального цикла как дополнительной биологической переменной. Пол не оценивался как экспериментальная переменная в данном исследовании. Виварий имел лицензию на разведение/производство № 184; крысы разводились и содержались там в стандартных лабораторных условиях. На момент включения в исследование животные не имели документально подтвержденного статуса SPF (без специфических патогенов) или иной формально назначенной микробиологической классификации состояния здоровья. Каждая крыса содержалась отдельно в поликарбонатной клетке размером 40 cm × 25 cm × 20 cm, в качестве подстилки использовалась крупно порубленная сосновая стружка. Параметры помещения поддерживались на уровне 24 °C ± 2 °C и 35% ± 10% относительной влажности автоматизированной системой контроля окружающей среды и вентиляции. Применялся режим освещения 12 ч свет/12 ч темнота, с освещением с 07:00 до 19:00. Специального обогащения среды в течение 7-дневного периода акклиматизации или последующего экспериментального периода не предоставлялось. Стандартный гранулированный корм для грызунов и водопроводная вода были доступны ad libitum, за исключением определенного 16-часового периода лишения воды, предшествующего индукции CI-AKI. Состав корма: 24% сырого белка, 3.94% сырой целлюлозы, 5.08% сырого жира, 8.8% сырой золы, 1.44% лизина, 0.61% метионина, 1.14% кальция, 0.89% фосфора и 0.28% натрия. Все животные проходили акклиматизацию в течение 7 дней до начала экспериментальных процедур. Ежедневные наблюдения проводились как в период акклиматизации, так и в экспериментальный период для оценки общего состояния, потребления корма и воды, подвижности, осанки, внешнего вида шерсти и любых признаков стресса. Для минимизации систематической ошибки отбора животные были распределены по пяти экспериментальным группам с использованием компьютерной программы рандомизации, по шесть животных в каждой группе. Размер выборки был определен с помощью предварительного анализа мощности с использованием G*Power версии 3.1.9.6.

Размер выборки был определен путем априорного анализа мощности для однофакторного дисперсионного анализа с фиксированными эффектами, включающего пять экспериментальных групп. При допущении величины эффекта (f) 0,65, вероятности ошибки первого рода (α) 0,05 и статистической мощности 80%, требуемый общий размер выборки был рассчитан как 30 животных, что соответствует шести животным в группе. Априори предполагалось, что величина эффекта (f = 0,65) представляет собой большой общий межгрупповой эффект для сравнения пяти групп. Расчет был предназначен для определения размера выборки, необходимого для обнаружения такого общего эффекта, и не был специально разработан для выявления меньших попарных различий между группами активного лечения. В качестве экспериментальной единицы для всех анализов рассматривалось отдельное животное.

За исключением рутинного ухода, ежедневного мониторинга состояния здоровья и терминальных процедур, животные в контрольной группе не подвергались манипуляциям или фиксации в рамках протокола, лишению воды, внутривенным или внутрибрюшинным инъекциям, зондовому введению препаратов per os или введению растворителя. Группа CI-AKI включала животных, у которых на 8-й день была создана модель CI-AKI и которые не получали лечения. Группа CI-AKI + Montelukast включала животных, у которых была создана модель CI-AKI и которые впоследствии получали монтелукаст. Группа CI-AKI + NAC включала животных, у которых была создана модель CI-AKI и которые впоследствии получали NAC. Группа CI-AKI + Montelukast + NAC включала животных, у которых была создана модель CI-AKI и которые впоследствии получали комбинацию монтелукаста и NAC. Ни контрольная группа, ни группа CI-AKI без лечения не подвергались имитационным процедурам, соответствующим терапии. В частности, в этих группах не проводились имитационные манипуляции, имитационное зондовое введение, имитационные терапевтические инъекции или введение соответствующего растворителя. Растворителями, использованными для приготовления L-NAME, индометацина и монтелукаста, были 0,9% физиологический раствор, 5% раствор гидрокарбоната натрия и 0,5% CMC соответственно, как описано в разделе приготовления химических веществ. NAC вводили в виде коммерческой формы без дальнейшего разведения; отдельный растворитель для NAC не готовился. На 8-й день все животные, кроме животных контрольной группы, подвергались лишению воды в течение 16 h, после чего последовательно вводили внутривенно L-NAME (10 mg/kg), индометацин (10 mg/kg) и иогексол (3 g йода/kg) для индукции контраст-индуцированного острого повреждения почек. В соответствующих группах лечения монтелукаст (10 mg/kg, зондовое введение per os) и/или NAC (100 mg/kg, внутрибрюшинная инъекция) вводили впервые через 1 h после завершения введения иогексола на 8-й день, что соответствует примерно 1,5 h после введения L-NAME, и в дальнейшем вводили один раз в день в то же время на 9-й и 10-й дни.

Протокол введения препарата

Контраст-индуцированное острое повреждение почек (CI-AKI) было вызвано в соответствии с опубликованным экспериментальным протоколом, который включал 16 ч депривации воды с последующим последовательным внутривенным введением L-NAME, индометацина и йогексола^23,24,25. L-NAME и индометацин вводили в дозе 10 mg/kg каждый, тогда как йогексол вводили в дозе 3 g йода/kg. Терапевтические дозы составили 10 mg/kg для натриевой соли монтелукаста и 100 mg/kg для NAC. Выбор доз для индукции модели и лечения основывался на ранее опубликованных экспериментальных исследованиях^22,26,27. Предварительных исследований по подбору или оптимизации доз не проводилось. Дозы NAC и монтелукаста выбирались независимо на основе ранее опубликованных экспериментальных исследований отдельных препаратов и не были получены в результате исследования по подбору доз для комбинированной терапии. Выбранные дозы не предназначались для обеспечения фармакологически эквипотентного воздействия; анализ зависимости «доза-эффект» или формальный анализ лекарственного взаимодействия не проводились. Для определения успешности индукции модели на уровне отдельного животного не использовались заранее установленные численные или лабораторные пороговые значения. В конечной точке исследования успешное развитие повреждения почек подтверждалось характерными гистопатологическими изменениями, наблюдаемыми в группе CI-AKI без лечения по сравнению с контрольной группой. На 8-й день все животные, кроме контрольной группы, подвергались однократному 16-часовому периоду депривации воды непосредственно перед индукцией контраст-индуцированного острого повреждения почек. Депривация воды не повторялась в течение остального экспериментального периода. Стандартный гранулированный корм оставался доступен ad libitum на протяжении всего периода депривации воды. По завершении однократного 16-часового периода депривации воды доступ к водопроводной воде был восстановлен одновременно и ad libitum для всех экспериментальных групп с депривацией воды перед введением первого агента, индуцирующего модель, L-NAME, и поддерживался до конца экспериментального периода. Время и условия восстановления доступа к воде были идентичны для всех групп с депривацией. Потребление воды после восстановления не ограничивалось заранее определенным объемом и не измерялось количественно. Масса тела непосредственно до и после 16-часового периода депривации воды не измерялась; следовательно, процент потери массы тела, связанный с дегидратацией, не мог быть рассчитан. Диурез не контролировался количественно. После восстановления доступа к воде была инициирована индукция CI-AKI. Все последовательные внутривенные введения L-NAME, индометацина и йогексола осуществлялись через латеральную вену хвоста с использованием иглы 26 G, прикрепленной к стерильному шприцу объемом 5 mL. Перед внутривенным введением хвост прогревали в воде в течение нескольких минут для облегчения визуализации и расширения латеральных вен хвоста. После каждого внутривенного введения вену промывали 0.5 mL стерильного 0.9% физиологического раствора, в дополнение к расчетному объему введения соответствующего агента, индуцирующего модель. Место инъекции визуально контролировали во время введения и промывания на предмет отека, утечки или признаков экстравазации. Сначала вводили L-NAME (10 mg/kg). Через пятнадцать минут после введения L-NAME индометацин (10 mg/kg) вводили внутривенно в ту же латеральную вену хвоста. Через пятнадцать минут после введения индометацина йогексол вводили внутривенно в ту же латеральную вену хвоста в дозе 3 g йода/kg. Для каждого животного доза йогексола и соответствующий объем инъекции рассчитывались индивидуально на основе массы тела, зафиксированной в начале исследования, и коммерческой концентрации йода 300 mg йода/mL. Это соответствовало объему введения 10 mL/kg и, следовательно, примерно 2.0–2.2 mL для крыс весом 200–220 g. Отдельный, определенный протоколом максимально допустимый объем внутривенного введения не устанавливался; наибольшим объемом внутривенного введения одного агента в данном исследовании был йогексол в дозе 10 mL/kg. Йогексол вводили медленно в течение примерно 1–2 мин. Успешность внутривенного введения подтверждалась отсутствием видимого отека, утечки или экстравазации в месте инъекции. Частичной экстравазации не наблюдалось, и ни одна инъекция не потребовала повторной попытки или повторного введения из-за подозрения на экстравазацию. Через один час после завершения введения йогексола группам лечения впервые вводили назначенные препараты. Поскольку введение йогексола начиналось через 30 мин после введения L-NAME и завершалось примерно за 1–2 мин, начало лечения происходило примерно через 91–92 мин (около 1.5 ч) после введения L-NAME. Натриевую соль монтелукаста (10 mg/kg) вводили путем перорального зондирования, в то время как NAC (100 mg/kg) вводили внутрибрюшинно.

