Исследовательская статья

Капсулы Янцзин облегчают нарушение сперматогенеза у мышей путем ингибирования пути QKI-5/p38 MAPK посредством повышения экспрессии lncRNA NONMMUT031883.2

11 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/73166

⸱

28 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Andrology, The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine/Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine, 2Medical College of Qinghai University, 3Department of Traditional Chinese Medicine, Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 4Anorectal Surgery, Jiangbei Branch of Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 5Department of Andrology, Shaanxi Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

В этой статье

Краткое содержание

В данном исследовании оценивается защитный эффект капсул Янцзин при индуцированной циклофосфамидом сперматогенной дисфункции у мышей, а также изучается участие сигнального пути lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK.

Аннотация

Нарушение сперматогенеза является важной причиной мужского бесплодия, и циклофосфамид (CP) может ухудшать сперматогенез, индуцируя аномальный апоптоз сперматогоний. Капсулы Янцзин (YC) используются для улучшения репродуктивной функции, однако лежащий в основе этого молекулярный механизм остается неясным. В данной работе исследовались защитные эффекты YC на мышиной модели сперматогенной дисфункции, индуцированной CP, а также на сперматогониальных клетках GC-1. Оценивались количество и подвижность сперматозоидов, фертильность самцов, уровни половых гормонов в сыворотке крови, а также гистопатологические изменения в семенниках и придатках семенников. В клетках GC-1 оценивались жизнеспособность, высвобождение лактатдегидрогеназы, апоптоз и экспрессия белков, связанных с апоптозом. Количественная обратная транскрипционная полимеразная цепная реакция, анализы RNA pull-down, иммунофлуоресценция и вестерн-блоттинг использовались для изучения lncRNA NONMMUT031883.2, Quaking-5 (QKI-5) и сигналинга p38 митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK). YC дозозависимо улучшали качество спермы, уровни половых гормонов в сыворотке, морфологию репродуктивных органов, гистопатологию семенников и фертильность у мышей, получавших CP. В клетках GC-1 YC повышали жизнеспособность клеток, снижали повреждение клеток и уровень апоптоза. LncRNA NONMMUT031883.2 физически взаимодействовала с QKI-5, и лечение YC повышало экспрессию lncRNA NONMMUT031883.2, одновременно снижая экспрессию QKI-5 и фосфорилирование p38. Применение YC подавляло апоптоз, индуцированный нокдауном lncRNA NONMMUT031883.2 в клетках GC-1, тогда как гиперэкспрессия QKI-5 снижала антиапоптотический эффект YC. Эти результаты свидетельствуют о том, что YC облегчает индуцированную CP сперматогенную дисфункцию и что ее защитные эффекты опосредованы регуляцией пути lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK.

Введение

Сперматогенная дисфункция представляет собой нарушение репродуктивной функции, вызванное отклонениями в процессах продукции, созревания или функционирования сперматозоидов в мужской репродуктивной системе. Она характеризуется снижением количества и подвижности сперматозоидов, а также повышенной частотой их морфологических нарушений1,2. Патогенез сперматогенной дисфункции сложен и связан с генетическими факторами, аутоиммунными заболеваниями, воздействием токсинов окружающей среды, повреждениями, вызванными химиотерапией, и поражениями органов репродукции3-5. Химиотерапевтические препараты, такие как циклофосфамид (CP), могут напрямую повреждать семенные канальцы яичек и индуцировать апоптоз сперматогониев, способствуя тем самым развитию сперматогенной дисфункции у мужчин6,7. В настоящее время в качестве клинических методов лечения используются заместительная гормональная терапия, прием антиоксидантов и вспомогательные репродуктивные технологии. Однако данные подходы обладают нестабильной эффективностью и значительными побочными эффектами8,9,10. Следовательно, поиск безопасных и эффективных методов вмешательства и выяснение их молекулярных мишеней имеют важное клиническое значение для улучшения показателей фертильности у пациентов со сперматогенной дисфункцией.

Китайская лекарственная трава продемонстрировала потенциал в защите репродуктивной функции у самцов и лечении сперматогенной дисфункции благодаря своим многоцелевым свойствам и относительно низкой токсичности11,12. Капсула Янцзин (YC) представляет собой традиционное китайское запатентованное лекарственное средство, состоящее из Rehmannia glutinosa, Epimedium, плаценты, Polygonatum sibiricum, Angelica sinensis и других китайских лекарственных трав. Она используется для укрепления почек и эссенции, питания крови и костного мозга, а также для регуляции репродуктивной функции13. Предыдущие исследования показали, что YC может регулировать уровни половых гормонов у самцов животных, улучшать качество спермы, восстанавливать поврежденную ткань семенников и защищать от репродуктивных повреждений, вызванных химическими агентами14,15. Сперматогонии лежат в основе сперматогенеза, и аномальный апоптоз сперматогоний является центральным событием в развитии сперматогенной дисфункции16. Также сообщалось, что YC улучшает жизнеспособность сперматогоний, увеличивает долю клеток в S-фазе и ингибирует апоптоз17. Однако ее защитные эффекты и специфические молекулярные механизмы при сперматогенной дисфункции, индуцированной CP, остаются неясными.

Длинные некодирующие РНК (днКРНК) представляют собой молекулы РНК длиной более 200 нуклеотидов, которые не обладают способностью кодировать белки18. днКРНК могут регулировать экспрессию генов с помощью таких механизмов, как хромосомный сайленсинг, модификация хроматина, геномный импринтинг и транскрипционная активация19,20. РНК-связывающий белок Quaking-5 (QKI-5) участвует в физиологических и патологических процессах, включая пролиферацию и апоптоз клеток, регулируя альтернативный сплайсинг нижележащих генов21. Путь митоген-активируемой протеинкиназы p38 (MAPK) участвует в регуляции апоптоза, а также играет важную роль в мужской фертильности и развитии яичек22,23. Предыдущее исследование показало, что гиперэкспрессия QKI-5 активирует путь p38 MAPK в клетках гепатоцеллюлярной карциномы24. Кроме того, было показано, что днКРНК NONMMUT074098.2 связывается с QKI-5 в сперматогониях, тогда как нокдаун QKI-5 подавлял путь p38 MAPK и снижал апоптоз сперматогоний25. В данной работе использовалась мышиная модель сперматогенной дисфункции, индуцированной CP, чтобы исследовать, регулирует ли YC экспрессию днКРНК NONMMUT031883.2 и сигнальную ось QKI-5/p38 MAPK, тем самым снижая аномальный апоптоз сперматогоний и облегчая индуцированную CP сперматогенную дисфункцию (Рисунок 1). Целью работы было выяснение молекулярного механизма, лежащего в основе защитного действия YC на сперматогенез, и расширение понимания его фармакологической роли в защите репродуктивной функции самцов.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Схематическая диаграмма дизайна эксперимента.Верхняя панель обобщает эксперименты in vitro на сперматогониальных клетках GC-1. Нокдаун lncRNA NONMMUT031883.2 использовался для индукции апоптоза и повреждения клеток, после чего следовал нокдаун QKI-5 для оценки его влияния на апоптоз и повреждение клеток. Нижняя панель обобщает эксперименты in vivo на моделях мышей с дисфункцией сперматогенеза, индуцированной циклофосфамидом (CP). Мыши получали лечение капсулами Yangjing и/или интервенцию с lncRNA NONMMUT031883.2 или QKI-5. Впоследствии оценивались фертильность, уровни гормонов в сыворотке крови, ткани семенников и придатоков семенников, суспензия сперматозоидов, запасы сперматозоидов, качество спермы и гистопатологические повреждения семенников. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот рисунок в большем размере.

Протокол

All animal experiments were performed in accordance with the ARRIVE guidelines and the National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. All experimental protocols were reviewed and approved by the Animal Ethics Committee of Southeast University (approval no. 20230216022).

