Нефропротекторное действие N-ацетилцистеина и монтелукаста при применении после введения контрастного вещества на модели острого повреждения почек, индуцированного контрастным веществом, у крыс

Краткое содержание

В данном протоколе представлена модель острого повреждения почек у крыс, вызванного введением контрастного вещества, и оценивается эффективность последующего введения N-ацетилцистеина и монтелукаста по отдельности и в комбинации. Режимы лечения были связаны с менее выраженной почечной дисфункцией, окислительным стрессом, воспалением и гистопатологическими повреждениями, хотя комбинированная терапия не демонстрировала стабильного превосходства над монотерапией.

Аннотация

Контраст-индуцированное острое повреждение почек (КИ-ОПП) является серьезным осложнением при использовании йодсодержащих контрастных веществ, при котором окислительный стресс и воспалительные процессы способствуют повреждению почек. В данном исследовании была создана экспериментальная модель КИ-ОПП на крысах и изучены эффекты терапии, начатой после введения контрастного вещества, с использованием N-ацетилцистеина (NAC), монтелукаста или их комбинации. Взрослые самцы крыс линии Wistar подвергались ограничению в воде с последующим последовательным внутривенным введением Nω-нитро-L-аргинин-метилового эфира (L-NAME), индометацина и иогексола. Терапию начинали через 1 h после завершения введения иогексола (примерно через 1,5 h после введения L-NAME) и продолжали один раз в сутки в течение 3 последовательных дней. Были оценены показатели функции почек, параметры окислительного стресса, воспалительные цитокины, биомаркеры повреждения почек и гистопатология почек. В группе КИ-ОПП без лечения наблюдались выраженная почечная дисфункция, неблагоприятный профиль окислительного стресса и воспаления, а также значительные гистопатологические повреждения. По сравнению с группой КИ-ОПП без лечения, животные, получавшие NAC, монтелукаст или комбинированную терапию, в целом демонстрировали улучшение биохимических и гистопатологических показателей. Уровни глутатиона (GSH) были наиболее высокими, а средние баллы гистопатологического повреждения — количественно самыми низкими в группе комбинированного лечения; однако комбинированная терапия не показала стабильного превосходства над монотерапией по всем оцениваемым параметрам. Данный протокол предоставляет контролируемую доклиническую основу для оценки постконтрастных вмешательств при КИ-ОПП, и полученные результаты обосновывают дальнейшие экспериментальные исследования NAC и монтелукаста, не устанавливая при этом клиническую эффективность или специфическое преимущество комбинации.

Введение

Острое повреждение почек (ОПП) часто осложняет течение заболеваний у госпитализированных пациентов и способствует росту заболеваемости, смертности и затрат ресурсов здравоохранения. Поскольку йодсодержащие контрастные вещества регулярно применяются при диагностической визуализации и интервенционных процедурах, ухудшение функции почек после воздействия контраста стало важной клинической проблемой. Современная номенклатура разграничивает контраст-ассоциированное острое повреждение почек (CA-AKI), которое включает любой эпизод ОПП, возникший после введения контраста, и контраст-индуцированное острое повреждение почек (CI-AKI), при котором повреждение почек причинно связано с воздействием контрастного вещества. В контролируемых экспериментальных моделях, где воздействие контраста может быть напрямую связано с повреждением почек, термин CI-AKI по-прежнему широко используется^1,2.

Пациенты с хронической болезнью почек, сахарным диабетом, пожилым возрастом, сердечной недостаточностью или другими сердечно-сосудистыми сопутствующими заболеваниями особенно подвержены развитию CI-AKI. У многих пораженных пациентов функция почек восстанавливается; однако в более тяжелых случаях могут наблюдаться стойкое нарушение функции почек, необходимость проведения заместительной почечной терапии и повышенный риск летального исхода. CI-AKI также ассоциируется с более длительной госпитализацией и повышенным использованием ресурсов системы здравоохранения. Эти неблагоприятные последствия подчеркивают сохраняющуюся необходимость разработки эффективных профилактических и терапевтических подходов к лечению контраст-индуцированного повреждения почек^1,3,4,5.

Развитие контраст-индуцированной острой почечной недостаточности (CI-AKI) включает несколько взаимосвязанных процессов, в том числе нарушение почечной перфузии, дисбаланс кислорода в мозговом веществе, окислительный стресс, воспаление и прямое токсическое воздействие на канальцы. Воздействие контрастного вещества смещает внутрипочечный сосудистый тонус в сторону вазоконстрикции, одновременно ослабляя вазодилатирующие ответы, что приводит к снижению почечного кровотока. Наружный слой мозгового вещества особенно уязвим, поскольку доступность кислорода в этой области и в физиологических условиях ограничена. Таким образом, дальнейшее снижение доставки кислорода после введения контрастного вещества может спровоцировать гипоксическое повреждение канальцев^2,6,7.

Гипоксия почек после воздействия контрастного вещества сопровождается усилением образования активных форм кислорода (АФК), что вносит существенный вклад в повреждение почек. Когда продукция АФК превышает эндогенную антиоксидантную способность, может развиться окислительное повреждение клеточных липидов, белков и ДНК, при этом одновременно усиливается воспалительная сигнализация. Как в экспериментальных, так и в клинических условиях введение контрастного вещества было связано с повышением параметров окислительного стресса и нарушением антиоксидантной защиты. Молекулярные пути, вовлеченные в этот ответ, включают никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADPH)-оксидаза-зависимое образование радикалов и активацию ядерного фактора каппа-B (NF-κB)^1,6,8,9.

Вклад воспаления указывает на то, что CI-AKI нельзя объяснить одними лишь гемодинамическими нарушениями. Последние данные также свидетельствуют о роли ферроптоза, нитрозативного стресса и внеклеточных ловушек нейтрофилов в повреждении почек после введения контрастного вещества. Распознавание этих дополнительных механизмов расширило спектр молекулярных мишеней, исследуемых для профилактики и лечения CI-AKI¹.