Пероральный зонд вводили с помощью стальной кормовой канюли 22 G. Каждое животное удерживали в вертикальном положении, и канюлю осторожно продвигали через пищевод в желудок. При возникновении чрезмерного сопротивления канюлю извлекали и позиционировали заново перед введением препарата. Во время и сразу после зондирования наблюдали за наличием регургитации. Ни у одного животного во время или сразу после зондирования не наблюдалось регургитации или других признаков неполного перорального введения, и ни одно животное не было исключено на основании предполагаемого неудачного перорального введения. Интраперитонеальные инъекции проводили в правый нижний квадрант брюшной полости. Иглу вводили под углом примерно 30°–45°, и перед введением препарата выполняли аспирацию, чтобы убедиться в отсутствии случайного попадания в сосуд. Место инъекции визуально контролировали во время и сразу после введения на предмет утечки, кровотечения или других видимых осложнений. Назначенные препараты вводили один раз в день в одно и то же время в 8-й, 9-й и 10-й дни. Соответственно, животные в группе CI-AKI + Montelukast получали монтелукаст один раз в день в течение трех дней подряд, животные в группе CI-AKI + NAC получали NAC один раз в день в течение трех дней подряд, а животные в группе CI-AKI + Montelukast + NAC получали и монтелукаст, и NAC один раз в день согласно тому же 3-дневному графику лечения. Все процедуры по индукции модели и введению препаратов проводились одним и тем же исследователем. Масса тела измерялась один раз для каждого животного в начале исследования и не переизмерялась в течение экспериментального периода. Для каждого животного доза и соответствующий объем введения всех агентов для индукции модели и исследуемых препаратов рассчитывались индивидуально на основе массы тела, зафиксированной в начале исследования. Все процедуры внутривенного, внутрибрюшинного и перорального введения выполнялись по одной и той же стандартизированной методике для минимизации вариабельности, связанной с введением препаратов.

Процедура эвтаназии, гуманные конечные точки и сбор образцов

Животных наблюдали один раз в день на протяжении всего эксперимента, отслеживая изменения общего состояния, потребление корма и воды, подвижность, позу, вид шерсти и признаки дистресса. Заранее определенные гуманные конечные точки включали выраженную вялость, невозможность доступа к имеющемуся корму или воде или их потребления, отклонения в позе, снижение подвижности, стойкую пилоэрекцию и любые другие явные проявления дистресса. Животные, соответствующие любому из этих критериев, подлежали немедленной эвтаназии; однако в ходе исследования ни одно животное не достигло гуманных конечных точек. На 11-й день, через 24 h после последнего введения препарата, индуцировали глубокую анестезию путем внутрибрюшного введения кетамина (80 mg/kg) совместно с ксилазином (10 mg/kg). Для подтверждения адекватного уровня анестезии использовали отсутствие педального рефлекса. После подтверждения достаточной глубины анестезии у каждого животного путем интракардиальной пункции получали примерно 3–5 mL крови. Затем эвтаназию завершали обескровливанием, пока животное находилось под глубокой анестезией. Смерть подтверждали по отсутствию сердечной деятельности и спонтанного дыхания.

Кровь, взятую для биохимического анализа сыворотки, помещали в пробирки без антикоагулянта и оставляли до полного свертывания. Затем пробирки центрифугировали при 3,000 × g в течение 10–15 мин при 4 °C, после чего фракцию сыворотки отделяли и хранили при −80 °C до проведения анализа. Образцы, предназначенные для измерения уровня глутатиона, собирали отдельно в пробирки, содержащие этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA). Поскольку в этих образцах использовался антикоагулянт, их обрабатывали без стадии свертывания в соответствии с соответствующим протоколом анализа глутатиона. Отделение сыворотки считалось успешным, если полученная сыворотка была прозрачной и не имела видимых признаков гемолиза.

После подтверждения смерти животных выполняли срединную лапаротомию и аккуратно извлекали обе почки из каждого организма. Образцы очищали от окружающей жировой и соединительной тканей. Правую почку резервировали исключительно для гистопатологического исследования, в то время как левую почку использовали для биохимического анализа. Гомогенизированную ткань левой почки анализировали без раздельного выделения коркового и мозгового вещества. С каждой почкой работали независимо, и образцы от разных животных оставались разделенными на протяжении всего процесса обработки без объединения в общий пул. Всю правую почку помещали в 10% нейтральный buffered formaldehyde и обрабатывали для гистопатологической оценки. Срезы, охватывающие корковый слой и наружную часть мозгового вещества почки, готовили и исследовали в соответствии с процедурами, описанными в разделе гистопатологической обработки и оценки. Каждую левую почку маркировали индивидуально и хранили при -80 °C до проведения гомогенизации и биохимического анализа. После иссечения проверяли макроскопическую целостность ткани и убеждались в наличии достаточного количества материала для запланированных гистопатологических и биохимических исследований.

Исследователь, ответственный за индукцию модели и введение препаратов, не мог быть ослеплен, так как экспериментальные группы подвергались различным процедурам. Однако идентификационные данные групп были скрыты от исследователей, проводивших биохимический и статистический анализы, а также от патологоанатома, выполнявшего гистопатологическую оценку. Все включенные животные оставались в исследовании и были задействованы в последующем анализе. Обращение с биологическими образцами, тканями животных, фиксаторами на основе формальдегида и другими химическими отходами осуществлялось с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты. Утилизация всех биологических и химических отходов проводилась в соответствии с требованиями учреждения по биологической безопасности и обращению с опасными отходами.

Биохимические анализы

Биохимические измерения проводили с использованием сыворотки, крови с ЭДТА-антикоагулянтом и гомогенатов тканей левой почки, полученных от каждого животного. Процедуры представлены ниже в зависимости от биологической матрицы, использованной для каждого параметра. В сыворотке анализировали уровни мочевины, азота мочевины крови (BUN), креатинина, активность супероксиддисмутазы (SOD) и концентрацию малонового диальдегида (MDA). Мочевина, BUN и креатинин служили показателями функции почек, в то время как активность SOD и концентрация MDA оценивались как параметры окислительного стресса. Значения мочевины сыворотки и BUN определяли с помощью одного и того же ферментативного метода с использованием уреазы и глутаматдегидрогеназы. При этом методе мочевина гидролизовалась уреазой с образованием аммиака, который затем вступал в реакцию с 2-оксоглутаратом и восстановленным никотинамидадениндинуклеотидом (NADH) в присутствии глутаматдегидрогеназы. Использовался кинетический ферментативный метод с уреазой и глутаматдегидрогеназой. Снижение оптической плотности, вызванное потреблением NADH, измеряли кинетически с помощью спектрофотометра. Концентрацию креатинина в сыворотке измеряли колориметрически на автоматическом биохимическом анализаторе. Активность SOD в сыворотке измеряли колориметрически с использованием коммерчески доступного набора реагентов на том же автоматическом биохимическом анализаторе. Анализ SOD основывался на генерации супероксидных радикалов системой ксантин–ксантиноксидаза и их реакции с 2-(4-йодфенил)-3-(4-нитрофенил)-5-фенилтетразолиум хлоридом с образованием окрашенного продукта — формазана. Конечную оптическую плотность измеряли при 505 nm, а активность SOD выражали в U/mL. Концентрацию MDA в сыворотке определяли колориметрически с помощью реакции с тиобарбитуровой кислотой. Образцы сыворотки смешивали с охлажденной трихлоруксусной кислотой для осаждения белков, после чего полученный осадок отделяли центрифугированием. Центрифугирование проводили при 7,500 × g в течение 5 min при 4 °C. Супернатант подвергали реакции с тиобарбитуровой кислотой при 90 °C в течение 60 min, охлаждали и измеряли при 532 nm. Концентрации MDA рассчитывали по соответствующей калибровочной кривой и выражали в nmol/mL. Анализ глутатиона (GSH) проводили с использованием крови с ЭДТА-антикоагулянтом. Белки осаждали трихлоруксусной кислотой, и полученные депротеинизированные образцы анализировали колориметрически модифицированным методом Эллмана. Образцы объединяли с 5,5′-дитиобис(2-нитробензойной кислотой) (DTNB) в 500 mM Трис-буфере при pH 8.2. Реакция тиольных групп GSH с DTNB приводила к образованию окрашенного продукта, и оптическую плотность регистрировали при 412 nm. Активность каталазы (CAT) определяли с помощью двухэтапной колориметрической процедуры. Образцы сначала инкубировали с известным количеством перекиси водорода, которую каталаза превращала в воду и молекулярный кислород. После прекращения ферментативной реакции остаточное количество перекиси водорода измеряли с помощью хромогенного реагента. Оптическую плотность регистрировали при 405 nm, а активность CAT выражали в U/mL. Для измерений в почечной ткани использовали левую почку каждого животного как смешанную ткань без разделения коркового и мозгового вещества. Как указано в процедуре, правая почка была оставлена исключительно для гистопатологической оценки. Образцы, принадлежащие отдельным животным, обрабатывали независимо и не объединяли ни на одном этапе. Каждый образец левой почки гомогенизировали на льду в 50 mM фосфатном буфере при pH 7.4, используя соотношение ткани к буферу 1:10 (масса/объем). Для каждой крысы готовили один индивидуальный гомогенат почечной ткани. Отдельные аликвоты этого гомогената использовали для различных измерений в почечной ткани, чтобы все параметры были получены от одного и того же животного. Полученные гомогенаты почечной ткани центрифугировали при 14,000 × g в течение 10 min при 4 °C. После центрифугирования супернатанты, полученные от каждого животного, собирали отдельно и разделяли на аликвоты для запланированных анализов почечной ткани. Концентрации фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α), интерлейкина-1 бета (IL-1β), интерлейкина-6 (IL-6), цистатина C и KIM-1 в супернатантах почечной ткани измеряли с помощью наборов для иммуноферментного анализа (ELISA), специфичных для крыс. Анализы проводили согласно протоколам производителя. Условия инкубации были идентичными для ELISA на TNF-α, IL-1β, IL-6, цистатин C и KIM-1. Для каждого анализа образцы и реагенты ELISA инкубировали в течение 1 h при 37 °C; после пяти циклов промывки добавляли растворы субстрата A и B и инкубировали в течение 10 min при 37 °C. Кратко: стандарты и супернатанты почечной ткани добавляли в лунки, предварительно покрытые антителами, затем добавляли соответствующее биотинилированное детектирующее антитело и конъюгат стрептавидин–пероксидаза хрена. После указанных этапов инкубации несвязавшиеся компоненты удаляли с помощью автоматического мойщика микропланшетов. Затем добавляли раствор субстрата и останавливали цветную реакцию кислым стоп-раствором. Оптическую плотность измеряли при 450 nm с помощью считывателя микропланшетов, а концентрации аналитов рассчитывали по соответствующим стандартным кривым. Измерения методом ELISA в почечной ткани проводили в дублетах. Для каждого аналита рассчитывали среднее значение двух технических повторов в лунках, чтобы получить одно значение на уровне животного. Технические повторы в лунках и отдельные аликвоты, полученные из одного и того же индивидуального гомогената, не считались независимыми наблюдениями. Все биохимические измерения проводили в стандартизированных условиях, специфичных для каждого анализа. Образцы сыворотки, крови с ЭДТА-антикоагулянтом и почечной ткани обрабатывали отдельно в соответствии с требованиями соответствующих аналитических методов. Исследователи, проводившие биохимический анализ, не знали о распределении животных по группам. Экспериментальной единицей считалось отдельное животное, а не каждый образец сыворотки, образец крови, образец почки, аликвота гомогената или технический повтор в лунке. Соответственно, в статистический анализ для каждой экспериментальной группы было включено шесть независимых наблюдений на уровне животных.