1. Preparation of YC-containing serum
Two Yangjing Capsules (YC; 0.5 g/capsule) were opened, and 0.8 g of the capsule contents was weighed. Normal saline was added to a final volume of 10 mL, and the mixture was vortexed thoroughly to prepare an 80 mg/mL suspension. Specific pathogen-free male BALB/c mice weighing 22–25 g and aged 8 weeks were maintained at 22 °C and 55%–60% humidity under a 12 h light/dark cycle, with food and water provided ad libitum. After 1 week of acclimatization, the mice received YC by oral gavage at 800 mg/kg body weight in a volume of 10 mL/kg once daily for 5 consecutive days. Two hours after the final administration, the mice were anesthetized with intraperitoneal 1% sodium pentobarbital, and blood samples were collected to prepare YC-containing serum. The serum was inactivated at 56 °C for 30 min, filtered through a 0.22 µm membrane, and stored at −80 °C until use.

2. Cell culture and transfection
Mouse GC-1 spermatogonial cells were maintained in DMEM containing 1% penicillin-streptomycin and 10% fetal bovine serum. All cultures were maintained at 37 °C in an atmosphere containing 5% CO₂ (v/v).

LncRNA-specific short hairpin RNA (sh-lncRNA), a QKI-5 overexpression plasmid (OE-QKI-5), QKI-5 small interfering RNA (si-QKI-5), and their corresponding negative controls (sh-NC, OE-NC, and si-NC) were synthesized and constructed. GC-1 cells were transfected with sh-lncRNA or sh-NC, si-QKI-5 or si-NC, or OE-QKI-5 or OE-NC according to the transfection reagent instructions. After incubation for 48 h, transfection efficiency was assessed by measuring lncRNA NONMMUT031883.2 or QKI-5 expression.

For the sh-lncRNA + si-QKI-5 + etoposide group, GC-1 cells were transfected with sh-lncRNA and si-QKI-5 and subsequently treated with 100 µM etoposide for 12 h26. For subsequent cell viability assays, GC-1 cells were cultured in medium supplemented with 5%, 10%, or 20% YC-containing serum and designated as the low-dose YC (L-YC), medium-dose YC (M-YC), and high-dose YC (H-YC) groups, respectively. The concentrations of YC-containing serum (5%, 10%, and 20% YC) were determined based on the results of preliminary concentration-gradient experiments. For the sh-lncRNA + H-YC + OE-NC and sh-lncRNA + H-YC + OE-QKI-5 groups, GC-1 cells were transfected with sh-lncRNA plus OE-NC or sh-lncRNA plus OE-QKI-5 for 48 h and then exposed to 20% YC-containing serum for 24 h.

3. Cell Counting Kit-8 assay
GC-1 cells were seeded into 96-well plates at 5 × 103 cells/well and cultured for 24 h. After cell attachment, the original medium was replaced with 100 µL of complete medium supplemented with YC-containing serum, and the cells were incubated for 6, 12, or 24 h. After incubation, 10 µL of Cell Counting Kit-8 reagent was added to each well, and the cells were incubated at 37 °C in darkness for 2 h. Absorbance at 450 nm was measured using a microplate reader.

4. Lactate dehydrogenase assay
Following transfection with sh-NC or sh-lncRNA for 48 h, the GC-1 cell culture medium was collected, and the supernatant was obtained by centrifugation. According to the lactate dehydrogenase assay kit instructions, the supernatant was gently mixed with the detection working solution and transferred to a 96-well plate. The plate was incubated at 25 °C in darkness for 30 min. Absorbance at 490 nm was measured using a microplate reader, and lactate dehydrogenase release was calculated to assess cell damage.

5. Calcein AM/propidium iodide staining
After transfection with sh-NC or sh-lncRNA for 48 h, GC-1 cell survival was assessed using Calcein AM/propidium iodide (PI) staining. Cells were seeded into 12-well plates at 5 × 104 cells/well and cultured until they reached 60%–70% confluence. The cells were gently rinsed with phosphate-buffered saline, and 500 µL of Calcein AM/PI staining solution was added to each well. The cells were incubated at 37 °C in darkness for 30 min and observed under a fluorescence microscope. Live and dead cells were counted using image-analysis software, and the proportion of surviving cells was calculated.

6. Flow cytometry
GC-1 cells were collected by centrifugation and gently rinsed with phosphate-buffered saline. The cell pellet was resuspended in 500 µL of binding buffer at a density of 5 × 105 cells/mL. Annexin V-APC and PI were then added at 5 µL each, and the suspension was mixed thoroughly and incubated at 25 °C in darkness for 10 min. Apoptosis was analyzed by flow cytometry using excitation/emission wavelengths of 633/660 nm for APC and 488/630 nm for PI. The apoptosis rate was evaluated using flow cytometry analysis software.

7. Caspase-3 activity assay
After the indicated treatments, approximately 1 × 106 GC-1 cells were collected, rinsed, and resuspended in phosphate-buffered saline. The cells were mixed with 100 µL of reagent II from the caspase-3 activity assay kit and lysed on ice for 15 min. Following centrifugation, 50 µL of the lysate supernatant was collected and mixed with 40 µL of reagent I and 10 µL of reagent III. The mixture was incubated at 37 °C for 2 h. Absorbance at 405 nm was measured using a microplate reader, and caspase-3 activity was evaluated according to the kit instructions.

8. RNA pull-down assay
The sense and antisense strands of lncRNA NONMMUT031883.2 were synthesized according to the corresponding sequence and labeled with biotin. Cells were lysed in immunoprecipitation cell lysis buffer on ice for 30 min, and the protein-containing supernatant was collected by centrifugation. Streptavidin magnetic beads were washed three times with RNA-binding buffer and incubated in binding buffer containing 1% bovine serum albumin for 30 min.

The pretreated beads were combined with the biotin-labeled probes and incubated at 25 °C for 30 min. Unbound probes were removed by magnetic separation. The cell lysate supernatant was then added, and the mixture was incubated at 4 °C for 4 h to form magnetic bead-RNA-protein complexes. The magnetic beads were washed three times with washing buffer to remove nonspecifically bound proteins. The washing buffer was removed by magnetic separation, and 2× SDS sample-loading buffer was added. The samples were heated at 95 °C for 10 min, and the supernatant was collected by magnetic separation for subsequent Western blot analysis.

9. Construction of a mouse model of spermatogenic dysfunction
After 5 days of acclimatization, specific pathogen-free male BALB/c mice weighing 22–25 g and aged 8 weeks received cyclophosphamide (CP) intraperitoneally at 50 mg/kg once daily for 7 days to establish a spermatogenic dysfunction model14,27. Successfully modeled mice were randomly assigned using a random-number table to the CP, 200 mg/kg YC, 400 mg/kg YC, 800 mg/kg YC, 800 mg/kg YC + sh-NC, and 800 mg/kg YC + sh-lncRNA groups, with six mice in each group.

Mice in the YC-treated groups received the corresponding dose of YC by oral gavage once daily for 30 days13. For the 800 mg/kg YC + sh-NC and 800 mg/kg YC + sh-lncRNA groups, after successful model establishment, the mice were anesthetized by inhalation of 2% isoflurane. After confirming that each mouse showed no foot withdrawal reflex and that the respiratory rate was stable, the surgical site was shaved and disinfected with povidone-iodine. Under aseptic conditions, a ventral midline incision was made through the skin and body wall anterior to the genitalia. The testis was exposed by carefully manipulating the epididymal fat pad, with care taken to avoid vascular damage. Using a micromanipulator, the seminiferous tubules were visualized, and 1 µL of the adenoviral suspension (1 × 1010 TU/mL) was slowly injected using a microinjection needle28. The needle was left in place for 5 min after injection before being slowly withdrawn, and hemostasis was achieved with a sterile cotton swab. The same procedure was subsequently performed on the contralateral testis. The incision was then sutured, and the mice were allowed to recover on a warming pad postoperatively. Control mice received an equal volume of saline solution by gavage and injection daily.

10. Assessment of fertility
After completion of drug administration, male mice in each group were mated freely with female BALB/c mice at a ratio of 1:2 for 7 days. Vaginal plug formation in the female mice was monitored and recorded daily. After successful mating was confirmed, the male mice were removed, and the female mice were housed individually until natural delivery. Nine pregnant female mice per group were obtained and included in the analysis. The average litter size was recorded to evaluate male fertility in each group.