Для диагностики контраст-индуцированной острой почечной недостаточности (CI-AKI) обычно используют уровни креатинина в сыворотке крови и объем выделяемой мочи, однако оба этих показателя могут измениться только после того, как повреждение почек уже развилось. Это ограничение стимулировало поиск более ранних индикаторов, включая молекулу повреждения почек-1 (KIM-1), которая отражает тубулярное повреждение, и цистатин C, связанный с изменениями клубочковой фильтрации. Данные экспериментальных и клинических исследований указывают на то, что изменения этих биомаркеров могут стать заметными на ранней стадии CI-AKI и, следовательно, способствовать более ранней оценке повреждения почек^9,10,11.

Достижения в понимании патофизиологии контраст-индуцированной острой почечной недостаточности (КИ-ОПН) стимулировали изучение фармакологических вмешательств, направленных на окислительные и воспалительные пути. Адекватная гидратация остается основным методом профилактики, в то время как сообщаемые преимущества лекарственных подходов варьировались в различных исследованиях. Следовательно, ни одно фармакологическое лечение еще не продемонстрировало достаточной и стабильной эффективности, чтобы быть принятым в качестве стандартного клинического вмешательства при КИ-ОПН^1,4,12,13.

N-ацетилцистеин (NAC) широко изучался как фармакологический метод ограничения CI-AKI. Его предполагаемые ренопротективные эффекты связаны с нейтрализацией активных форм кислорода и восстановлением запасов глутатиона. Первые клинические данные были получены в ходе знакового исследования пациентов с хронической болезнью почек, в котором NAC снизил частоту возникновения контраст-индуцированной почечной дисфункции¹⁴. Однако последующие клинические испытания и обзоры доказательств дали противоречивые результаты: в одних исследованиях сообщалось о пользе, в то время как в других не было выявлено значимого клинического эффекта. Таким образом, эффективность NAC при CI-AKI остается неопределенной^12,15,16,17.

Монтелукаст селективно блокирует рецептор 1 цистеиниловых лейкотриенов и давно используется для лечения астмы и аллергических заболеваний. Экспериментальные данные также указывают на то, что этот препарат оказывает противовоспалительное, антиоксидантное и антиапоптотическое действие. В различных моделях повреждения почек введение монтелукаста ассоциировалось со снижением перекисного окисления липидов, усилением эндогенной антиоксидантной защиты, менее выраженными гистопатологическими повреждениями и ослаблением поражения почек^{18,19,20,21,22}.

Данные, специально касающиеся применения монтелукаста при CI-AKI, остаются ограниченными. Имеющиеся экспериментальные результаты позволяют предположить, что его почечные эффекты могут быть связаны с модуляцией окислительных и воспалительных сигнальных путей. Снижение экспрессии NADPH-оксидазы 4 (NOX4), p22phox и NF-κB было предложено в качестве одного из механизмов, посредством которых монтелукаст может уменьшать повреждение почек, вызванное контрастированием⁹.

NAC и монтелукаст воздействуют на частично различающиеся, но перекрывающиеся пути, участвующие в повреждении почек. NAC преимущественно поддерживает антиоксидантную защиту, тогда как монтелукаст обладает как противовоспалительным, так и антиоксидантным действием. Таким образом, одновременное введение этих препаратов может влиять на несколько компонентов патофизиологии CI-AKI; однако вопрос о том, вызывает ли их взаимодействие аддитивный или синергетический эффект, в экспериментальных моделях еще не решен^{18,19,20,21,22}.

Предыдущие исследования были преимущественно сосредоточены на оценке вмешательств, проводимых до введения контрастного вещества, в то время как данные о лечении, начатом после экспозиции, остаются ограниченными. В частности, ограниченное внимание в экспериментальных моделях CI-AKI было уделено применению монтелукаста совместно с NAC после введения контраста. Таким образом, в настоящем исследовании оценивалось влияние монтелукаста и NAC, вводимых после экспозиции контрастным веществом как по отдельности, так и в комбинации, на функцию почек, параметры окислительного стресса и антиоксидантную защиту, биомаркеры повреждения почек и воспаления, а также на гистопатологические изменения в крысиной модели CI-AKI.

Протокол

Все экспериментальные процедуры с использованием животных проводились в соответствии с международно признанными рекомендациями по уходу и использованию лабораторных животных и соответствовали руководству по проведению исследований на животных: отчетность об экспериментах In Vivo (ARRIVE). Протокол эксперимента был одобрен Локальным комитетом по этике экспериментов на животных Университета Ahi Evran, Кырышехир, Турция (решение № 2, заседание № 12, дата: 12 июня 2025 г.). Были предприняты все усилия для минимизации страданий животных и сокращения их количества, использованного в ходе исследования. Подробная информация о всех использованных реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

Приготовление химических реагентов

В данном исследовании использовались Nω-нитро-L-аргининметиловый эфир (L-NAME), индометацин, иогексол, монтелукаста натрий и NAC. Раствор L-NAME с концентрацией 10 mg/mL готовили в стерильном 0,9% физиологическом растворе, используя 1 g L-NAME на 100 mL. Раствор готовили непосредственно в день введения и использовали без последующего хранения. Для индукции экспериментальной модели CI-AKI L-NAME вводили внутривенно (IV) в дозе 10 mg/kg. Для крысы весом примерно 220 g расчетное количество составило приблизительно 2,2 mg, что соответствует объему введения около 0,22 mL. Индометацин готовили в 5% растворе бикарбоната натрия с концентрацией 10 mg/mL, растворяя 100 mg в конечном объеме 10 mL. Препарат перемешивали на вортексе до достижения визуальной гомогенности. Конечный pH приготовленного раствора индометацина во время эксперимента не измеряли, поэтому он не мог быть определен ретроспективно. Специфическая процедура стерилизации или фильтрации приготовленного раствора индометацина в экспериментальных записях не была задокументирована и, следовательно, не может быть представлена ретроспективно. Формальный интервал стабильности не устанавливался и не оценивался; раствор готовили непосредственно перед использованием и применяли в тот же день. Для индукции экспериментальной модели CI-AKI индометацин вводили внутривенно в дозе 10 mg/kg. Для крысы весом примерно 220 g расчетное количество составило приблизительно 2,2 mg, что соответствует объему введения около 0,22 mL.