Гистопатологическая обработка и оценка

Образцы правой почки подготавливали для микроскопического исследования с помощью стандартной гистологической обработки. Всю правую почку каждого животного погружали в 10% нейтральный буферизованный формальдегид на 72 ч при комнатной температуре. После фиксации проводили последовательную дегидратацию тканей в 50%, 70%, 80%, 96% и 100% этаноле, выдерживая в каждой концентрации по 1 ч. Затем образцы подвергали воздействию двух ксилоловых ванн по 30 мин в каждой перед заливкой в парафин. С помощью ротационного микротома из парафиновых блоков изготавливали срезы толщиной 5 µm, включающие как корковое вещество, так и внешнюю часть мозгового вещества почки.

Для окрашивания гематоксилином и эозином (HE) срезы подвергли депарафинизации и регидратации, выдержали в гематоксилине в течение 5 min, после чего промывали под проточной водой еще 5 min. Для дифференцировки использовали кислый спирт, после чего срезы подвергали подкрашиванию в аммиачной воде в течение 1 min и контрастировали эозином в течение 2 min. Окрашенные срезы затем подвергали дегидратации в спиртах возрастающей концентрации, просветляли ксилолом и заключали в перманентный препарат под покровными стеклами.

Срезы, предназначенные для окрашивания трихромом по Массону, аналогичным образом подвергали депарафинизации и регидратации. Обработку протравой проводили в течение 60 min при 56 °C, после чего срезы промывали под проточной водопроводной водой в течение 10 min. Затем срезы последовательно обрабатывали железным гематоксилином по Вайгерту в течение 10 min, раствором анилинового красного и кислого фуксина в течение 15 min, раствором фосфовольфрамовой кислоты в течение 10 min и раствором анилинового синего в течение 10 min. После погружения в 1% раствор уксусной кислоты на 5 min срезы дегидратировали, просветляли в ксилоле и заключали под покровные стекла.

Перед микроскопической оценкой адекватность окрашивания проверяли отдельно для каждого метода. Срезы, окрашенные гематоксилином и эозином (HE), считались подходящими, если ядерные детали и цитоплазматический контраст были четко различимы, в то время как срезы, окрашенные трихромом по Массону, принимались, если структуры соединительной ткани могли быть отчетливо визуализированы. Для каждого животного исследовали три HE-окрашенных среза и три среза, окрашенных трихромом по Массону. В каждом срезе оценивали пять случайно выбранных микроскопических полей с использованием объектива 40×. Таким образом, для каждого животного исследовали по 15 микроскопических полей для каждого метода окрашивания. Все микроскопические исследования проводились с использованием одного и того же объектива и при стандартизированных условиях оценки для всех животных и экспериментальных групп. Срезы, окрашенные трихромом по Массону, оценивали качественно по распределению и отложению интерстициального коллагена, накоплению внеклеточного матрикса и тубулоинтерстициальной архитектуре. Эти срезы не использовались для получения полуколичественных баллов гистопатологического повреждения от 0 до 3. Репрезентативные фотомикрографии окраски HE и трихромом по Массону были получены с помощью объектива 40×, и в каждое репрезентативное изображение была включена масштабная линейка 100 µm. Эти фотомикрографии были получены в иллюстративных целях и не рассматривались как независимые наблюдения при гистопатологическом подсчете баллов или статистическом анализе. Все гистопатологические оценки проводились одним опытным патологом, который не знал принадлежности животных к экспериментальным группам. Использование одного слепого эксперта было направлено на ограничение систематической ошибки оценки и вариабельности, связанной с различиями между наблюдателями. Тубулярный некроз, дилатация канальцев, клеточная дегенерация и сосудистая конгестия оценивались полуколичественно на HE-окрашенных срезах почек в соответствии с системой, адаптированной из ранее опубликованных моделей повреждения почек^28,29. Для каждого параметра баллы варьировали от 0 до 3, что соответствовало отсутствию, легкому, умеренному и тяжелому гистопатологическому повреждению соответственно. Для каждого животного данные пяти микроскопических полей, исследованных в каждом из трех HE-окрашенных срезов (всего 15 полей), рассматривались в совокупности для присвоения одного балла от 0 до 3 по каждому гистопатологическому параметру. Таким образом, для каждого животного был получен один балл для тубулярного некроза, дилатации канальцев, клеточной дегенерации и сосудистой конгестии. Гистологические срезы и микроскопические поля рассматривались как внутриживотные подвыборки и не считались независимыми наблюдениями. В каждом срезе микроскопические поля выбирались случайным образом из сопоставимых областей коркового вещества и наружного мозгового слоя почек для стандартизации анатомического отбора во всех животных и экспериментальных группах. Экспериментальной единицей считалось отдельное животное, а не каждая почка, гистологический срез или микроскопическое поле. Соответственно, в статистический анализ для каждой экспериментальной группы было включено шесть независимых наблюдений на уровне животных. Значения, представленные в Table 3, представляют собой групповые средние, рассчитанные на основе индивидуальных баллов шести животных в каждой экспериментальной группе.