At the end of the experimental period, the mice were euthanized by intraperitoneal administration of pentobarbital sodium at 100 mg/kg. This euthanasia method was approved by the Animal Ethics Committee of Southeast University (approval no. 20230216022). The testes and epididymides were carefully separated, photographed, and weighed. The testis and epididymis indices were calculated as organ weight/body weight. One epididymis from each mouse was collected, cut into pieces, placed in 1 mL of prewarmed phosphate-buffered saline (37 °C), and incubated for 20 min to allow sperm to swim out29. The sperm suspension was gently mixed, and 10 µL of the sperm suspension was placed on a preheated blood cell counting plate. Sperm were counted manually under a light microscope at 200× magnification, and the results were expressed as 106/L. Furthermore, the percentage of progressively motile spermatozoa relative to the total number of spermatozoa was calculated as sperm motility13.

11. Determination of sex hormone levels
Blood was collected from the orbital vein of mice in each group and allowed to stand at 25 °C for 30 min. Serum was collected by centrifugation at 3,000 × g for 10 min30. Serum testosterone, luteinizing hormone (LH), and follicle-stimulating hormone (FSH) levels were measured using the corresponding enzyme-linked immunosorbent assay kits.

12. RNA stability assay
GC-1 cells were seeded into 96-well culture plates, transfected with si-QKI-5 or si-NC, and cultured for 48 h. Actinomycin D was then added at 5 µg/mL, and the cells were collected at 0, 3, 6, and 9 h. Total RNA was isolated, and the relative expression level of lncRNA NONMMUT031883.2 was determined by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction following reverse transcription. The relative RNA level at each time point was calculated using the expression level at 0 h as 100%.

13. Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction
GC-1 cells and mouse testicular tissues were rinsed with phosphate-buffered saline and lysed for total RNA isolation. Complementary DNA was generated by reverse transcription using AMV reverse transcriptase. Polymerase chain reaction amplification was performed using a real-time PCR system and a quantitative PCR kit, with complementary DNA used as the amplification template. U6 was used as the internal reference for lncRNA NONMMUT031883.2, and GAPDH was used as the internal reference for QKI-5. Relative target-gene expression was calculated using the 2−ΔΔCt method25. RNA was also isolated separately from the cytoplasmic and nuclear fractions to determine the subcellular localization of lncRNA NONMMUT031883.2. The primer sequences are provided in Table 1.

GeneForward primer (5' to 3')Reverse primer (5' to 3')
QKI-5CTGTCATGCCAAACGGAACGATGGACACGCATATCGTG
GAPDHAGGTCGGTGTGAACGGATTTGTGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA
lncRNA NONMMUT031883.2CCACTGTGGCACATTGAAGTATTAAGTTAATGGGTGCTGTGTT
U6 RNACTCGCTTCGGCAGCACAAACGCTTCACGAATTTGCGT

Table 1: Primer sequences used for quantitative reverse transcription polymerase chain reaction. Forward and reverse primer sequences are listed in the 5′–3′ direction for lncRNA NONMMUT031883.2, QKI-5, U6, and GAPDH.

14. Hematoxylin and eosin staining
Mouse testicular and epididymal tissues were immersed in 4% paraformaldehyde and fixed at 4 °C for 24 h. After rinsing with phosphate-buffered saline, the tissues were dehydrated through a graded ethanol series, embedded in paraffin, and sectioned at 5 µm. The sections were heated at 60 °C for 60 min and dewaxed in xylene for 30 min.

After hydration through a graded ethanol series, the sections were stained with hematoxylin for 5 min, treated with hydrochloric acid-ethanol differentiation solution for 10 s, washed with tap water for bluing, and stained with 1% eosin for 2 min. The sections were then dehydrated in 95% ethanol and absolute ethanol and cleared in xylene for 30 min. After air-drying, the sections were mounted with neutral gum. Morphological changes in the testes and epididymides were observed under a microscope.

15. Immunofluorescence
Mouse testicular paraffin sections were dewaxed and hydrated through a graded ethanol series, followed by microwave-mediated antigen retrieval in citrate buffer at pH 6.0. After cooling naturally to room temperature, the sections were incubated with 0.3% Triton X-100 for 10 min. The sections were blocked with 5% bovine serum albumin at 25 °C for 60 min, rinsed with phosphate-buffered saline, and incubated overnight at 4 °C with a primary antibody against Ki67. The following day, a fluorochrome-labeled secondary immunoglobulin G antibody was applied, and the sections were incubated at 37 °C in darkness for 60 min. After rinsing with phosphate-buffered saline, the sections were counterstained with DAPI for 10 min and observed under a fluorescence microscope. Fluorescence intensity was analyzed using image-analysis software.

For immunofluorescence staining of GC-1 cells, the cells were seeded into 12-well plates at 1 × 105 cells/well and incubated for 24 h. The cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 30 min, permeabilized with 0.3% Triton X-100 for 10 min, blocked with 5% bovine serum albumin, and incubated overnight at 4 °C with a primary antibody against QKI-5. The remaining procedure was performed as described for the testicular tissue sections.

16. TUNEL staining
Mouse testicular paraffin sections were dewaxed, hydrated through a graded ethanol series, and incubated with 0.1% Triton X-100 for 5 min to increase cell membrane permeability. Proteinase K working solution at 20 µg/mL without DNase was applied uniformly to the sections, which were then incubated at 37 °C for 15 min. TUNEL detection solution was added, and the sections were incubated at 37 °C in darkness for 90 min. After incubation with DAPI for 10 min, antifade mounting medium was applied, and the testicular tissue was observed under a fluorescence microscope.

GC-1 cells were seeded into 12-well plates and fixed with 4% paraformaldehyde for 30 min. After permeabilization with 0.1% Triton X-100 for 5 min, TUNEL detection solution was applied to the cells, followed by incubation in darkness for 60 min. The cells were then stained with DAPI for 10 min and observed under a fluorescence microscope.

17. Western blotting
Mouse testicular tissues and GC-1 cells were lysed in immunoprecipitation cell lysis buffer on ice for 30 min and disrupted by ultrasonication. After centrifugation, the protein-containing supernatant was collected, and protein concentration was determined using a bicinchoninic acid assay kit. The protein supernatant was mixed with SDS loading buffer and heated in boiling water for 10 min. After separation by gel electrophoresis, the proteins were transferred to polyvinylidene fluoride membranes and blocked with 5% bovine serum albumin for 2 h31.

The membranes were incubated overnight at 4 °C with primary antibodies against cleaved caspase-3 (1:500), Bcl-2 (1:1000), caspase-3 (1:2000), Bax (1:500), QKI-5 (1:1000), phosphorylated p38 (1:1000), or p38 (1:500). On the following day, the membranes were rinsed with Tris-buffered saline containing Tween 20 and incubated with goat anti-rabbit immunoglobulin G at 1:10000 for 2 h at 25 °C. The enhanced chemiluminescence working solution was applied to the membrane surface, and the protein bands were imaged with a gel imaging system. Band intensity was analyzed using image-analysis software, and relative protein expression was normalized to GAPDH (1:3000).

Cycloheximide at 50 µg/mL was used to inhibit protein synthesis. To determine the half-life of QKI-5, cells were collected at 0, 3, 6, and 9 h, and QKI-5 protein levels were subsequently determined by Western blotting25.

18. Statistical analysis
All data were statistically analyzed and plotted using statistical, graphing, and image-analysis software. The Shapiro-Wilk test was used to assess data normality. Experimental data are presented as the mean ± standard deviation. One-way analysis of variance was used to evaluate differences among groups. The LSD-t test was used for post hoc pairwise comparisons when variances were homogeneous, whereas Dunnett’s T3 test was used when variances were heterogeneous. A value of p < 0.05 was considered statistically significant.