Коммерческий препарат иогексола, содержащий 647 mg иогексола/mL и эквивалентную концентрацию йода 300 mg/mL, вводили без дополнительного разведения. Точная температура иогексола на момент инъекции не регистрировалась. Значение осмоляльности конкретного препарата не удалось достоверно подтвердить по имеющимся экспериментальным записям, поэтому оно не приводится. Для индукции экспериментальной модели CI-AKI иогексол вводили внутривенно в дозе 3 g йода/kg. Для крысы весом примерно 220 g эта доза составила приблизительно 0,66 g йода, что соответствовало объему инъекции около 2,2 mL.

Суспензия монтелукаста натрия была приготовлена в 0,5% карбоксиметилцеллюлозе (CMC). Она готовилась непосредственно в день каждого введения и перемешивалась на вортексе перед дозированием для обеспечения равномерного распределения взвешенных частиц. Доза монтелукаста, необходимая для каждого животного, рассчитывалась отдельно на основании массы тела, зафиксированной в начале исследования, по следующей формуле: необходимая доза (mg) = масса тела (kg) × 10 mg/kg. Для животного весом примерно 220 g расчетная доза составила примерно 2,2 mg и вводилась путем перорального зондирования. Перед каждым введением суспензию подвергали визуальному осмотру, и любой препарат с признаками седиментации повторно перемешивали на вортексе перед использованием.

NAC вводили группам лечения в виде коммерческой формы препарата без дальнейшего разбавления внутрибрюшневно в дозе 100 mg/kg. Для каждого животного необходимая доза рассчитывалась индивидуально на основании массы тела, зафиксированной в начале исследования. Для животного весом примерно 220 g это соответствовало примерно 22 mg NAC и объему введения приблизительно 0.15 mL. Перед введением раствор подвергали визуальному осмотру; использовали только прозрачные препараты без видимых частиц.

Каждый препарат проходил визуальный осмотр перед введением. Растворы L-NAME, индометацина, иогексола и NAC проверяли на наличие изменения цвета и видимых частиц. Непосредственно перед введением суспензию монтелукаста перемешивали на вортексе и визуально проверяли на однородность. Любой препарат, не соответствующий этим критериям приемлемости, не использовался. При подготовке и введении всех химических веществ использовались лабораторные халаты, защитные перчатки и средства защиты глаз. Все процедуры проводились в соответствии с требованиями учреждения по лабораторной и биологической безопасности.

Подбор животных, содержание, экспериментальные группы и рандомизация

Тридцать взрослых самцов белых крыс линии Wistar (возраст 8–12 недель; масса тела 200–220 g) были получены из Лаборатории исследований экспериментальных животных Университета Ахи Эвран, Кырышехир, Турция. Самцы были выбраны для сохранения методологической согласованности с ранее опубликованными экспериментальными моделями CI-AKI и во избежание влияния стадии эстрального цикла как дополнительной биологической переменной. Пол не оценивался как экспериментальная переменная в данном исследовании. Виварий имел лицензию на разведение/производство № 184; крысы разводились и содержались там в стандартных лабораторных условиях. На момент включения в исследование животные не имели документально подтвержденного статуса SPF (без специфических патогенов) или иной формально назначенной микробиологической классификации состояния здоровья. Каждая крыса содержалась отдельно в поликарбонатной клетке размером 40 cm × 25 cm × 20 cm, в качестве подстилки использовалась крупно порубленная сосновая стружка. Параметры помещения поддерживались на уровне 24 °C ± 2 °C и 35% ± 10% относительной влажности автоматизированной системой контроля окружающей среды и вентиляции. Применялся режим освещения 12 ч свет/12 ч темнота, с освещением с 07:00 до 19:00. Специального обогащения среды в течение 7-дневного периода акклиматизации или последующего экспериментального периода не предоставлялось. Стандартный гранулированный корм для грызунов и водопроводная вода были доступны ad libitum, за исключением определенного 16-часового периода лишения воды, предшествующего индукции CI-AKI. Состав корма: 24% сырого белка, 3.94% сырой целлюлозы, 5.08% сырого жира, 8.8% сырой золы, 1.44% лизина, 0.61% метионина, 1.14% кальция, 0.89% фосфора и 0.28% натрия. Все животные проходили акклиматизацию в течение 7 дней до начала экспериментальных процедур. Ежедневные наблюдения проводились как в период акклиматизации, так и в экспериментальный период для оценки общего состояния, потребления корма и воды, подвижности, осанки, внешнего вида шерсти и любых признаков стресса. Для минимизации систематической ошибки отбора животные были распределены по пяти экспериментальным группам с использованием компьютерной программы рандомизации, по шесть животных в каждой группе. Размер выборки был определен с помощью предварительного анализа мощности с использованием G*Power версии 3.1.9.6.

Размер выборки был определен путем априорного анализа мощности для однофакторного дисперсионного анализа с фиксированными эффектами, включающего пять экспериментальных групп. При допущении величины эффекта (f) 0,65, вероятности ошибки первого рода (α) 0,05 и статистической мощности 80%, требуемый общий размер выборки был рассчитан как 30 животных, что соответствует шести животным в группе. Априори предполагалось, что величина эффекта (f = 0,65) представляет собой большой общий межгрупповой эффект для сравнения пяти групп. Расчет был предназначен для определения размера выборки, необходимого для обнаружения такого общего эффекта, и не был специально разработан для выявления меньших попарных различий между группами активного лечения. В качестве экспериментальной единицы для всех анализов рассматривалось отдельное животное.