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения для статистического анализа. В качестве экспериментальной единицы для всех видов статистического анализа рассматривали отдельное животное. Каждая экспериментальная группа состояла из шести независимых животных (n = 6 на группу). Технические повторности, лунки анализа, срезы тканей и микроскопические поля не рассматривались как независимые наблюдения и не использовались для увеличения объема статистической выборки. Непрерывные переменные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD). Нормальность распределения оценивали отдельно для каждой экспериментальной группы с помощью критерия Шапиро–Уилка, а однородность дисперсий — с помощью критерия Ливена. С учетом полностью сбалансированного дизайна эксперимента с равным объемом выборок в группах для сравнения групп использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA). Попарные сравнения проводили с помощью апостериорного критерия множественных сравнений Данкана. Потенциальные выбросы оценивали путем графического анализа диаграмм размаха («ящиков с усами») и изучения отдельных наблюдений. Ни одно наблюдение не было расценено как ошибка измерения или недостоверный результат эксперимента, и ни одна точка данных не была исключена по статистическим основаниям. Значение p < 0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Маркеры функции почек в сыворотке (мочевина, азот мочевины крови и креатинин)

Экспериментальный план, распределение животных на группы, график введения препаратов и временная шкала сбора образцов в настоящем исследовании представлены на Рисунке 1. Между группами были выявлены статистически значимые различия по уровням мочевины в сыворотке, азота мочевины в крови (BUN) и креатинина (p = 0.003, p = 0.003 и p = 0.002 соответственно). Средний уровень мочевины в сыворотке составил 67,43 мг/дл ± 53,11 мг/дл в контрольной группе и увеличился до 606,71 мг/дл ± 429,42 мг/дл в группе с контраст-индуцированным острым повреждением почек (CI-AKI). Аналогично, средний уровень BUN возрос с 31,51 мг/дл ± 24,82 мг/дл в контрольной группе до 268,63 мг/дл ± 190,84 мг/дл в группе CI-AKI. Уровни креатинина в сыворотке также значительно повысились — с 0,60 мг/дл ± 0,05 мг/дл в контрольной группе до 3,27 мг/дл ± 2,14 мг/дл в группе CI-AKI. Апостериорный анализ по методу Данкана показал, что уровни мочевины, BUN и креатинина в сыворотке были значительно ниже в каждой из лечебных групп — CI-AKI + Монтелукаст, CI-AKI + NAC и CI-AKI + Монтелукаст + NAC — по сравнению с необработанной группой CI-AKI (во всех случаях p < 0,05). Данные по маркерам функции почек в сыворотке представлены в Таблице 1.

Параметры окислительного стресса и активность антиоксидантных ферментов

Среди групп были выявлены статистически значимые различия по уровням СОД, ГСС, КАТ и МДА (p = 0,044, p = 0,001, p = 0,003 и p = 0,001 соответственно; Таблица 1). Последующий анализ по методу Данкана показал, что уровни ГСС были значительно выше в группах с монтелукастом, НАЦ и комбинированной терапией по сравнению с необработанной группой с КИ-ОПП (все p < 0,05). В группе комбинированного лечения уровень ГСС также был значительно выше, чем в контрольной группе (p < 0,05). Однако статистически значимых различий между группой комбинированного лечения и каждой из групп монотерапии, а также между двумя группами монотерапии не наблюдалось (все p > 0,05). Наименьший уровень СОД был зафиксирован в группе КИ-ОПП (92,23 U/mL ± 16,37 U/mL), тогда как в контрольной группе он составил 147,81 U/mL ± 33,27 U/mL. Уровни ГСС были наименьшими в группе КИ-ОПП (66,05 mmol/L ± 24,72 mmol/L) и наибольшими в группе КИ-ОПП + монтелукаст + НАЦ (172,44 mmol/L ± 60,48 mmol/L). Активность КАТ была наибольшей в контрольной группе (93,35 U/mL ± 18,75 U/mL) и наименьшей в группе КИ-ОПП (33,22 U/mL ± 17,07 U/mL). Что касается уровней МДА, наибольшее значение было зафиксировано в группе КИ-ОПП (54,13 nmol/mL ± 19,37 nmol/mL), тогда как наименьшее значение было зарегистрировано в группе КИ-ОПП + НАЦ (21,53 nmol/mL ± 5,07 nmol/mL). Данные об параметрах окислительного стресса и активности антиоксидантных ферментов представлены в Таблице 1.

Почечные повреждения и воспалительные биомаркеры (KIM-1, цистатин C, ФНО-α, ИЛ-1β и ИЛ-6)

Были выявлены статистически значимые различия между группами по уровню цистатина C почек, ИЛ-6, КИМ-1, ФНО-ααи ИЛ-1β уровни (p < 0.001, p = 0.008, p = 0.027, p = 0,006 и p < 0,001, соответственно; Таблица 2). Сравнения по методу Данкана *post hoc* показали, что цистатин C, ИЛ-6, KIM-1, ФНО-αи ИЛ-1β уровни были значительно ниже в каждой группе лечения, а именно в группах CI-AKI + Montelukast, CI-AKI + NAC и CI-AKI + Montelukast + NAC, по сравнению с необработанной группой CI-AKI (все p < 0,05). Для IL-1β, статистически значимая разница также наблюдалась между группами ИК-ПОЛ + монтелукаст и ИК-ПОЛ + НАЦp < 0,05). Уровень цистатина C в почках был самым высоким в группе с ПИ-ПОТ (18,43 нг/мл ± 1,06 нг/мл), в то время как в контрольной группе было зафиксировано значение 10,30 нг/мл ± 0,78 нг/мл. Аналогично, уровни ИЛ-6 были самыми высокими в группе с ПИ-ПОТ (13,41 нг/л) ± 2,14 нг/л) и наименьшей в контрольной группе (9,29 нг/л) ± 2,70 нг/л). Уровень КИМ-1 был самым высоким в группе с ИП-ПОТ (3,07 нг/мл) ± 0,36 нг/мл) по сравнению с 2,25 нг/мл ± 0,54 нг/мл в группе контроля. Аналогично, ФНО-α уровни были самыми высокими в группе с ИП-ПОП (161,69 нг/л) ± 26,14 нг/л), в то время как самые низкие значения наблюдались в контрольной группе (95,49 нг/л) ± 16,98 нг/л). IL-1β уровни были самыми высокими в группе с ИП-ПОЛ (9,28 нг/мл) ± 0,68 нг/мл), в то время как наименьшее значение было зафиксировано в группе с ХПН-ПОТ + монтелукастом (7,34 нг/мл) ± 0,57 нг/мл). Данные о повреждении почек и маркерах воспаления представлены в Таблица 2Важно отметить, что, хотя некоторые значения биохимических показателей в группе с ИК-ОПП + Монтелукаст + НАЦ были численно выше, чем в группе с ИК-ОПП + Монтелукаст, постхок-сравнения по методу Данкана не выявили статистически значимых различий между этими двумя группами лечения ни по одной из оцениваемых биохимических переменных, включая параметры окислительного стресса, биомаркеры почечного повреждения и биомаркеры воспаления (p > 0.05).

Гистопатологическая оценка

Гистопатологические находки

Срезы почек, окрашенные гематоксилином и эозином, демонстрировали сохранённую почечную архитектуру в группе контроля с нормальной морфологией клубочков и канальцев. Напротив, в группе без лечения при КИ-АКИ наблюдались выраженные гистопатологические изменения, включая повреждение эпителия канальцев, обширную дегенерацию клеток, расширение канальцев, наличие клеточного детрита в просветах канальцев и васкулярный застой. Некротические изменения были особенно заметны в проксимальных сегментах канальцев. В группе КИ-АКИ + монтелукаст тяжесть повреждения канальцев была снижена по сравнению с группой КИ-АКИ без лечения, хотя очаговые дегенеративные изменения оставались заметными. Аналогично, в группе КИ-АКИ + НАК наблюдалось лучшее сохранение целостности эпителия канальцев и меньшее количество некротических участков. При качественном гистопатологическом исследовании архитектура почек в группе КИ-АКИ + монтелукаст + НАК оставалась сохранённой, с в основном сохранными структурами коры и мозгового вещества и относительно ограниченным некрозом канальцев, расширением канальцев, клеточной дегенерацией и васкулярным застоем. Срезы, окрашенные по методу Массона-пикросириусу, показали нормальное распределение интерстициального коллагена в группе контроля. В группе без лечения при КИ-АКИ отмечалось увеличение отложения интерстициального коллагена, дезорганизация тубулоинтерстициальной архитектуры и накопление внеклеточного матрикса. Эти изменения были менее выраженными в группах с лечением, включая группу с комбинированным лечением, по сравнению с группой КИ-АКИ без лечения. Типичные срезы почек, окрашенные гематоксилином и эозином и по методу Массона-пикросириусу, иллюстрирующие эти результаты, представлены на Рисунке 2.

Полу-количественная гистопатологическая оценка

Полуколичественная гистопатологическая оценка показала, что показатели тубулярного некроза, дилатации канальцев, клеточной дегенерации и васкулярной конгестии были наиболее высокими в группе с необработанным ИКАП-ПО. Средние показатели в этой группе составили 2,67, 2,83, 2,67 и 2,50 соответственно. Относительно высокие средние значения, близкие к верхнему пределу шкалы 0–3, соответствовали обширным и тяжелым тубулярным и сосудистым изменениям, выявленным при качественном гистопатологическом исследовании в той же группе. Напротив, все параметры отсутствовали в контрольной группе. Более низкие показатели повреждений наблюдались во всех группах лечения по сравнению с группой необработанного ИКАП-ПО. В группе ИКАП-ПО + монтелукаст средние показатели составили 1,33 для тубулярного некроза, 1,50 — для дилатации канальцев, 1,17 — для клеточной дегенерации и 1,00 — для васкулярной конгестии. Соответствующие значения в группе ИКАП-ПО + НАК составили 1,17, 1,17, 0,83 и 0,83 соответственно. Численно наименьшие средние гистопатологические показатели повреждений были зафиксированы в группе ИКАП-ПО + монтелукаст + НАК, где средние значения составили 0,50, 0,67, 0,50 и 0,17 для тубулярного некроза, дилатации канальцев, клеточной дегенерации и васкулярной конгестии соответственно. Подробные данные гистопатологического балльного анализа представлены в Таблице 3.