Результаты

Нокдаун lncRNA NONMMUT031883.2 индуцирует апоптоз сперматогоний
Клетки GC-1 были трансфицированы sh-lncRNA для подавления экспрессии lncRNA NONMMUT031883.2. По сравнению с клетками, трансфицированными sh-NC, уровень транскрипции lncRNA NONMMUT031883.2 заметно снизился после трансфекции sh-lncRNA, что подтверждает успешный нокдаун (Рисунок 2A). После нокдауна lncRNA NONMMUT031883.2 жизнеспособность клеток GC-1 значительно снизилась (Рисунок 2B), в то время как высвобождение LDH значительно увеличилось, что указывает на более выраженное повреждение клеток (Рисунок 2C). Окрашивание Calcein-AM/PI показало увеличение количества PI-положительных клеток GC-1 и снижение доли выживших клеток в группе sh-lncRNA (Рисунок 2D, E). Уровень апоптоза клеток GC-1 заметно повысился после нокдауна lncRNA NONMMUT031883.2 (Рисунок 2F, G). Доля TUNEL-положительных клеток также была значительно повышена в группе sh-lncRNA, что дополнительно указывает на усиление апоптоза (Рисунок 2H, I). Кроме того, нокдаун lncRNA NONMMUT031883.2 значительно увеличил активность каспазы-3 в клетках GC-1 (Рисунок 2J). В группе sh-lncRNA экспрессия Bax была заметно повышена, экспрессия Bcl-2 снизилась, а соотношение расщепленной каспазы-3 к каспазе-3 значительно возросло (Рисунок 2K, L). Эти результаты показывают, что нокдаун lncRNA NONMMUT031883.2 индуцирует апоптоз в клетках GC-1. Все количественные данные были получены при n = 6.

figure-results-1
Рисунок 2Нокдаун lncRNA NONMMUT031883.2 индуцирует апоптоз сперматогониев. (A) Количественный анализ экспрессии lncRNA NONMMUT031883.2 в клетках GC-1 методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени (qRT-PCR). (Б) Анализ жизнеспособности клеток GC-1 с помощью набора для подсчета клеток Cell Counting Kit-8 (CCK-8) после нокдауна lncRNA NONMMUT031883.2. (C) Высвобождение лактатдегидрогеназы (ЛДГ) из клеток GC-1 после нокдауна lncRNA NONMMUT031883.2. (D, E) Окрашивание клеток GC-1 кальцеином-AM и пропидийиодидом (PI) для оценки выживаемости клеток (20×; масштабная линейка, 100 µm). (F, G) Проточный цитометрический анализ апоптоза после нокдауна lncRNA NONMMUT031883.2. (H, I) Анализ клеток GC-1 методом терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы и маркировки разрывов dUTP (TUNEL) (40×; масштабная линейка, 50 µm). (J) Активность каспазы-3 после нокдауна lncRNA NONMMUT031883.2. (K, L) Вестерн-блот-анализ экспрессии Bcl-2, Bax, каспазы-3 и расщепленной каспазы-3 после трансфекции sh-lncRNA. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение; n = 6. ***p < 0,001 по сравнению с sh-NC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

LncRNA NONMMUT031883.2 взаимодействует с QKI-5
Взаимодействие между lncRNA NONMMUT031883.2 и QKI-5 было изучено для выяснения молекулярного механизма, лежащего в основе апоптоза сперматогоний. После разделения ядерной и цитоплазматической фракций анализ qRT-PCR показал, что lncRNA NONMMUT031883.2 локализована преимущественно в ядрах клеток GC-1 (Рисунок 3A). Иммунофлуоресцентный анализ показал, что QKI-5 также сосредоточен в ядре, что создает пространственную основу для взаимодействия между lncRNA NONMMUT031883.2 и QKI-5 (Рисунок 3B). Период полураспада lncRNA NONMMUT031883.2 измеряли после обработки актиномицином D, чтобы оценить, регулирует ли QKI-5 стабильность lncRNA. Нокдаун QKI-5 не оказал заметного влияния на период полураспада транскрипта lncRNA (Рисунок 3C). После ингибирования синтеза белка циклогексимидом нокдаун lncRNA NONMMUT031883.2 не изменил экспрессию белка QKI-5 (Рисунок 3D, E). Затем с помощью qRT-PCR оценивали эффективность захвата биотинилированного антисмыслового зонда, нацеленного на lncRNA NONMMUT031883.2. Антисмысловой зонд эффективно обогащал целевую lncRNA и, следовательно, был использован для последующего анализа RNA pull-down (Рисунок 3F). Метод RNA pull-down с последующим вестерн-блоттингом показал специфическое физическое взаимодействие между lncRNA NONMMUT031883.2 и QKI-5 (Рисунок 3G, H). Эти результаты указывают на то, что lncRNA NONMMUT031883.2 и QKI-5 колокализируются в ядрах клеток GC-1 и специфически взаимодействуют. Количественные данные на Рисунке 3C и Рисунке 3D, F были получены при n = 3, остальные количественные данные — при n = 6.

figure-results-2
Рисунок 3: LncRNA NONMMUT031883.2 взаимодействует с QKI-5. (A) Анализ распределения lncRNA NONMMUT031883.2 между ядром и цитоплазмой в клетках GC-1 методом qRT-PCR. (B) Иммунофлуоресцентный анализ субклеточной локализации QKI-5 в клетках GC-1 (40×; масштабная линейка, 50 µm). (C) Анализ периода полураспада lncRNA NONMMUT031883.2 методом qRT-PCR после обработки актиномицином D и нокдауном QKI-5 (n = 3). (D, E) Вестерн-блот анализ экспрессии белка QKI-5 после обработки циклогексимидом и нокдауном lncRNA NONMMUT031883.2 (n = 3). (F) Валидация эффективности обогащения с помощью биотинилированного антисмыслового зонда, нацеленного на lncRNA NONMMUT031883.2, методом qRT-PCR. (G, H) Анализ взаимодействия между lncRNA NONMMUT031883.2 и QKI-5 методами RNA pull-down и вестерн-блоттинга. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение; n = 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Нокдаун QKI-5 подавляет апоптоз сперматогоний путем ингибирования пути p38 MAPK
Была изучена роль QKI-5 и нижележащего пути p38 MAPK в апоптозе сперматогоний. После трансфекции si-QKI-5 уровни белка QKI-5 в клетках GC-1 значительно снизились, что подтвердило успешный нокдаун (Рисунок 4A, B). Нокдаун lncRNA NONMMUT031883.2 значительно увеличил соотношение p-p38/p38, тогда как одновременный нокдаун QKI-5 снизил это соотношение, что указывает на ингибирование активации пути p38 MAPK (Рисунок 4C, D). Нокдаун QKI-5 облегчил повреждение клеток GC-1, вызванное нокдауном lncRNA NONMMUT031883.2, в то время как обработка индуцирующим апоптоз этопозидом значительно снизила жизнеспособность клеток (Рисунок 4E). Нокдаун QKI-5 значительно снизил уровень апоптоза клеток GC-1, тогда как обработка этопозидом заметно увеличила апоптоз (Рисунок 4F, G). Трансфекция si-QKI-5 также значительно снизила активность каспазы-3, в то время как обработка этопозидом повысила активность каспазы-3 (Рисунок 4H). Нокдаун QKI-5 снизил экспрессию Bax, увеличил экспрессию Bcl-2 и значительно снизил соотношение расщепленной каспазы-3/каспазы-3, тогда как обработка этопозидом обратила эти паттерны экспрессии (Рисунок 4I, J). Эти результаты указывают на то, что нокдаун QKI-5 подавляет апоптоз в сперматогониях GC-1 путем ингибирования пути p38 MAPK. Все количественные данные были получены при n = 6.

figure-results-3
Рисунок 4: Нокдаун QKI-5 подавляет апоптоз сперматогоний путем ингибирования пути p38 MAPK. (A, B) Вестерн-блот анализ экспрессии QKI-5 в клетках GC-1 после трансфекции si-NC или si-QKI-5. (C, D) Вестерн-блот анализ экспрессии фосфорилированной p38 (p-p38) и общей p38. (E) Анализ жизнеспособности клеток GC-1 с помощью CCK-8 в различных группах обработки. (F, G) Проточный цитометрический анализ апоптоза после обработки этопозидом. (H) Активность каспазы-3 в различных группах обработки. (I, J) Вестерн-блот анализ экспрессии Bax, Bcl-2, каспазы-3 и расщепленной каспазы-3 в клетках GC-1. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение; n = 6. ***p < 0.001 по сравнению с si-NC или sh-NC; ###p < 0.001 по сравнению с sh-lncRNA; &&&p < 0.001 по сравнению с sh-lncRNA + si-QKI-5. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