За исключением рутинного ухода, ежедневного мониторинга состояния здоровья и терминальных процедур, животные в контрольной группе не подвергались манипуляциям или фиксации в рамках протокола, лишению воды, внутривенным или внутрибрюшинным инъекциям, зондовому введению препаратов per os или введению растворителя. Группа CI-AKI включала животных, у которых на 8-й день была создана модель CI-AKI и которые не получали лечения. Группа CI-AKI + Montelukast включала животных, у которых была создана модель CI-AKI и которые впоследствии получали монтелукаст. Группа CI-AKI + NAC включала животных, у которых была создана модель CI-AKI и которые впоследствии получали NAC. Группа CI-AKI + Montelukast + NAC включала животных, у которых была создана модель CI-AKI и которые впоследствии получали комбинацию монтелукаста и NAC. Ни контрольная группа, ни группа CI-AKI без лечения не подвергались имитационным процедурам, соответствующим терапии. В частности, в этих группах не проводились имитационные манипуляции, имитационное зондовое введение, имитационные терапевтические инъекции или введение соответствующего растворителя. Растворителями, использованными для приготовления L-NAME, индометацина и монтелукаста, были 0,9% физиологический раствор, 5% раствор гидрокарбоната натрия и 0,5% CMC соответственно, как описано в разделе приготовления химических веществ. NAC вводили в виде коммерческой формы без дальнейшего разведения; отдельный растворитель для NAC не готовился. На 8-й день все животные, кроме животных контрольной группы, подвергались лишению воды в течение 16 h, после чего последовательно вводили внутривенно L-NAME (10 mg/kg), индометацин (10 mg/kg) и иогексол (3 g йода/kg) для индукции контраст-индуцированного острого повреждения почек. В соответствующих группах лечения монтелукаст (10 mg/kg, зондовое введение per os) и/или NAC (100 mg/kg, внутрибрюшинная инъекция) вводили впервые через 1 h после завершения введения иогексола на 8-й день, что соответствует примерно 1,5 h после введения L-NAME, и в дальнейшем вводили один раз в день в то же время на 9-й и 10-й дни.

Протокол введения препарата

Контраст-индуцированное острое повреждение почек (CI-AKI) было вызвано в соответствии с опубликованным экспериментальным протоколом, который включал 16 ч депривации воды с последующим последовательным внутривенным введением L-NAME, индометацина и йогексола^23,24,25. L-NAME и индометацин вводили в дозе 10 mg/kg каждый, тогда как йогексол вводили в дозе 3 g йода/kg. Терапевтические дозы составили 10 mg/kg для натриевой соли монтелукаста и 100 mg/kg для NAC. Выбор доз для индукции модели и лечения основывался на ранее опубликованных экспериментальных исследованиях^22,26,27. Предварительных исследований по подбору или оптимизации доз не проводилось. Дозы NAC и монтелукаста выбирались независимо на основе ранее опубликованных экспериментальных исследований отдельных препаратов и не были получены в результате исследования по подбору доз для комбинированной терапии. Выбранные дозы не предназначались для обеспечения фармакологически эквипотентного воздействия; анализ зависимости «доза-эффект» или формальный анализ лекарственного взаимодействия не проводились. Для определения успешности индукции модели на уровне отдельного животного не использовались заранее установленные численные или лабораторные пороговые значения. В конечной точке исследования успешное развитие повреждения почек подтверждалось характерными гистопатологическими изменениями, наблюдаемыми в группе CI-AKI без лечения по сравнению с контрольной группой. На 8-й день все животные, кроме контрольной группы, подвергались однократному 16-часовому периоду депривации воды непосредственно перед индукцией контраст-индуцированного острого повреждения почек. Депривация воды не повторялась в течение остального экспериментального периода. Стандартный гранулированный корм оставался доступен ad libitum на протяжении всего периода депривации воды. По завершении однократного 16-часового периода депривации воды доступ к водопроводной воде был восстановлен одновременно и ad libitum для всех экспериментальных групп с депривацией воды перед введением первого агента, индуцирующего модель, L-NAME, и поддерживался до конца экспериментального периода. Время и условия восстановления доступа к воде были идентичны для всех групп с депривацией. Потребление воды после восстановления не ограничивалось заранее определенным объемом и не измерялось количественно. Масса тела непосредственно до и после 16-часового периода депривации воды не измерялась; следовательно, процент потери массы тела, связанный с дегидратацией, не мог быть рассчитан. Диурез не контролировался количественно. После восстановления доступа к воде была инициирована индукция CI-AKI. Все последовательные внутривенные введения L-NAME, индометацина и йогексола осуществлялись через латеральную вену хвоста с использованием иглы 26 G, прикрепленной к стерильному шприцу объемом 5 mL. Перед внутривенным введением хвост прогревали в воде в течение нескольких минут для облегчения визуализации и расширения латеральных вен хвоста. После каждого внутривенного введения вену промывали 0.5 mL стерильного 0.9% физиологического раствора, в дополнение к расчетному объему введения соответствующего агента, индуцирующего модель. Место инъекции визуально контролировали во время введения и промывания на предмет отека, утечки или признаков экстравазации. Сначала вводили L-NAME (10 mg/kg). Через пятнадцать минут после введения L-NAME индометацин (10 mg/kg) вводили внутривенно в ту же латеральную вену хвоста. Через пятнадцать минут после введения индометацина йогексол вводили внутривенно в ту же латеральную вену хвоста в дозе 3 g йода/kg. Для каждого животного доза йогексола и соответствующий объем инъекции рассчитывались индивидуально на основе массы тела, зафиксированной в начале исследования, и коммерческой концентрации йода 300 mg йода/mL. Это соответствовало объему введения 10 mL/kg и, следовательно, примерно 2.0–2.2 mL для крыс весом 200–220 g. Отдельный, определенный протоколом максимально допустимый объем внутривенного введения не устанавливался; наибольшим объемом внутривенного введения одного агента в данном исследовании был йогексол в дозе 10 mL/kg. Йогексол вводили медленно в течение примерно 1–2 мин. Успешность внутривенного введения подтверждалась отсутствием видимого отека, утечки или экстравазации в месте инъекции. Частичной экстравазации не наблюдалось, и ни одна инъекция не потребовала повторной попытки или повторного введения из-за подозрения на экстравазацию. Через один час после завершения введения йогексола группам лечения впервые вводили назначенные препараты. Поскольку введение йогексола начиналось через 30 мин после введения L-NAME и завершалось примерно за 1–2 мин, начало лечения происходило примерно через 91–92 мин (около 1.5 ч) после введения L-NAME. Натриевую соль монтелукаста (10 mg/kg) вводили путем перорального зондирования, в то время как NAC (100 mg/kg) вводили внутрибрюшинно.