Необработанные данные, лежащие в основе всех биохимических и гистопатологических анализов, а также оригинальные неподрезанные гистологические изображения, окрашенные гематоксилином и эозином и по методу Массона, представлены в качестве Дополнительного файла 1.

Рисунок 1: Схема эксперимента и временная шкала исследования. Схематическое изображение экспериментального протокола. Тридцать взрослых самцов крыс линии Вистар после 7-дневного периода акклиматизации были случайным образом распределены на пять групп (n = 6 в каждой группе). Контрольная группа не подвергалась обезвоживанию, индукции КИ-ОПП или лечению. Остальные группы подвергались однократному 16-часовому периоду обезвоживания, за которым последовательно вводили L-NAME (10 мг/кг), индометацин (10 мг/кг) и йогексол (3 г йода/кг) внутривенно для индукции КИ-ОПП. Через один час после введения йогексола соответствующие лечебные группы получали монтелукаст (10 мг/кг, внутрижелудочное введение), НАЦ (100 мг/кг, внутрибрюшинная инъекция) или оба препарата один раз в день в дни 8–10, тогда как группа КИ-ОПП без лечения не получала никакой терапии. У всех групп на 11-й день проводили заключительные процедуры и сбор образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Типичные срезы почек, окрашенные гематоксилином и эозином (HE) и по методу Массона, из экспериментальных групп. Представительные срезы почек, окрашенные гематоксилином и эозином (HE) и по методу Массона, полученные из групп: (A) Контрольной, (B) CI-AKI, (C) CI-AKI + Монтелукаст, (D) CI-AKI + NAC и (E) CI-AKI + Монтелукаст + NAC. Срезы, окрашенные гематоксилином и эозином (верхний ряд), демонстрируют сохранный почечный архитектон в контрольной группе, тогда как в группе CI-AKI наблюдаются выраженный тубулярный некроз (*), расширение канальцев (+), клеточная дегенерация (×) и васкулярный застой (↑). Эти гистопатологические изменения были менее выражены в срезах из групп, получавших лечение, по сравнению с группой CI-AKI без лечения. Срезы, окрашенные по методу Массона (нижний ряд), показывают увеличение отложения интерстициального коллагена и нарушение тубулоинтерстициальной структуры в группе CI-AKI, тогда как эти изменения были менее выраженными в срезах из групп с лечением. Масштабная линейка = 100 µм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Переменная	Контроль	CI-AKI	CI-AKI+M	CI-AKI+NAC	CI-AKI+NAC+M	p
UREA (mg/dL)	67.43±53.11a	606.71±429.42b	105.89±28.63a	243.14±135.99a	293.61±212.05a	0.003
BUN (mg/dL)	31.51±24.82a	268.63±190.84b	51.53±14.69a	129.54±73.54a	108.38±87.36a	0.003
Креатинин (mg/dL)	0.60±0.05a	3.27±2.14b	0.61±0.12a	1.53±1.17a	1.28±0.55a	0.002
SOD (U/mL)	147.81±33.27a	92.23±16.37b	130.96±42.19a	137.87±31.95a	141.71±30.27a	0.044
GSH (mmol/L)	124.29±21.24b	66.05±24.72a	133.87±26.95bc	139.31±30.10bc	172.44±60.48c	0.001
CAT (U/mL)	93.35±18.75c	33.22±17.07a	58.67±32.95ab	52.64±19.97ab	75.46±26.85bc	0.003
MDA (nmol/mL)	23.42±13.48a	54.13±19.37b	22.40±14.81a	21.53±5.07a	37.01±9.29a	0.001
В каждой строке группы, имеющие хотя бы одну общую надстрочную букву, не различались значимо, тогда как группы без общей надстрочной буквы различались значимо по результатам апостериорного теста Данкана (p < 0.05).

Таблица 1: Биохимические показатели и параметры окислительного стресса в экспериментальных группах. Достоверные различия при попарном сравнении: мочевина, ОАМ, креатинин (CREA), СОД и МДА — при сравнении CI-AKI с группой контроля, CI-AKI+M, CI-AKI+NAC и CI-AKI+M+NAC; ГСС — при сравнении CI-AKI со всеми остальными группами и контроля с CI-AKI+M+NAC; КАТ — при сравнении контроля с CI-AKI, CI-AKI+M и CI-AKI+NAC, а также CI-AKI с CI-AKI+M+NAC. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (n = 6) и проанализированы с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим применением теста Дункана. Значения, не имеющие общих надстрочных букв, различаются достоверно (p < 0,05).

Переменная	Контроль	CI-AKI	CI-AKI+M	CI-AKI+NAC	CI-AKI+NAC+M	p
Цистатин C (ng/mL)	10.30±0.78a	18.43±1.06b	10.90±1.13a	11.00±0.59a	11.13±0.84a	<0.001
IL-6 (ng/L)	9.29±2.70a	13.41±2.14b	10.24±0.86a	10.66±0.83a	10.85±1.63a	0.008
KIM-1 (ng/mL)	2.25±0.54a	3.07±0.36b	2.39±0.60a	2.45±0.33a	2.45±0.17a	0.027
TNF-α (ng/L)	95.49±16.98a	161.69±26.14b	110.26±38.12a	119.42±35.35a	127.76±15.13a	0.006
IL-1β (ng/mL)	7.65±0.53ab	9.28±0.68c	7.34±0.57a	8.24±0.73b	8.11±0.72ab	<0.001
В каждой строке группы, имеющие хотя бы одну общую надстрочную букву, не различались значимо, тогда как группы без общих надстрочных букв различались значимо по результатам апостериорного теста Данкана (p < 0,05).

Таблица 2: Уровни биомаркеров повреждения почек и воспаления в экспериментальных группах. Достоверные попарные различия: цистатин C, IL-6, KIM-1 и TNF-α, CI-AKI по сравнению с Control, CI-AKI+M, CI-AKI+NAC и CI-AKI+M+NAC; IL-1β, CI-AKI по сравнению со всеми другими группами и CI-AKI+M по сравнению с CI-AKI+NAC. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (n = 6) и анализировались с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим постхок-тестом Данкана. Значения, не имеющие общих надстрочных букв, различаются достоверно (p < 0,05).

Группы	Тубулярный некроз	Расширение канальцев	Клеточная дегенерация	Сосудистый застой
Контроль	0	0	0	0
CI-AKI	2,67	2,83	2,67	2,5
CI-AKI+M	1,33	1,5	1,17	1
CI-AKI+NAC	1,17	1,17	0,83	0,83
CI-AKI+NAC+M	0,5	0,67	0,5	0,17

Таблица 3: Сравнение параметров гистопатологического повреждения тканей почек в экспериментальных группах. Полуколичественные гистопатологические показатели повреждения на основе окрашивания гематоксилином и эозином представлены как средние значения по группам (n = 6 животных в группе). Оценки выставлялись по шкале: 0 (отсутствие повреждения), 1 (незначительное), 2 (умеренное) и 3 (тяжелое повреждение), при этом более высокие баллы указывают на более выраженные гистопатологические изменения.

Дополнительный файл 1: Данные, подтверждающие результаты данного исследования. Нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

В данном экспериментальном исследовании CI-AKI оценивалось воздействие терапии монтелукастом, NAC или их комбинацией после введения контрастного вещества по показателям функции почек, параметрам окислительного стресса, воспалительным реакциям, биомаркерам повреждения почек и гистопатологическим результатам. Воздействие контрастного вещества привело к существенному повышению уровней мочевины в сыворотке крови, азота мочевины крови (BUN) и креатинина, что сопровождалось неблагоприятными изменениями параметров окислительного стресса и воспалительных биомаркеров. Повышение уровней KIM-1 и цистатина C предоставило дополнительные доказательства повреждения почек.

Лечение монтелукастом, NAC или их комбинацией после введения контраста было связано с благоприятными изменениями по нескольким оцениваемым параметрам. Однако комбинация не показала стабильного превосходства над монотерапией монтелукастом по биохимическим показателям. В совокупности эти наблюдения согласуются с участием окислительного стресса и воспаления в развитии CI-AKI и позволяют предположить, что вмешательства, воздействующие на эти процессы, могут уменьшить повреждение почек, хотя лежащие в их основе сигнальные пути в данном исследовании не изучались напрямую^1,30.

Выраженное повышение уровней мочевины в сыворотке крови, азота по мочевине (BUN) и креатинина после введения контрастного вещества подтверждает успешную индукцию почечной дисфункции в данной экспериментальной модели CI-AKI. Воздействие контрастного вещества может нарушить функцию почек посредством совокупности процессов, включающих интраренальную вазоконстрикцию, гипоксию мозгового вещества, окислительное повреждение и повреждение тубулярных клеток. Результирующее снижение почечной перфузии и клубочковой фильтрации может ограничить выведение азотистых продуктов распада, тем самым увеличивая их концентрацию в кровотоке. Изменения функции почек, наблюдаемые в группе CI-AKI без лечения, согласуются с данными, представленными в предыдущих экспериментальных исследованиях^1,30,31,32.