YC подавляет апоптоз сперматогоний через путь lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK
После обработки клеток GC-1 сывороткой, содержащей YC, в течение 6, 12 и 24 ч жизнеспособность клеток постепенно увеличивалась по мере повышения концентрации YC и увеличения времени воздействия. Таким образом, эти концентрации были выбраны для последующих экспериментов с продолжительностью обработки 24 ч (Рисунок 5A). Обработка YC в течение 24 ч заметно повысила уровень транскрипции lncRNA NONMMUT031883.2 в клетках GC-1 (Рисунок 5B) и усилила ее способность к связыванию с QKI-5 (Рисунок 5C, D). После обработки YC экспрессия QKI-5 и соотношение p-p38/p38 в клетках GC-1 заметно снизились, что свидетельствует об ингибировании пути p38 MAPK (Рисунок 5E, F). Обработка YC также значительно снизила уровень апоптоза (Рисунок 5G, H), уменьшила активность каспазы-3 (Рисунок 5I), повысила экспрессию Bcl-2, а также снизила экспрессию Bax и соотношение расщепленной каспазы-3/каспазы-3 (Рисунок 5J, K).

Для дальнейшей оценки специфичности пути клетки GC-1 были трансфицированы OE-NC или OE-QKI-5. Экспрессия белка QKI-5 была значительно повышена в клетках, трансфицированных OE-QKI-5, что подтвердило успешную сверхэкспрессию (Рисунок 5L, M). Нокдаун lncRNA NONMMUT031883.2 значительно снизил жизнеспособность клеток, в то время как обработка YC обратила этот эффект. Сверхэкспрессия QKI-5 ослабила цитопротекторный эффект YC (Рисунок 5N). Обработка YC также снизила апоптоз, вызванный нокдауном lncRNA NONMMUT031883.2 (Рисунок 5O, P), уменьшила активность каспазы-3 (Рисунок 5Q), снизила экспрессию Bax, повысила экспрессию Bcl-2 и уменьшила соотношение расщепленной каспазы-3/каспазы-3 (Рисунок 5R, S). Напротив, сверхэкспрессия QKI-5 ослабила антиапоптотические эффекты YC. Эти результаты указывают на то, что YC активирует lncRNA NONMMUT031883.2 и способствует ее связыванию с QKI-5, тем самым ингибируя путь p38 MAPK и подавляя апоптоз в клетках GC-1. Все количественные данные были получены при n = 6.

figure-results-4
Рисунок 5: YC подавляет апоптоз сперматогоний через путь lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK. (A) Анализ жизнеспособности клеток GC-1 методом CCK-8 после воздействия сыворотки, содержащей капсулы Янцзин (YC), в течение 6, 12 и 24 ч. (B) qRT-PCR анализ экспрессии lncRNA NONMMUT031883.2 в клетках GC-1 после 24 ч воздействия YC. (C, D) RNA pull-down анализ связывания lncRNA NONMMUT031883.2 с QKI-5 после воздействия YC. (E, F) Вестерн-блот анализ экспрессии QKI-5, p-p38 и p38 после воздействия YC. (G, H) Проточный цитометрический анализ апоптоза клеток GC-1 после воздействия YC. (I) Активность каспазы-3 после воздействия YC. (J, K) Вестерн-блот анализ экспрессии Bcl-2, Bax, каспазы-3 и расщепленной каспазы-3 после воздействия YC. (L, M) Вестерн-блот анализ экспрессии QKI-5 после трансфекции OE-NC или OE-QKI-5. (N) Анализ жизнеспособности клеток GC-1 методом CCK-8. (O, P) Проточный цитометрический анализ апоптоза в клетках GC-1 после гиперэкспрессии QKI-5. (Q) Активность каспазы-3 после гиперэкспрессии QKI-5. (R, S) Вестерн-блот анализ экспрессии Bax, Bcl-2, каспазы-3 и расщепленной каспазы-3 после гиперэкспрессии QKI-5. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение; n = 6. ***p < 0.001 по сравнению с контролем; ###p < 0.001 по сравнению с sh-lncRNA; &&&p < 0.001 по сравнению с sh-lncRNA + H-YC + OE-NC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

YC улучшает вызванную CP сперматогенную дисфункцию у мышей
Защитные эффекты YC оценивали на мышах со сперматогенной дисфункцией. Семенники и придатки семенников мышей в группе CP характеризовались выраженной атрофией, уменьшением объема и тусклым видом. После лечения различными дозами YC морфология, наполненность и цвет репродуктивных органов постепенно улучшались (Рисунок 6A). Относительный вес семенников и придатков семенников значительно увеличился, при этом наибольший эффект наблюдался в группе, получавшей 800 mg/kg YC (Рисунок 6B, C).

Частота деформаций сперматозоидов была значительно повышена в группе CP, при этом часто встречались такие аномалии, как искажение формы головки, закручивание хвоста и структурные повреждения. Количество и подвижность сперматозоидов также были заметно снижены. После лечения YC морфология сперматозоидов улучшилась (Рисунок 6D), количество сперматозоидов увеличилось (Рисунок 6E), а подвижность сперматозоидов значительно повысилась (Рисунок 6F). Эксперименты по скрещиванию показали, что фертильность и размер помета были заметно снижены в группе CP, тогда как лечение YC улучшило фертильность (Рисунок 6G). Уровни тестостерона, фолликулостимулирующего гормона и лютеинизирующего гормона в сыворотке крови также были заметно снижены в группе CP и повысились после лечения YC (Рисунок 6H-J). Эти результаты указывают на то, что YC уменьшает атрофию репродуктивных органов, улучшает качество спермы, фертильность и секрецию половых гормонов у мышей с нарушением сперматогенеза. Количественные данные на Рисунке 6G были получены при n = 9, остальные количественные данные — при n = 6.

figure-results-5
Рисунок 6: YC улучшает вызванную CP сперматогенную дисфункцию у мышей. (A-C) Морфология репродуктивных органов в контрольной группе, группе с введением циклофосфамида (CP) и группе с лечением YC (A), индекс семенников (B) и индекс придатков семенников (C). (D-F) Морфология сперматозоидов (D) (40×; масштабная линейка, 50 µm), плотность сперматозоидов (E) и подвижность сперматозоидов (F). (G) Фертильность самцов, оцененная с помощью экспериментов по скрещиванию (n = 9). (H-J) Уровни фолликулостимулирующего гормона (FSH), тестостерона и лютеинизирующего гормона (LH) в сыворотке крови, измеренные с помощью наборов для иммуноферментного анализа. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение; n = 6. ***p < 0.001 по сравнению с контролем; #p < 0.05, ##p < 0.01 и ###p < 0.001 по сравнению с CP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

YC уменьшает гистопатологические повреждения семенников у мышей со сперматогенной дисфункцией
Восстанавливающий эффект YC при повреждении тканей семенников оценивали с помощью гистологического окрашивания. Окрашивание гематоксилином и эозином в контрольной группе показало сохранную структуру тканей, четкие клеточные слои и достаточное количество клеток. Напротив, в группе CP наблюдались выраженная атрофия семенных канальцев и структурная дезорганизация, уменьшение количества клеток и коллапс просвета придаточного семенника. После лечения YC повреждения семенников и придаточных семенников уменьшились, структура семенных канальцев постепенно восстановилась, а клетки стали более упорядоченными, и их число увеличилось (Рисунок 7A, B).