Пероральный зонд вводили с помощью стальной кормовой канюли 22 G. Каждое животное удерживали в вертикальном положении, и канюлю осторожно продвигали через пищевод в желудок. При возникновении чрезмерного сопротивления канюлю извлекали и позиционировали заново перед введением препарата. Во время и сразу после зондирования наблюдали за наличием регургитации. Ни у одного животного во время или сразу после зондирования не наблюдалось регургитации или других признаков неполного перорального введения, и ни одно животное не было исключено на основании предполагаемого неудачного перорального введения. Интраперитонеальные инъекции проводили в правый нижний квадрант брюшной полости. Иглу вводили под углом примерно 30°–45°, и перед введением препарата выполняли аспирацию, чтобы убедиться в отсутствии случайного попадания в сосуд. Место инъекции визуально контролировали во время и сразу после введения на предмет утечки, кровотечения или других видимых осложнений. Назначенные препараты вводили один раз в день в одно и то же время в 8-й, 9-й и 10-й дни. Соответственно, животные в группе CI-AKI + Montelukast получали монтелукаст один раз в день в течение трех дней подряд, животные в группе CI-AKI + NAC получали NAC один раз в день в течение трех дней подряд, а животные в группе CI-AKI + Montelukast + NAC получали и монтелукаст, и NAC один раз в день согласно тому же 3-дневному графику лечения. Все процедуры по индукции модели и введению препаратов проводились одним и тем же исследователем. Масса тела измерялась один раз для каждого животного в начале исследования и не переизмерялась в течение экспериментального периода. Для каждого животного доза и соответствующий объем введения всех агентов для индукции модели и исследуемых препаратов рассчитывались индивидуально на основе массы тела, зафиксированной в начале исследования. Все процедуры внутривенного, внутрибрюшинного и перорального введения выполнялись по одной и той же стандартизированной методике для минимизации вариабельности, связанной с введением препаратов.

Процедура эвтаназии, гуманные конечные точки и сбор образцов

Животных наблюдали один раз в день на протяжении всего эксперимента, отслеживая изменения общего состояния, потребление корма и воды, подвижность, позу, вид шерсти и признаки дистресса. Заранее определенные гуманные конечные точки включали выраженную вялость, невозможность доступа к имеющемуся корму или воде или их потребления, отклонения в позе, снижение подвижности, стойкую пилоэрекцию и любые другие явные проявления дистресса. Животные, соответствующие любому из этих критериев, подлежали немедленной эвтаназии; однако в ходе исследования ни одно животное не достигло гуманных конечных точек. На 11-й день, через 24 h после последнего введения препарата, индуцировали глубокую анестезию путем внутрибрюшного введения кетамина (80 mg/kg) совместно с ксилазином (10 mg/kg). Для подтверждения адекватного уровня анестезии использовали отсутствие педального рефлекса. После подтверждения достаточной глубины анестезии у каждого животного путем интракардиальной пункции получали примерно 3–5 mL крови. Затем эвтаназию завершали обескровливанием, пока животное находилось под глубокой анестезией. Смерть подтверждали по отсутствию сердечной деятельности и спонтанного дыхания.

Кровь, взятую для биохимического анализа сыворотки, помещали в пробирки без антикоагулянта и оставляли до полного свертывания. Затем пробирки центрифугировали при 3,000 × g в течение 10–15 мин при 4 °C, после чего фракцию сыворотки отделяли и хранили при −80 °C до проведения анализа. Образцы, предназначенные для измерения уровня глутатиона, собирали отдельно в пробирки, содержащие этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA). Поскольку в этих образцах использовался антикоагулянт, их обрабатывали без стадии свертывания в соответствии с соответствующим протоколом анализа глутатиона. Отделение сыворотки считалось успешным, если полученная сыворотка была прозрачной и не имела видимых признаков гемолиза.

После подтверждения смерти животных выполняли срединную лапаротомию и аккуратно извлекали обе почки из каждого организма. Образцы очищали от окружающей жировой и соединительной тканей. Правую почку резервировали исключительно для гистопатологического исследования, в то время как левую почку использовали для биохимического анализа. Гомогенизированную ткань левой почки анализировали без раздельного выделения коркового и мозгового вещества. С каждой почкой работали независимо, и образцы от разных животных оставались разделенными на протяжении всего процесса обработки без объединения в общий пул. Всю правую почку помещали в 10% нейтральный buffered formaldehyde и обрабатывали для гистопатологической оценки. Срезы, охватывающие корковый слой и наружную часть мозгового вещества почки, готовили и исследовали в соответствии с процедурами, описанными в разделе гистопатологической обработки и оценки. Каждую левую почку маркировали индивидуально и хранили при -80 °C до проведения гомогенизации и биохимического анализа. После иссечения проверяли макроскопическую целостность ткани и убеждались в наличии достаточного количества материала для запланированных гистопатологических и биохимических исследований.

Исследователь, ответственный за индукцию модели и введение препаратов, не мог быть ослеплен, так как экспериментальные группы подвергались различным процедурам. Однако идентификационные данные групп были скрыты от исследователей, проводивших биохимический и статистический анализы, а также от патологоанатома, выполнявшего гистопатологическую оценку. Все включенные животные оставались в исследовании и были задействованы в последующем анализе. Обращение с биологическими образцами, тканями животных, фиксаторами на основе формальдегида и другими химическими отходами осуществлялось с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты. Утилизация всех биологических и химических отходов проводилась в соответствии с требованиями учреждения по биологической безопасности и обращению с опасными отходами.