В группе животных с нелеченым CI-AKI наблюдалась значительная внутригрупповая вариабельность уровней мочевины в сыворотке крови и азота по мочевине крови (BUN), о чем свидетельствуют относительно большие стандартные отклонения. Такой разброс может отражать индивидуальные биологические различия в восприимчивости к протоколу индуцирования сенсибилизированного CI-AKI, включая вариабельность почечного ответа на депривацию воды, ингибирование путей оксида азота и простагландинов, а также воздействие контрастного вещества. Незначительные различия в функциональном резерве почек и физиологических реакциях животных также могли способствовать гетерогенности степени тяжести почечного повреждения. Следовательно, большие стандартные отклонения следует интерпретировать как свидетельство существенной биологической вариабельности в данной экспериментальной модели, а не как ошибку измерения. Тем не менее, учитывая малое количество животных в каждой группе, к характеристикам распределения и величине различий, связанных с лечением, следует относиться с осторожностью.

В настоящем исследовании уровни мочевины в сыворотке крови, азота по мочевине крови (BUN) и креатинина были численно ниже в группе, получавшей NAC, чем в группе CI-AKI без лечения, что согласуется с возможным ослаблением почечной дисфункции. NAC был детально изучен при CI-AKI, однако сообщаемые данные о его влиянии на функцию почек различались в разных исследованиях^14,15,16,17. Предполагаемые механизмы включают поглощение активных форм кислорода, поддержку синтеза глутатиона и ограничение окислительного повреждения в тканях почек¹. Таким образом, профиль функции почек, наблюдаемый после лечения NAC, может быть связан с его антиоксидантными свойствами, хотя этот механизм не изучался непосредственно в данном исследовании.

В настоящем исследовании уровни мочевины в сыворотке крови, азота мочевины по крови (BUN) и креатинина в группе, получавшей монтелукаст, были численно ниже, чем в группе CI-AKI без лечения, что указывает на возможное ослабление почечной дисфункции. В предыдущих экспериментальных исследованиях, в том числе при изучении CI-AKI, также сообщалось о более низких уровнях креатинина и мочевины в сыворотке крови после введения монтелукаста^9,18,19. В группе комбинированной терапии показатели функции почек также были численно ниже, чем в группе CI-AKI без лечения. Однако уровни мочевины, BUN и креатинина были численно ниже при монотерапии монтелукастом, чем при комбинированном лечении, и апостериорные сравнения по тесту Данкана не выявили статистически значимых различий между этими двумя группами (p > 0.05). Таким образом, комбинированная терапия не продемонстрировала превосходства над монотерапией монтелукастом по данным маркерам функции почек.

Окислительное повреждение считается важным фактором патофизиологии CI-AKI. Гипоксия мозгового вещества, вызванная воздействием контрастного вещества, способствует избыточной генерации ROS, что может привести к повреждению клеточных липидов и митохондрий, повреждению эпителиальных клеток канальцев и усилению воспалительной сигнализации^1,12,30.

В группе с нелеченым CI-AKI наблюдалась самая высокая концентрация MDA, а также самые низкие уровни активности SOD и CAT и самый низкий уровень GSH, что указывает на дисбаланс между окислительной нагрузкой и антиоксидантной защитой после воздействия контрастного вещества. Схожие показатели, характеризующиеся повышенным уровнем MDA в сочетании со сниженной антиоксидантной способностью, были зарегистрированы и в других экспериментальных моделях CI-AKI^18,19. Эти результаты согласуются с тем, что окислительный стресс способствует развитию и прогрессированию повреждения почек, а не является исключительно вторичным последствием^1,30.

По сравнению с группой CI-AKI без лечения, в группах, получавших NAC и монтелукаст, в целом наблюдались более низкие значения MDA наряду с более высокими значениями SOD, GSH и CAT, что соответствует картине ослабления окислительного повреждения. Предполагаемое антиоксидантное действие NAC включает нейтрализацию активных форм кислорода и поддержание доступности внутриклеточного глутатиона^1,14. Монтелукаст также может ограничивать окислительное повреждение почек посредством механизмов, выходящих за рамки блокады рецепторов цистеинильных лейкотриенов, включая подавление окислительных реакций в тканях почек^18,33. В предыдущих исследованиях повреждения почек, включая модели CI-AKI, аналогичным образом сообщалось о снижении перекисного окисления липидов и улучшении антиоксидантной защиты после лечения монтелукастом^9,19,27. Хотя благоприятные параметры окислительного стресса также наблюдались в группе комбинированной терапии, комбинированное лечение не демонстрировало стабильного превосходства над каждой из монотерапий. Соответственно, эти результаты не подтверждают наличие аддитивного или синергического антиоксидантного эффекта при совместном применении NAC и монтелукаста.

Данные о уровнях KIM-1 и цистатина C предоставили взаимодополняющие доказательства повреждения почек после введения контрастного вещества. KIM-1 связан преимущественно с повреждением тубулярного эпителия, в то время как цистатин C используется в качестве индикатора изменений, связанных с почечной фильтрацией и повреждением; оба этих показателя оценивались как ранние биомаркеры в экспериментальных моделях контраст-индуцированной острой недостаточности почек (CI-AKI)^1,10. В группе CI-AKI без лечения самые высокие уровни обоих биомаркеров сопровождались выраженным ухудшением стандартных параметров функции почек. Эта закономерность согласуется с результатами предыдущих экспериментальных исследований, в которых сообщалось о повышении уровней KIM-1 и цистатина C после контраст-индуцированного повреждения почек^1,10.

По сравнению с группой CI-AKI без лечения, в группах, получавших терапию, наблюдались более низкие значения KIM-1 и цистатина С, что соответствует ослаблению повреждения почек. Этот профиль биомаркеров соответствовал численно более низким концентрациям мочевины и креатинина в сыворотке крови, наблюдаемым после лечения. Предыдущие экспериментальные исследования связывали введение монтелукаста со снижением экспрессии KIM-1, менее выраженным повреждением канальцев и сохранением функции почек при CI-AKI и других моделях повреждения почек^9,18,19. NAC аналогичным образом ассоциировался с более благоприятными профилями биомаркеров острого повреждения почек, потенциально за счет ограничения клеточного повреждения, связанного с окислительным стрессом^14,15,16,17. Однако между группой комбинированной терапии и группой монотерапии монтелукастом не было обнаружено статистически значимых различий в уровнях KIM-1 или цистатина С (p > 0.05). Соответственно, настоящие результаты не демонстрируют дополнительного преимущества комбинированной терапии с точки зрения биомаркеров.

Окислительный ответ и воспалительные реакции могут взаимно усиливать друг друга при CI-AKI. Избыток ROS может стимулировать провоспалительную сигнализацию с последующим повышением уровней TNF-α, IL-1β и IL-6, что потенциально усиливает повреждение почечной ткани^1,12,13,30.

В группе CI-AKI без лечения наблюдались самые высокие концентрации TNF-α, IL-1β и IL-6, что подтверждает наличие воспалительного ответа после воздействия контрастного вещества. В экспериментальных моделях CI-AKI повышение уровней этих цитокинов связывают с повреждением канальцев, инфильтрацией воспалительных клеток и нарушением функции почек^10,12,13. Профиль воспалительных цитокинов, наблюдаемый в данном исследовании, согласуется с предыдущими экспериментальными данными, полученными после введения контрастного вещества¹.

В группах, получавших NAC и монтелукаст, наблюдались более низкие уровни TNF-α, IL-1β и IL-6 по сравнению с группой CI-AKI без лечения, что согласуется с ослаблением воспалительного ответа. Предполагаемая противовоспалительная активность NAC может быть частично обусловлена снижением окислительной нагрузки и последующим ограничением продукции провоспалительных цитокинов^{1,14,15,16,17}. Монтелукаст может влиять на экспрессию цитокинов посредством блокады рецепторов цистеиниловых лейкотриенов, а также модуляции других воспалительных сигнальных процессов^18,33. Исследования экспериментального повреждения почек также связали применение монтелукаста со снижением сигналинга, связанного с NF-κB, и противовоспалительной активностью^9,19,27. Соответственно, профиль цитокинов, наблюдаемый в данном исследовании, согласуется с модуляцией воспалительных процессов с участием таких путей, как NF-κB и инфламмасома NLRP3 (NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3). Однако уровни NF-κB, NLRP3 и NOX4 не измерялись напрямую; следовательно, данные по биомаркерам предоставляют лишь косвенные подтверждающие доказательства и не позволяют установить специфическую активацию или ингибирование данных путей.