Доля TUNEL-положительных клеток в тканях семенников была значительно увеличена в группе CP и существенно снижена после применения YC (Рисунок 7C, D). Экспрессия Bax и соотношение расщепленной caspase-3/caspase-3 заметно повысились в группе CP, тогда как экспрессия Bcl-2 снизилась. Применение YC обратило эти изменения в экспрессии (Рисунок 7E, F). Иммунофлуоресцентный анализ показал, что интенсивность флуоресценции Ki67 была заметно снижена в группе CP и значительно возросла после применения YC, что указывает на восстановление пролиферации сперматогенных клеток (Рисунок 7G, H). Эти результаты свидетельствуют о том, что YC уменьшает индуцированные CP гистопатологические повреждения семенников и придатков семенников, подавляет избыточный апоптоз и стимулирует пролиферацию сперматогенных клеток. Все количественные данные были получены при n = 6.

figure-results-6
Рисунок 7: YC уменьшает гистопатологические повреждения тканей семенников мышей, индуцированные CP. (A, B) Окрашивание гематоксилином и эозином (HE) семенников (A) и придаточных семенников (B) после обработки YC (20×; масштабная линейка, 100 µm). (C, D) TUNEL-анализ апоптоза в тканях семенников мышей (40×; масштабная линейка, 50 µm). (E, F) Вестерн-блот анализ экспрессии Bax, Bcl-2, caspase-3 и расщепленной caspase-3 в тканях семенников после обработки YC. (G, H) Иммунофлуоресцентный анализ экспрессии Ki67 в тканях семенников мышей (40×; масштабная линейка, 50 µm). Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение; n = 6. ***p < 0.001 по сравнению с контролем; p < 0.001 по сравнению с CP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

YC улучшает сперматогенную дисфункцию и патологические повреждения семенников у мышей через путь lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK
Было дополнительно изучено участие пути lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK в эффектах YC. Экспрессия lncRNA NONMMUT031883.2 была значительно снижена в тканях семенников мышей группы CP, в то время как экспрессия QKI-5 и соотношение p-p38/p38 заметно увеличились (Рисунок 8A-D). После лечения YC экспрессия lncRNA NONMMUT031883.2 увеличилась, тогда как экспрессия QKI-5 и соотношение p-p38/p38 снизились.

Для дальнейшей оценки специфичности пути был проведен нокдаун lncRNA NONMMUT031883.2 у мышей с использованием sh-lncRNA. Уровень экспрессии lncRNA NONMMUT031883.2 значительно снизился, что подтвердило успешный нокдаун (Рисунок 8E). После нокдауна lncRNA NONMMUT031883.2 уровень QKI-5 в тканях семенников существенно не изменился, однако уровень p-p38/p38 значительно повысился (Рисунок 8F, G). Обработка sh-lncRNA ослабила эффекты введения YC в дозе 800 mg/kg, что привело к снижению экспрессии lncRNA NONMMUT031883.2 в тканях семенников (Рисунок 8H) и повышению уровней p-p38/p38 (Рисунок 8I, J). Применение YC значительно увеличило количество и подвижность сперматозоидов после индукции CP, тогда как нокдаун lncRNA NONMMUT031883.2 ослабил эти эффекты (Рисунок 8K, L). Применение YC также повысило уровни тестостерона, фолликулостимулирующего и лютеинизирующего гормонов в группе CP, в то время как нокдаун lncRNA ослабил эти эффекты (Рисунок 8M-O).

Окрашивание гематоксилином и эозином показало, что YC уменьшает повреждения яичек, вызванные CP, включая атрофию семенных канальцев и нарушение организации расположения сперматогенных клеток. Нокдаун lncRNA NONMMUT031883.2 ослаблял эти защитные эффекты (Рисунок 8P). После обработки YC экспрессия Bax и соотношение расщепленной caspase-3/caspase-3 снижались, тогда как экспрессия Bcl-2 увеличивалась. Нокдаун lncRNA NONMMUT031883.2 обращал вспять эти эффекты в отношении белков, связанных с апоптозом (Рисунок 8Q, R). Эти результаты указывают на то, что YC улучшает качество спермы и снижает повреждение тканей яичек после индукции CP путем повышения экспрессии lncRNA NONMMUT031883.2, снижения экспрессии QKI-5 и ингибирования пути p38 MAPK. Все количественные данные были получены при n = 6.

figure-results-7
Рисунок 8YC улучшает сперматогенез и снижает гистопатологические повреждения семенников через путь lncРНК NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK. (A) Анализ экспрессии lncRNA NONMMUT031883.2 в тканях семенников мыши методом ОТ-ПЦР в реальном времени. (B-D) Вестерн-блот-анализ экспрессии QKI-5, p-p38 и p38 в тканях семенников мыши после обработки YC. (E) Валидация методом ОТ-ПЦР в реальном времени нокдауна lncRNA NONMMUT031883.2 в тканях семенников мыши после введения sh-lncRNA. (F, G) Вестерн-блот анализ уровней QKI-5 и p-p38/p38 в тканях семенников мышей после нокдауна lncRNA NONMMUT031883.2. (H) Анализ экспрессии lncRNA NONMMUT031883.2 в тканях семенников мыши методом ОТ-ПЦР в реальном времени после воздействия YC и введения sh-lncRNA. (I, J) Вестерн-блот-анализ экспрессии p-p38 и p38 в тканях семенников мыши. (K, L) Количество сперматозоидов (K) и подвижность сперматозоидов (L) в различных группах лечения. (M-О) Уровни ФСГ, тестостерона и ЛГ в сыворотке крови измеряли с помощью наборов для иммуноферментного анализа. (P) Окрашивание гематоксилином и эозином тканей семенников мышей, получавших CP (20×; масштабная линейка, 100 µm). (Q, R) Вестерн-блот-анализ экспрессии Bcl-2, Bax, расщепленной каспазы-3 и каспазы-3 в тканях семенников мышей. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение; n = 6. ***p < 0,001 по сравнению с контролем; p < 0,001 по сравнению с CP; p < 0,001 против 800 мг/кг YC + sh-NC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Доступность данных:
Необработанные данные, подтверждающие результаты этого исследования, представлены в виде Дополнительного файла 1.

Дополнительный файл 1: Исходные данные. Этот файл Excel содержит необработанные числовые данные, на которых основан количественный анализ, представленный на рисунках 2–8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Приобретенная сперматогенная дисфункция, вызванная химиотерапией, является важной причиной мужского бесплодия32,33,34. Однако конкретные молекулярные механизмы этого процесса остаются изученными не полностью. Результаты данного исследования демонстрируют, что капсулы Янцзин (YC) дозозависимо улучшают показатели половых гормонов, уменьшают гистопатологические повреждения семенников и восстанавливают фертильность у самцов мышей при нарушениях, вызванных циклофосфамидом (CP). Эти улучшения были связаны с повышением экспрессии lncRNA NONMMUT031883.2 и ингибированием пути QKI-5/p38 MAPK, что позволяет предположить, что YC может воздействовать через эту ось для снижения аномального апоптоза сперматогоний.

Репродуктивная токсичность CP широко задокументирована. Его метаболит акролеин может накапливаться в тканях семенников и индуцировать апоптоз герминативных клеток посредством окислительного стресса, повреждения ДНК и других путей. Сперматогонии, будучи начальными клетками сперматогенеза, особенно чувствительны к цитотоксическому воздействию CP35,36. Cao et al. обнаружили, что сигнальный путь контрольной точки повреждения ДНК был значительно усилен в тканях семенников пациентов с азооспермией после химиотерапии CP, в то время как экспрессия генов, связанных с развитием сперматозоидов, была значительно снижена, а структурная целостность семенных канальцев нарушена37. Bcl-2 — это антиапоптотический белок, который функционирует за счет поддержания целостности митохондриальной мембраны38. Bax является проапоптотическим белком, и повышение его уровня может стимулировать выход цитохрома c из митохондрий в цитоплазму, активировать каскад каспаз и индуцировать апоптоз39,40. Saleh et al. продемонстрировали, что воздействие CP вызывало атрофию семенных канальцев и интерстициальный отек у мышей, что сопровождалось снижением экспрессии Bcl-2 и повышением экспрессии Bax, что в конечном итоге приводило к снижению количества и подвижности сперматозоидов41. Таким образом, ингибирование избыточного апоптоза сперматогоний, индуцированного CP, может стать важной целью для защиты репродуктивной функции после химиотерапии. В настоящем исследовании вмешательство с использованием YC дозозависимо снижало вызванные CP нарушения секреции половых гормонов в сыворотке крови, восстанавливало повреждения семенных канальцев, а также улучшало подвижность сперматозоидов и фертильность самцов. YC также повышал экспрессию Bcl-2 и снижал экспрессию Bax, соотношение расщепленной caspase-3/caspase-3 и количество TUNEL-положительных клеток в тканях семенников. In vitro сыворотка, содержащая YC, заметно снижала апоптоз клеток GC-1 и повышала их жизнеспособность, что дополнительно подтверждает ингибирующий эффект на апоптоз сперматогоний.