Биохимические анализы

Биохимические измерения проводили с использованием сыворотки, крови с ЭДТА-антикоагулянтом и гомогенатов тканей левой почки, полученных от каждого животного. Процедуры представлены ниже в зависимости от биологической матрицы, использованной для каждого параметра. В сыворотке анализировали уровни мочевины, азота мочевины крови (BUN), креатинина, активность супероксиддисмутазы (SOD) и концентрацию малонового диальдегида (MDA). Мочевина, BUN и креатинин служили показателями функции почек, в то время как активность SOD и концентрация MDA оценивались как параметры окислительного стресса. Значения мочевины сыворотки и BUN определяли с помощью одного и того же ферментативного метода с использованием уреазы и глутаматдегидрогеназы. При этом методе мочевина гидролизовалась уреазой с образованием аммиака, который затем вступал в реакцию с 2-оксоглутаратом и восстановленным никотинамидадениндинуклеотидом (NADH) в присутствии глутаматдегидрогеназы. Использовался кинетический ферментативный метод с уреазой и глутаматдегидрогеназой. Снижение оптической плотности, вызванное потреблением NADH, измеряли кинетически с помощью спектрофотометра. Концентрацию креатинина в сыворотке измеряли колориметрически на автоматическом биохимическом анализаторе. Активность SOD в сыворотке измеряли колориметрически с использованием коммерчески доступного набора реагентов на том же автоматическом биохимическом анализаторе. Анализ SOD основывался на генерации супероксидных радикалов системой ксантин–ксантиноксидаза и их реакции с 2-(4-йодфенил)-3-(4-нитрофенил)-5-фенилтетразолиум хлоридом с образованием окрашенного продукта — формазана. Конечную оптическую плотность измеряли при 505 nm, а активность SOD выражали в U/mL. Концентрацию MDA в сыворотке определяли колориметрически с помощью реакции с тиобарбитуровой кислотой. Образцы сыворотки смешивали с охлажденной трихлоруксусной кислотой для осаждения белков, после чего полученный осадок отделяли центрифугированием. Центрифугирование проводили при 7,500 × g в течение 5 min при 4 °C. Супернатант подвергали реакции с тиобарбитуровой кислотой при 90 °C в течение 60 min, охлаждали и измеряли при 532 nm. Концентрации MDA рассчитывали по соответствующей калибровочной кривой и выражали в nmol/mL. Анализ глутатиона (GSH) проводили с использованием крови с ЭДТА-антикоагулянтом. Белки осаждали трихлоруксусной кислотой, и полученные депротеинизированные образцы анализировали колориметрически модифицированным методом Эллмана. Образцы объединяли с 5,5′-дитиобис(2-нитробензойной кислотой) (DTNB) в 500 mM Трис-буфере при pH 8.2. Реакция тиольных групп GSH с DTNB приводила к образованию окрашенного продукта, и оптическую плотность регистрировали при 412 nm. Активность каталазы (CAT) определяли с помощью двухэтапной колориметрической процедуры. Образцы сначала инкубировали с известным количеством перекиси водорода, которую каталаза превращала в воду и молекулярный кислород. После прекращения ферментативной реакции остаточное количество перекиси водорода измеряли с помощью хромогенного реагента. Оптическую плотность регистрировали при 405 nm, а активность CAT выражали в U/mL. Для измерений в почечной ткани использовали левую почку каждого животного как смешанную ткань без разделения коркового и мозгового вещества. Как указано в процедуре, правая почка была оставлена исключительно для гистопатологической оценки. Образцы, принадлежащие отдельным животным, обрабатывали независимо и не объединяли ни на одном этапе. Каждый образец левой почки гомогенизировали на льду в 50 mM фосфатном буфере при pH 7.4, используя соотношение ткани к буферу 1:10 (масса/объем). Для каждой крысы готовили один индивидуальный гомогенат почечной ткани. Отдельные аликвоты этого гомогената использовали для различных измерений в почечной ткани, чтобы все параметры были получены от одного и того же животного. Полученные гомогенаты почечной ткани центрифугировали при 14,000 × g в течение 10 min при 4 °C. После центрифугирования супернатанты, полученные от каждого животного, собирали отдельно и разделяли на аликвоты для запланированных анализов почечной ткани. Концентрации фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α), интерлейкина-1 бета (IL-1β), интерлейкина-6 (IL-6), цистатина C и KIM-1 в супернатантах почечной ткани измеряли с помощью наборов для иммуноферментного анализа (ELISA), специфичных для крыс. Анализы проводили согласно протоколам производителя. Условия инкубации были идентичными для ELISA на TNF-α, IL-1β, IL-6, цистатин C и KIM-1. Для каждого анализа образцы и реагенты ELISA инкубировали в течение 1 h при 37 °C; после пяти циклов промывки добавляли растворы субстрата A и B и инкубировали в течение 10 min при 37 °C. Кратко: стандарты и супернатанты почечной ткани добавляли в лунки, предварительно покрытые антителами, затем добавляли соответствующее биотинилированное детектирующее антитело и конъюгат стрептавидин–пероксидаза хрена. После указанных этапов инкубации несвязавшиеся компоненты удаляли с помощью автоматического мойщика микропланшетов. Затем добавляли раствор субстрата и останавливали цветную реакцию кислым стоп-раствором. Оптическую плотность измеряли при 450 nm с помощью считывателя микропланшетов, а концентрации аналитов рассчитывали по соответствующим стандартным кривым. Измерения методом ELISA в почечной ткани проводили в дублетах. Для каждого аналита рассчитывали среднее значение двух технических повторов в лунках, чтобы получить одно значение на уровне животного. Технические повторы в лунках и отдельные аликвоты, полученные из одного и того же индивидуального гомогената, не считались независимыми наблюдениями. Все биохимические измерения проводили в стандартизированных условиях, специфичных для каждого анализа. Образцы сыворотки, крови с ЭДТА-антикоагулянтом и почечной ткани обрабатывали отдельно в соответствии с требованиями соответствующих аналитических методов. Исследователи, проводившие биохимический анализ, не знали о распределении животных по группам. Экспериментальной единицей считалось отдельное животное, а не каждый образец сыворотки, образец крови, образец почки, аликвота гомогената или технический повтор в лунке. Соответственно, в статистический анализ для каждой экспериментальной группы было включено шесть независимых наблюдений на уровне животных.