Значения провоспалительных цитокинов были ниже в группе комбинированной терапии, чем в группе CI-AKI без лечения, однако комбинированная терапия не приводила к стабильному снижению показателей по сравнению с применением одного только монтелукаста. Между группами CI-AKI + Montelukast и CI-AKI + Montelukast + NAC не было обнаружено статистически значимых различий по уровням TNF-α, IL-1β или IL-6 (p > 0.05). Таким образом, полученные результаты не подтверждают, что добавление NAC к монтелукасту дает дополнительный противовоспалительный эффект.

Гистопатологическая оценка дополнительно продемонстрировала, что введение контрастного вещества привело к значительным структурным повреждениям почек. Результаты, свидетельствующие о некрозе канальцев, дилатации канальцев, дегенерации клеток и сосудистом полнокровии, наблюдаемые в группе CI-AKI, представляют собой характерные гистопатологические признаки CI-AKI и связаны с нарушением почечной перфузии, окислительным стрессом и повреждением клеток канальцев^1,12,18,19. Вместе с биохимическими данными эти гистопатологические изменения подтверждают, что введение контрастного вещества вызвало существенное повреждение почечной ткани. Более низкая степень гистопатологического повреждения, наблюдавшаяся в группах, получавших монтелукаст и NAC, позволяет предположить, что эти препараты могут оказывать защитное действие на ткани почек. Примечательно, что в группе комбинированной терапии наблюдались количественно самые низкие показатели гистопатологического повреждения среди всех групп лечения. Кроме того, качественная оценка срезов, окрашенных трихромом по Массону, показала менее выраженное отложение интерстициального коллагена и лучшую сохранность тубулоинтерстициальной архитектуры в группах лечения по сравнению с группой CI-AKI без лечения. Учитывая короткий период наблюдения и качественный характер оценки окрашивания трихромом по Массону, эти результаты следует интерпретировать как свидетельство лучшей сохранности структуры в исследуемый момент времени, а не как доказательство изменения долгосрочного ремоделирования внеклеточного матрикса.

Полуколичественная гистопатологическая оценка соответствовала качественным наблюдениям: во всех группах лечения наблюдались более низкие показатели степени повреждения по сравнению с группой CI-AKI без лечения. Хотя в комбинированной группе количественно наблюдались самые низкие показатели гистопатологического повреждения, этот результат не сопровождался последовательным превосходством по биохимическим показателям. Таким образом, благоприятные гистопатологические результаты, отмеченные при комбинированном лечении, не следует интерпретировать как доказательство аддитивного или синергического эффекта в рамках данного дизайна исследования. Аналогичным образом, в предыдущих исследованиях на экспериментальных моделях CI-AKI и других форм острого повреждения почек сообщалось, что подавление окислительного стресса и воспаления снижает гистопатологические повреждения и способствует сохранению целостности канальцев^9,18,19,27.

Было отмечено явное расхождение между биохимическими и гистопатологическими данными. Хотя несколько биохимических показателей в группе монотерапии монтелукастом были численно более благоприятными, чем в группе комбинированной терапии, эти различия не были статистически значимыми. Напротив, в группе комбинированной терапии наблюдались самые низкие числовые показатели степени гистопатологического повреждения. Такая частичная диссоциация может отражать различия в биологических процессах и временных профилях, фиксируемых двумя подходами к оценке. Гистопатологическое исследование напрямую оценивает локальные клеточные и структурные повреждения в ткани почек и, следовательно, может выявить сохранность тканей на исследуемом временном отрезке даже в тех случаях, когда сывороточные маркеры функции почек и другие биохимические показатели не улучшились в той же степени. В свою очередь, биохимические результаты дают косвенные функциональные или молекулярные данные и могут зависеть от функционального резерва почек, компенсаторных механизмов, индивидуальной биологической вариабельности животных и времени сбора образцов. Поскольку все конечные точки оценивались в одной терминальной временной точке, структурная сохранность и биохимическое восстановление могли быть не синхронизированы. Соответственно, более благоприятная гистопатологическая картина в группе комбинированной терапии должна интерпретироваться как различие между методами оценки, а не как доказательство более высокой общей эффективности. Тем не менее, хотя гистопатологическая оценка проводилась в слепом режиме для минимизации систематической ошибки исследователя, все срезы тканей оценивались одним патологоанатомом, что исключило возможность оценки межэкспертной вариабельности. Будущие исследования с привлечением нескольких независимых экспертов могут способствовать дальнейшему повышению достоверности и воспроизводимости гистопатологических результатов.

Воспроизводимость применения данной модели зависит от стабильного выполнения нескольких процедурных этапов. Продолжительность ограничения потребления воды, заранее определенные интервалы между введением L-NAME, индометацина и иогексиола, а также медленное внутривенное введение иогексиола должны быть стандартизированы для всех животных. Экстравазат в хвостовую вену может снизить эффективную дозу контрастного вещества и увеличить вариабельность степени повреждения почек; поэтому в процессе введения необходимо тщательно контролировать место инъекции. При возникновении утечки, экстравазата или значительного сопротивления при инъекции следует учитывать возможность неполного введения контрастного вещества при интерпретации соответствующих результатов. На точность дозировки также может повлиять регургитация при зондовом кормлении или ненадлежащее ресуспендирование препарата монтелукаста. Применение одних и тех же стандартизированных процедур для всех животных и, по возможности, закрепление введения препаратов за одним и тем же исследователем может снизить предотвратимую процедурную вариабельность.

Данный протокол позволяет вызвать CI-AKI в течение относительно короткого экспериментального периода, что дает возможность изучить биохимические и гистопатологические показатели на одной и той же модели животного^1,2,9.

Сильной стороной настоящего исследования является то, что повреждение почек было охарактеризовано с использованием взаимодополняющих функциональных, биохимических, воспалительных и гистопатологических показателей. Оценка показателей функции почек вместе с параметрами окислительного стресса, воспалительными цитокинами, KIM-1, цистатином C и морфологией тканей почек позволила изучить несколько компонентов ОПП, вызванного контрастными веществами, в рамках одного эксперимента. Включение KIM-1 и цистатина C также расширило область оценки за пределы стандартных измерений уровня креатинина в сыворотке крови. Тестирование монтелукаста и NAC как по отдельности, так и совместно позволило провести прямое сравнение стратегий лечения; однако результаты не выявили последовательного превосходства комбинированной терапии над монотерапией по всем оцениваемым показателям. Более того, в отличие от подходов к индукции, основанных только на воздействии контрастных веществ, данная модель учитывает вазоконстрикцию почечных сосудов и гипоксию мозгового вещества, создавая тем самым выраженную картину повреждения почек, при которой можно оценить биологические изменения, связанные с лечением.

Интервал в 1 ч между введением контрастного вещества и началом лечения представляет собой лишь временную точку, рассмотренную в данном экспериментальном протоколе, и не должен интерпретироваться как клинически подтвержденное терапевтическое окно. Хотя лечение вскоре после известного введения контрастного вещества может быть актуальным для будущих трансляционных исследований, настоящее исследование на животных не позволяет определить его осуществимость или эффективность в клинических условиях. В частности, оптимальное время начала, доза, путь введения, продолжительность лечения и популяция пациентов остаются неизвестными. Эти факторы должны быть изучены в специализированных трансляционных и клинических исследованиях, прежде чем применение NAC или монтелукаста после введения контрастного вещества сможет быть рассмотрено для клинического использования.

Следует признать несколько ограничений данного исследования. Результаты были получены на доклинической модели животного и, следовательно, не могут быть напрямую перенесены в клиническую практику. Поскольку протокол сочетал лишение воды с ингибированием путей оксида азота и простагландинов, результирующее повреждение почек могло быть более тяжелым, чем повреждение, обычно наблюдаемое у пациентов после введения контрастного вещества. Следовательно, результаты следует интерпретировать в контексте данных условий экспериментальной сенсибилизации. Хотя модель позволяет проводить контролируемую оценку биологических ответов на потенциальные ренопротективные методы лечения, она не воспроизводит всю гетерогенность или диапазон тяжести клинического CI-AKI. Изменения, связанные с лечением и наблюдаемые в данном исследовании, могут отличаться у пациентов с более легкими или разнообразными профилями риска. Прежде чем будет определена величина или клиническая значимость этих эффектов, требуется репликация в менее интенсивных моделях, которые более точно приближены к обычным клиническим условиям, с последующим проведением надлежащим образом спланированных клинических исследований. Дополнительным ограничением является то, что в исследование были включены только самцы крыс. Таким образом, потенциальные половые различия в восприимчивости к CI-AKI и ответах на NAC и монтелукаст не оценивались, и нельзя предполагать, что полученные результаты применимы к самкам животных. Для определения того, влияет ли пол на тяжесть повреждения почек или ответ на лечение, необходимы будущие исследования с участием обоих полов.

Еще одним ограничением является отсутствие процедурной группы плацебо, соответствующей экспериментальным группам по таким параметрам, как манипуляции в ходе протокола, фиксация, ограничение потребления воды, инъекции, зондовое введение и введение плацебо. Поскольку группа контроля не подвергалась этим процедурам, нельзя полностью исключить вероятность того, что неравномерный процедурный стресс и неспецифические эффекты, связанные с фиксацией, повторными манипуляциями, инъекциями, зондовым введением и воздействием плацебо, могли внести вклад в некоторые из наблюдаемых различий между контрольной и экспериментальными группами. Включение в будущие исследования соответствующим образом подобранных процедурных групп плацебо и групп контроля с введением плацебо поможет отличить эти неспецифические процедурные эффекты от тех, которые специфически обусловлены индукцией CI-AKI и проводимой терапией.