Длинные некодирующие РНК (днкРНК) играют важную регуляторную роль в физиологических и патологических процессах, включая сперматогенез и апоптоз зародышевых клеток42,43. Нарушение экспрессии днкРНК может ухудшить сперматогенную функцию яичек через регуляцию окислительного стресса и путей апоптоза, представляя собой важный молекулярный механизм мужского бесплодия44. Wang et al. обнаружили, что днкРНК DNM3OS регулирует ось miR-214-5p/E2F2, что приводит к снижению активности сперматогональных клеток, а также к усилению апоптоза и старения, в конечном итоге способствуя развитию необструктивной азооспермии45. Предыдущие исследования также показали, что нокдаун днкРНК NONMMUT074098.2 в сперматогониях индуцирует апоптоз25. Эти данные свидетельствуют о том, что днкРНК являются важными регуляторами апоптоза сперматогоний и сперматогенеза. В настоящем исследовании нокдаун днкРНК NONMMUT031883.2 индуцировал апоптоз сперматогоний. Ее экспрессия была значительно снижена в ткани яичек мышей после введения CP, в то время как воздействие YC частично восстановило ее экспрессию. Кроме того, воздействие YC ослабило аномальный апоптоз сперматогоний, вызванный нокдауном днкРНК NONMMUT031883.2, что позволяет предположить, что защитный эффект YC может быть связан с регуляцией этой днкРНК.

QKI-5 представляет собой РНК-связывающий белок, принадлежащий к семейству STAR, который участвует в ряде физиологических и патологических процессов, регулируя сплайсинг, стабильность и эффективность трансляции целевых мРНК46,47. Предыдущие исследования установили, что QKI-5 является важным регулятором в репродуктивной системе и что его аномальная экспрессия может стимулировать апоптоз половых клеток и нарушать функцию сперматозоидов посредством активации нижележащего пути p38 MAPK25. Li et al. обнаружили, что ингибирование активации пути p38 MAPK снижало вызванное CP повреждение тканей семенников и восстанавливало функцию гематотестикулярного барьера у крыс48. Эти данные позволяют предположить, что ось QKI-5/p38 MAPK может быть важным путем регуляции апоптоза сперматогоний и потенциальной мишенью для лечения сперматогенной дисфункции. В настоящем исследовании экспрессия QKI-5 и фосфорилирование p38 были значительно повышены в тканях семенников мышей после воздействия CP, тогда как вмешательство с использованием YC снижало экспрессию QKI-5 и активацию пути p38 MAPK. LncRNA NONMMUT031883.2 напрямую связывалась с QKI-5, в то время как экспрессия QKI-5 не влияла на стабильность lncRNA, что указывает на возможность регуляции функции QKI-5 со стороны lncRNA NONMMUT031883.2 посредством прямого взаимодействия. Нокдаун QKI-5 ослаблял повреждение клеток GC-1, вызванное нокдауном lncRNA NONMMUT031883.2, тогда как гиперэкспрессия QKI-5 снижала защитный эффект YC на клетки GC-1. Li et al. сообщили, что lncRNA NONMMUT074098.2 регулирует апоптоз половых клеток путем связывания с QKI-525. Полученные результаты показывают, что lncRNA NONMMUT031883.2 также связывается с QKI-5 и участвует в регуляции апоптоза сперматогоний. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что YC может повышать уровень lncRNA NONMMUT031883.2, ингибировать путь QKI-5/p38 MAPK, снижать аномальный апоптоз сперматогоний и облегчать вызванную CP сперматогенную дисфункцию. Однако следует отметить, что YC представляет собой многокомпонентный растительный препарат, который, вероятно, воздействует на несколько мишеней. Нельзя исключать другие механизмы, такие как прямой антиоксидантный эффект компонентов YC, модуляция других сигнальных путей или эпигенетическая регуляция, не зависящая от оси lncRNA-QKI-5, которые также могут способствовать наблюдаемым защитным эффектам.

Следует признать наличие ряда ограничений. Исследование проводилось только на мышиной модели и клеточной линии GC-1, и в нем отсутствовала валидация с использованием клинических образцов пациентов с бесплодием. Сперматогенез представляет собой сложный процесс, и полный сперматогенный цикл у мышей длится примерно 35 дней49,50. Режим применения YC в течение 30 дней, использованный в данном исследовании, не охватил полный сперматогенный цикл. Таким образом, обосновано проведение будущих исследований с использованием протоколов вмешательства продолжительностью ≥35 дней для систематической оценки терапевтического эффекта YC на протяжении всего сперматогенного цикла. Кроме того, предстоит изучить точные молекулярные события, следующие за связыванием lncRNA NONMMUT031883.2 с QKI-5, такие как изменения активности сплайсинга QKI-5 и его субклеточной локализации, а также распознавание и регуляция нижестоящих мишеней сплайсинга. Более того, хотя лечение YC повышало экспрессию lncRNA NONMMUT031883.2, вышестоящие факторы транскрипции и эпигенетические механизмы остаются невыясненными. Для уточнения молекулярных основ индуцированной YC экспрессии lncRNA NONMMUT031883.2 необходимы дальнейшие исследования с применением анализа промоторов и иммунопреципитации хроматина. Кроме того, в будущих работах следует оценить воздействие YC на пациентов с мужским бесплодием, связанным с химиотерапией, и проанализировать экспрессию lncRNA NONMMUT031883.2 в тканях яичек или в сперме, чтобы определить ее потенциальную клиническую ценность в качестве диагностического или терапевтического маркера.

В заключение, YC повышает экспрессию lncRNA NONMMUT031883.2 и подавляет активацию пути QKI-5/p38 MAPK, тем самым снижая апоптоз сперматогоний и повреждение яичек, а также облегчая сперматогенную дисфункцию у мышей. Эти результаты проясняют молекулярный механизм, лежащий в основе защитного действия YC против сперматогенной дисфункции, и расширяют современное понимание роли lncRNA NONMMUT031883.2 и пути QKI-5/p38 MAPK в регуляции сперматогенеза. LncRNA NONMMUT031883.2 и QKI-5 могут представлять собой потенциальные терапевтические мишени при мужской сперматогенной дисфункции.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии финансовых или нефинансовых конфликтов интересов.