Гистопатологическая обработка и оценка

Образцы правой почки подготавливали для микроскопического исследования с помощью стандартной гистологической обработки. Всю правую почку каждого животного погружали в 10% нейтральный буферизованный формальдегид на 72 ч при комнатной температуре. После фиксации проводили последовательную дегидратацию тканей в 50%, 70%, 80%, 96% и 100% этаноле, выдерживая в каждой концентрации по 1 ч. Затем образцы подвергали воздействию двух ксилоловых ванн по 30 мин в каждой перед заливкой в парафин. С помощью ротационного микротома из парафиновых блоков изготавливали срезы толщиной 5 µm, включающие как корковое вещество, так и внешнюю часть мозгового вещества почки.

Для окрашивания гематоксилином и эозином (HE) срезы подвергли депарафинизации и регидратации, выдержали в гематоксилине в течение 5 min, после чего промывали под проточной водой еще 5 min. Для дифференцировки использовали кислый спирт, после чего срезы подвергали подкрашиванию в аммиачной воде в течение 1 min и контрастировали эозином в течение 2 min. Окрашенные срезы затем подвергали дегидратации в спиртах возрастающей концентрации, просветляли ксилолом и заключали в перманентный препарат под покровными стеклами.

Срезы, предназначенные для окрашивания трихромом по Массону, аналогичным образом подвергали депарафинизации и регидратации. Обработку протравой проводили в течение 60 min при 56 °C, после чего срезы промывали под проточной водопроводной водой в течение 10 min. Затем срезы последовательно обрабатывали железным гематоксилином по Вайгерту в течение 10 min, раствором анилинового красного и кислого фуксина в течение 15 min, раствором фосфовольфрамовой кислоты в течение 10 min и раствором анилинового синего в течение 10 min. После погружения в 1% раствор уксусной кислоты на 5 min срезы дегидратировали, просветляли в ксилоле и заключали под покровные стекла.

Перед микроскопической оценкой адекватность окрашивания проверяли отдельно для каждого метода. Срезы, окрашенные гематоксилином и эозином (HE), считались подходящими, если ядерные детали и цитоплазматический контраст были четко различимы, в то время как срезы, окрашенные трихромом по Массону, принимались, если структуры соединительной ткани могли быть отчетливо визуализированы. Для каждого животного исследовали три HE-окрашенных среза и три среза, окрашенных трихромом по Массону. В каждом срезе оценивали пять случайно выбранных микроскопических полей с использованием объектива 40×. Таким образом, для каждого животного исследовали по 15 микроскопических полей для каждого метода окрашивания. Все микроскопические исследования проводились с использованием одного и того же объектива и при стандартизированных условиях оценки для всех животных и экспериментальных групп. Срезы, окрашенные трихромом по Массону, оценивали качественно по распределению и отложению интерстициального коллагена, накоплению внеклеточного матрикса и тубулоинтерстициальной архитектуре. Эти срезы не использовались для получения полуколичественных баллов гистопатологического повреждения от 0 до 3. Репрезентативные фотомикрографии окраски HE и трихромом по Массону были получены с помощью объектива 40×, и в каждое репрезентативное изображение была включена масштабная линейка 100 µm. Эти фотомикрографии были получены в иллюстративных целях и не рассматривались как независимые наблюдения при гистопатологическом подсчете баллов или статистическом анализе. Все гистопатологические оценки проводились одним опытным патологом, который не знал принадлежности животных к экспериментальным группам. Использование одного слепого эксперта было направлено на ограничение систематической ошибки оценки и вариабельности, связанной с различиями между наблюдателями. Тубулярный некроз, дилатация канальцев, клеточная дегенерация и сосудистая конгестия оценивались полуколичественно на HE-окрашенных срезах почек в соответствии с системой, адаптированной из ранее опубликованных моделей повреждения почек^28,29. Для каждого параметра баллы варьировали от 0 до 3, что соответствовало отсутствию, легкому, умеренному и тяжелому гистопатологическому повреждению соответственно. Для каждого животного данные пяти микроскопических полей, исследованных в каждом из трех HE-окрашенных срезов (всего 15 полей), рассматривались в совокупности для присвоения одного балла от 0 до 3 по каждому гистопатологическому параметру. Таким образом, для каждого животного был получен один балл для тубулярного некроза, дилатации канальцев, клеточной дегенерации и сосудистой конгестии. Гистологические срезы и микроскопические поля рассматривались как внутриживотные подвыборки и не считались независимыми наблюдениями. В каждом срезе микроскопические поля выбирались случайным образом из сопоставимых областей коркового вещества и наружного мозгового слоя почек для стандартизации анатомического отбора во всех животных и экспериментальных группах. Экспериментальной единицей считалось отдельное животное, а не каждая почка, гистологический срез или микроскопическое поле. Соответственно, в статистический анализ для каждой экспериментальной группы было включено шесть независимых наблюдений на уровне животных. Значения, представленные в Table 3, представляют собой групповые средние, рассчитанные на основе индивидуальных баллов шести животных в каждой экспериментальной группе.

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения для статистического анализа. В качестве экспериментальной единицы для всех видов статистического анализа рассматривали отдельное животное. Каждая экспериментальная группа состояла из шести независимых животных (n = 6 на группу). Технические повторности, лунки анализа, срезы тканей и микроскопические поля не рассматривались как независимые наблюдения и не использовались для увеличения объема статистической выборки. Непрерывные переменные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD). Нормальность распределения оценивали отдельно для каждой экспериментальной группы с помощью критерия Шапиро–Уилка, а однородность дисперсий — с помощью критерия Ливена. С учетом полностью сбалансированного дизайна эксперимента с равным объемом выборок в группах для сравнения групп использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA). Попарные сравнения проводили с помощью апостериорного критерия множественных сравнений Данкана. Потенциальные выбросы оценивали путем графического анализа диаграмм размаха («ящиков с усами») и изучения отдельных наблюдений. Ни одно наблюдение не было расценено как ошибка измерения или недостоверный результат эксперимента, и ни одна точка данных не была исключена по статистическим основаниям. Значение p < 0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Маркеры функции почек в сыворотке (мочевина, азот мочевины крови и креатинин)