Хотя заранее определенный размер выборки был рассчитан для обеспечения 80% мощности при выявлении предполагаемого значительного общего эффекта в пяти экспериментальных группах, исследование не было специально рассчитано на обнаружение более выраженных попарных различий между группами монотерапии и комбинированного лечения. Следовательно, исследование могло обладать ограниченной мощностью для выявления таких межгрупповых различий, и статистически незначимые численные тенденции не должны интерпретироваться как доказательство эквивалентности. Для определения того, представляют ли эти тенденции воспроизводимые различия в лечении, потребуются исследования с большим размером выборки.

Поскольку оценивалась только одна доза каждого препарата, в рамках данного исследования невозможно определить оптимальную комбинацию доз NAC–montelukast, охарактеризовать дозозависимые синергические или антагонистические взаимодействия или количественно оценить относительный вклад каждого агента в эффекты, наблюдаемые при комбинированной терапии. Таким образом, один из препаратов мог внести более значительный вклад в конкретные результаты, однако это невозможно установить исходя из текущего дизайна исследования. Для характеристики зависимостей «доза-эффект» и определения оптимального режима комбинированного применения потребуются дальнейшие исследования с использованием нескольких уровней дозирования и формального анализа лекарственных взаимодействий.

В исследовании оценивались биохимические показатели окислительного стресса и воспаления, однако прямой анализ связанных с ними внутриклеточных сигнальных путей не проводился. Следовательно, наблюдаемые профили биомаркеров не позволяют определить, были ли сигнальные пути, связанные с NF-κB, NLRP3 или NOX4, активированы или ингибированы в результате лечения. Для определения того, каким образом эти пути влияют на воздействие монтелукаста и NAC на почки, необходимы дальнейшие исследования с использованием молекулярных методов, включая вестерн-блоттинг и количественную полимеразную цепную реакцию (qPCR).

Поскольку оценки были ограничены острой фазой, настоящее исследование не предоставляет информации о последующем восстановлении почек или долгосрочном ремоделировании тканей. Следовательно, относительно ограниченное отложение коллагена, наблюдаемое в группах лечения в исследуемой конечной точке, следует рассматривать как ранний структурный признак, а не как доказательство предотвращения хронического фиброза почек. Этот результат может, напротив, отражать ослабление первичного поражения почек. Необходимы лонгитюдные исследования с более поздними точками оценки, чтобы определить, сохраняются ли эти ранние изменения и влияют ли они на долгосрочную функцию почек или ремоделирование тканей.

В целом, введение монтелукаста и NAC после введения контраста, как по отдельности, так и в комбинации, было связано с ослаблением почечной дисфункции, окислительного стресса, воспалительных реакций и гистопатологических повреждений в данной экспериментальной модели CI-AKI. Однако комбинированная терапия не продемонстрировала стабильного превосходства над монотерапией по всем оцениваемым показателям. Данные результаты ограничены настоящей доклинической моделью и служат основанием для дальнейших экспериментальных исследований, а не для прямой экстраполяции на клиническую практику.

В заключение следует отметить, что применение монтелукаста, NAC или их комбинации после введения контраста было связано с более благоприятными биохимическими и гистопатологическими показателями в данной экспериментальной модели CI-AKI. Тем не менее, комбинированный режим не показал стабильного превосходства над монотерапией по всем оцениваемым исходам. Поскольку данные наблюдения были получены в ходе доклинического исследования на животных, их следует рассматривать как основу для дальнейшей экспериментальной проверки, а не как доказательство клинической эффективности или применимости. Необходимы дополнительные исследования для определения потенциальной значимости этих подходов к лечению после введения контраста при клиническом CI-AKI.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Автоматический промыватель стрипов	Bio-Tek Instruments, США	ELx50	Автоматизированная промывка планшетов для ИФА.
Считыватель микропланшетов	Bio-Tek Instruments, США	ELx800	Измерение оптической плотности при ИФА. RRID:SCR_028651
10% нейтральный буферный формалин	Merck	Не записано	Фиксация тканей для гистопатологического исследования.
Настольная центрифуга	Nüve	NF048	Подготовка образцов и центрифугирование.
Карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ)	Sigma-Aldrich, США	C5678	Растворитель, используемый для приготовления суспензии монтелукаста.
Универсальный набор CAT Kit	Otto Scientific	Otto3051	Колориметрическое измерение активности КАТ в сыворотке крови с использованием биохимического анализатора Mindray BS-400.
Цифровой гомогенизатор	Daihan Scientific	HG-15D	Гомогенизация тканей.
Эозин Y (желтоватый)	Merck	1.15935.0025	Окрашивание гематоксилином и эозином.
Раствор гематоксилина по Харрису	BSLAB	BS-002	Окрашивание гематоксилином и эозином.
Индометацин	Sigma-Aldrich, США	I7378	Используется для индукции контраст-индуцированного острого повреждения почек (CI-AKI).
Иогексол (Omnipaque 300)	GE HealthCare	Не записано	Контрастное вещество, используемое для индукции контраст-индуцированной острой болезни почек (CI-AKI).
Кетамина гидрохлорид (Ketalar)	Pfizer, США	Не записано	Общая анестезия перед сбором образцов.
Световой микроскоп (Nikon Eclipse)	Nikon	Ni-U	Гистопатологическое исследование и визуализация. RRID:SCR_024835
L-NAME (Nω-nitro-L-arginine methyl ester)ω-нитро-L-аргининметиловый эфир)	Sigma-Aldrich, США	N5751	Используется для индуцирования контраст-индуцированной острой болезни почек (КИ-ОБП).
Набор для окрашивания по методу трихромного окрашивания Массона	MOSLAB, TüТурция	BKMTO001	Окрашивание по методу трехцветного окрашивания по Массону.
Биохимический анализатор Mindray	Mindray	BS-400	Биохимические анализы.
Монтелукаста натрий	Sigma-Aldrich, США	SML0101	Вводили перорально с помощью зонда в качестве терапии.
N-ацетилцистеин (ASIST 300 мг/2 мл)	МАК <альт-текст изображения="Уравнение 1" Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода."/files/ftp_upload/73087/73087eq1.jpg" стиль="margin: auto;"/>Пожалуйста, предоставьте текст для перевода.ç, TüТурция	Не записано	Вводили внутрибрюшинно в качестве лечения.
Набор для ИФА цистатина C крысы	Лаборатория BT, Китай	E0145Ra	Измерение уровня цистатина С в супернатантах ренальных тканей методом ИФА.
ИЛ-1 крысыβ Набор для ИФА	Лаборатория BT, Китай	E0119Ra	Измерение уровня IL-1 методом ИФАβ в супернатантах тканей почек.
Набор для ИФА IL-6 крысы	BT Lab, Китай	E0135Ra	Измерение уровня ИЛ-6 в супернатантах тканей почек методом ИФА.
Набор для ИФА на KIM-1 крысы	Лаборатория BT, Китай	E0549Ra	ИФА-измерение уровня KIM-1 в супернатантах тканей почек.
ФНО крысыα Набор для ИФА	Лаборатория BT, Китай	E0764Ra	Измерение уровня ФНО-α методом ИФАα в супернатантах тканей почек.
Игла для кормления из нержавеющей стали (канюля для перорального зондирования 22 G)	Instech Laboratories, США	Не записано	Пероральное зондовое введение.
Стандартный гранулированный корм для грызунов (Optima)	Optima, TüТурция	Не записано	Партия № 58931. Пищевая ценность: 24% сырого белка, 3,94% сырой клетчатки, 5,08% сырого жира, 8,8% сырой золы, 1,44% лизина, 0,61% метионина, 1,14% кальция, 0,89% фосфора и 0,28% натрия.
Универсальный набор для определения креатинина	Otto Scientific	OttoBC139	Колориметрическое определение содержания креатинина в сыворотке крови.
Универсальный набор для определения GSH	Otto Scientific	Otto3053	Колориметрическое определение содержания GSH в крови с ЭДТА-антикоагулянтом с использованием модифицированного метода Эллмана.
Универсальный набор для MDA	Otto Scientific	Otto1001	Колориметрическое определение содержания МДА в сыворотке крови с использованием микропланшетного ридера ELx800.
Универсальный набор для определения СОД	Otto Scientific	Otto3047	Колориметрическое измерение активности СОД в сыворотке крови с использованием биохимического анализатора Mindray BS-400.
Универсальный набор для определения мочевины	Otto Scientific	OttoBC157	Колориметрическое определение содержания мочевины и азота по мочевине крови (BUN) в сыворотке.
Ксилазина гидрохлорид (Rompun)	Bayer, Германия	Не записано	Общий наркоз перед забором образцов.