Экспериментальный план, распределение животных на группы, график введения препаратов и временная шкала сбора образцов в настоящем исследовании представлены на Рисунке 1. Между группами были выявлены статистически значимые различия по уровням мочевины в сыворотке, азота мочевины в крови (BUN) и креатинина (p = 0.003, p = 0.003 и

Обсуждение

В данном экспериментальном исследовании CI-AKI оценивалось воздействие терапии монтелукастом, NAC или их комбинацией после введения контрастного вещества по показателям функции почек, параметрам окислительного стресса, воспалительным реакциям, биомаркерам повреждения почек и гистопатологическим результатам. Воздействие контрастного вещества привело к существенному повышению уровней мочевины в сыворотке крови, азота мочевины крови (BUN) и креатинина, что сопровождалось неблагоприятными изменениями параметров окислительног...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Автоматический промыватель стрипов	Bio-Tek Instruments, США	ELx50	Автоматизированная промывка планшетов для ИФА.
Считыватель микропланшетов	Bio-Tek Instruments, США	ELx800	Измерение оптической плотности при ИФА. RRID:SCR_028651
10% нейтральный буферный формалин	Merck	Не записано	Фиксация тканей для гистопатологического исследования.
Настольная центрифуга	Nüve	NF048	Подготовка образцов и центрифугирование.
Карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ)	Sigma-Aldrich, США	C5678	Растворитель, используемый для приготовления суспензии монтелукаста.
Универсальный набор CAT Kit	Otto Scientific	Otto3051	Колориметрическое измерение активности КАТ в сыворотке крови с использованием биохимического анализатора Mindray BS-400.
Цифровой гомогенизатор	Daihan Scientific	HG-15D	Гомогенизация тканей.
Эозин Y (желтоватый)	Merck	1.15935.0025	Окрашивание гематоксилином и эозином.
Раствор гематоксилина по Харрису	BSLAB	BS-002	Окрашивание гематоксилином и эозином.
Индометацин	Sigma-Aldrich, США	I7378	Используется для индукции контраст-индуцированного острого повреждения почек (CI-AKI).
Иогексол (Omnipaque 300)	GE HealthCare	Не записано	Контрастное вещество, используемое для индукции контраст-индуцированной острой болезни почек (CI-AKI).
Кетамина гидрохлорид (Ketalar)	Pfizer, США	Не записано	Общая анестезия перед сбором образцов.
Световой микроскоп (Nikon Eclipse)	Nikon	Ni-U	Гистопатологическое исследование и визуализация. RRID:SCR_024835
L-NAME (Nω-nitro-L-arginine methyl ester)ω-нитро-L-аргининметиловый эфир)	Sigma-Aldrich, США	N5751	Используется для индуцирования контраст-индуцированной острой болезни почек (КИ-ОБП).
Набор для окрашивания по методу трихромного окрашивания Массона	MOSLAB, TüТурция	BKMTO001	Окрашивание по методу трехцветного окрашивания по Массону.
Биохимический анализатор Mindray	Mindray	BS-400	Биохимические анализы.
Монтелукаста натрий	Sigma-Aldrich, США	SML0101	Вводили перорально с помощью зонда в качестве терапии.
N-ацетилцистеин (ASIST 300 мг/2 мл)	МАК <альт-текст изображения="Уравнение 1" Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода."/files/ftp_upload/73087/73087eq1.jpg" стиль="margin: auto;"/>Пожалуйста, предоставьте текст для перевода.ç, TüТурция	Не записано	Вводили внутрибрюшинно в качестве лечения.
Набор для ИФА цистатина C крысы	Лаборатория BT, Китай	E0145Ra	Измерение уровня цистатина С в супернатантах ренальных тканей методом ИФА.
ИЛ-1 крысыβ Набор для ИФА	Лаборатория BT, Китай	E0119Ra	Измерение уровня IL-1 методом ИФАβ в супернатантах тканей почек.
Набор для ИФА IL-6 крысы	BT Lab, Китай	E0135Ra	Измерение уровня ИЛ-6 в супернатантах тканей почек методом ИФА.
Набор для ИФА на KIM-1 крысы	Лаборатория BT, Китай	E0549Ra	ИФА-измерение уровня KIM-1 в супернатантах тканей почек.
ФНО крысыα Набор для ИФА	Лаборатория BT, Китай	E0764Ra	Измерение уровня ФНО-α методом ИФАα в супернатантах тканей почек.
Игла для кормления из нержавеющей стали (канюля для перорального зондирования 22 G)	Instech Laboratories, США	Не записано	Пероральное зондовое введение.
Стандартный гранулированный корм для грызунов (Optima)	Optima, TüТурция	Не записано	Партия № 58931. Пищевая ценность: 24% сырого белка, 3,94% сырой клетчатки, 5,08% сырого жира, 8,8% сырой золы, 1,44% лизина, 0,61% метионина, 1,14% кальция, 0,89% фосфора и 0,28% натрия.
Универсальный набор для определения креатинина	Otto Scientific	OttoBC139	Колориметрическое определение содержания креатинина в сыворотке крови.
Универсальный набор для определения GSH	Otto Scientific	Otto3053	Колориметрическое определение содержания GSH в крови с ЭДТА-антикоагулянтом с использованием модифицированного метода Эллмана.
Универсальный набор для MDA	Otto Scientific	Otto1001	Колориметрическое определение содержания МДА в сыворотке крови с использованием микропланшетного ридера ELx800.
Универсальный набор для определения СОД	Otto Scientific	Otto3047	Колориметрическое измерение активности СОД в сыворотке крови с использованием биохимического анализатора Mindray BS-400.
Универсальный набор для определения мочевины	Otto Scientific	OttoBC157	Колориметрическое определение содержания мочевины и азота по мочевине крови (BUN) в сыворотке.
Ксилазина гидрохлорид (Rompun)	Bayer, Германия	Не записано	Общий наркоз перед забором образцов.