Благодарности

Данная работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант № 82374257), четвертой группой Программы подготовки ведущих академических талантов провинциальной больницы традиционной китайской медицины Цзянсу (грант № k2026yrc74) и научно-исследовательскими проектами в области традиционной китайской медицины и интегративной традиционной китайской и западной медицины провинции Цзянсу (грант № CYTF2026019).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Actinomycin DMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-17559Ингибитор транскрипции, используемый в анализах стабильности РНК
Обратная транскриптаза AMVTakara, Tokyo, Japan2621Фермент для синтеза комплементарной ДНК
Набор для детекции Annexin V-APC/PIBioLab Technology, Beijing, ChinaKFS191Набор для проточного цитометрического анализа апоптоза
Среда для закрепления с антифейдинговым агентомMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K1042Закрепляющая среда для сохранения флуоресценции
Первичные антитела к BaxAffinity Biosciences, OH, USAAF0120Первичные антитела для детекции Bax
Набор BCAMacklin, Shanghai, ChinaB917925Набор для определения концентрации белка
Первичные антитела к Bcl-2Affinity Biosciences, OH, USAAF0769Первичные антитела для детекции Bcl-2
Бычий сывороточный альбуминBioLab Technology, Beijing, ChinaBTN131070Блокирующий реагент
Набор для детекции Calcein/PIBeyotime, Shanghai, ChinaC2015MНабор для окрашивания живых и мертвых клеток
Набор для анализа активности каспазы-3BioLab Technology, Beijing, ChinaQN2866Набор для измерения активности каспазы-3
Первичные антитела к каспазе-3Abcam, MA, USAab184787Первичные антитела для детекции каспазы-3
Реагент CCK-8MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K0301Реагент для оценки жизнеспособности клеток
Первичные антитела к расщепленной каспазе-3Abcam, MA, USAab32042Первичные антитела для детекции расщепленной каспазы-3
ЦиклогексимидMacklin, Shanghai, ChinaH823111Ингибитор синтеза белка, используемый в анализах стабильности белка
ЦиклофосфамидMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-17420Используется для индукции сперматогенной дисфункции
Реагент DAPIBeyotime, Shanghai, ChinaC1006Контраст для ядер
Среда DMEMWuhan Sunncell Biotechnology, Hubei, ChinaSNLM-302Среда для культивирования клеток GC-1
Рабочий раствор ECLSolarbio, Beijing, ChinaSW2030Хемилюминесцентный субстрат для детекции белковых полос
ЭтопозидMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-13629Агент, индуцирующий апоптоз
Проточный цитометрBD Biosciences, CA, USABD FACSCaliburПрибор для анализа апоптоза
Программное обеспечение FlowJoBD Biosciences, CA, USAv10.8ПО для анализа данных проточной цитометрии
Флуоресцентный микроскопLeica, Heidelberg, GermanyDM3000Прибор для флуоресцентной визуализации
Флуоресцентно-меченые вторичные антитела IgGServicebio, Wuhan, ChinaGB22303Вторичные антитела для иммунофлуоресцентной детекции
Набор ELISA для фолликулостимулирующего гормонаHuamei Biotech, Wuhan, ChinaCSB-E06871mНабор для измерения уровня фолликулостимулирующего гормона в сыворотке
Первичные антитела к GAPDHAffinity Biosciences, OH, USAT0004Антитела для контроля нагрузки при вестерн-блоттинге
Клетки GC-1Wuhan Sunncell Biotechnology, Hubei, ChinaSNL-302Линия сперматогониальных клеток мыши
Система гель-визуализацииJinpeng Analysis Instrument, Shanghai, ChinaJP-2880Система визуализации гелей и блотов
Система гель-визуализацииInvitrogen, Carlsbad, CA, USAiBright CL1500Система хемилюминесцентной визуализации для вестерн-блотов
Козьи антитела против IgG кроликаServicebio, Wuhan, ChinaGB23303Вторичные антитела для вестерн-блоттинга
Раствор гематоксилинаBioLab Technology, Beijing, ChinaYT165Краситель для ядер при гистологическом анализе
Дифференцирующий раствор этанол-соляная кислотаBeyotime, Shanghai, ChinaC0163SДифференцирующий реагент для окрашивания гематоксилином
Программное обеспечение ImageJNational Institutes of Health, USA1.54hПО для количественного анализа изображений
Буфер для лизиса клеток при ИПBeyotime, Shanghai, ChinaP0013Буфер для лизиса при иммунопреципитации и экстракции белков
Первичные антитела к Ki67Affinity Biosciences, OH, USAAF0198Первичные антитела для детекции Ki67
Набор для анализа цитотоксичности по LDHBeyotime, Shanghai, ChinaC0016Набор для измерения высвобождения лактатдегидрогеназы и повреждения клеток
Световой микроскопOlympus, Tokyo, JapanCKX53Используется для подсчета сперматозоидов и морфологического наблюдения
Lipofectamine 3000Invitrogen, Carlsbad, CA, USAL3000001Реагент для трансфекции
Микропланшетный ридерMolecular Devices, CA, USASpectraMax MiniПрибор для измерения абсорбции
Набор ELISA для лютеинизирующего гормона мышиHuamei Biotech, Wuhan, ChinaCSB-E12770mНабор для измерения уровня лютеинизирующего гормона в сыворотке
Набор ELISA для тестостерона мышиHuamei Biotech, Wuhan, ChinaCSB-E05101mНабор для измерения уровня тестостерона в сыворотке
Нейтральный камедьBioLab Technology, Beijing, ChinaQN1253Закрепляющая среда для гистологических срезов
Первичные антитела к p38Affinity Biosciences, OH, USAAF6456Первичные антитела для детекции общего p38
ПараформальдегидMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-Y0333Фиксатор для клеток и тканей
Набор PARISInvitrogen, Carlsbad, CA, USAAM1921Набор для фракционирования ядерной и цитоплазматической РНК
ПЦР-системаABI, CA, USAABI PRISM 7300Прибор для ПЦР в реальном времени
Первичные антитела к p-p38Affinity Biosciences, OH, USAAF3455Первичные антитела для детекции фосфорилированного p38
Раствор протеиназы KBeyotime, Shanghai, ChinaST532Реагент для пермеабилизации тканей перед окрашиванием TUNEL
Мембраны PVDFMillipore, MA, USAISEQ00010Мембраны для переноса белков при вестерн-блоттинге
Первичные антитела к QKI-5Abcam, MA, USAab126742Первичные антитела для детекции QKI-5
Буфер для связывания РНКInvitrogen, Carlsbad, CA, USA65040DБуфер для реакций связывания РНК с белками
Буфер для нанесения образцов SDSBeyotime, Shanghai, ChinaP0286Буфер для нанесения образцов при SDS-PAGE
Магнитные бусины со стрептавидиномMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K0208Магнитные бусины для захвата биотинилированных РНК-зондов
Набор TB Green FAST qPCRTakara, Tokyo, JapanCN830SНабор реагентов для количественной ПЦР
Triton X-100Macklin, Shanghai, ChinaT824275Реагент для пермеабилизации
Реагент TRIzolInvitrogen, Carlsbad, CA, USA15596018CNРеагент для экстракции общей РНК
Раствор для детекции TUNELBeyotime, Shanghai, ChinaC1086Реагент для детекции фрагментации ДНК
КсилолMacklin, Shanghai, ChinaX821391Реагент для удаления парафина и просветления тканей

Ссылки

  1. Bhattacharya I, Sharma SS, Majumdar SS. Etiology of male infertility: an update. Reprod Sci. 2024;31(4):942-965.
  2. Dong S, et al. Testicular aging, male fertility and beyond. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:1012119.
  3. Wang X, et al. Decoding the pathogenesis of spermatogenic failure in cryptorchidism through single-cell transcriptomic profiling. Cell Rep Med. 2024;5(9):101709.
  4. Stallmeyer B, et al. Inherited defects of piRNA biogenesis cause transposon de-repression, impaired spermatogenesis, and human male infertility. Nat Commun. 2024;15(1):6637.
  5. Szlachcikowska D, Koszła O, Sołek P, Tabęcka-Łonczyńska A. Non-canonical apoptosis mediates oxaliplatin-induced disruption of spermatogenic cells: implications for male fertility. Chem Biol Interact. 2026;431:112009.
  6. Chi YN, et al. Geniposide attenuates spermatogenic dysfunction via .inhibition of endoplasmic reticulum stress in male mice. Chem Biol Interact. 2022;366:110144.
  7. Guo XB, et al. Protective effect of bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes against the reproductive toxicity of cyclophosphamide is associated with the p38 MAPK/ERK and AKT signaling pathways. Asian J Androl. 2021;23(4):386-391.
  8. Lamb DJ. Chromosome defects and male factor infertility. Fertil Steril. 2025;123(6):933-942.
  9. Kathrins M, Niederberger C. Diagnosis and treatment of infertility-related male hormonal dysfunction. Nat Rev Urol. 2016;13(6):309-323.
  10. Piechka A, et al. Molecular mechanisms of cellular dysfunction in testes from men with non-obstructive azoospermia. Nat Rev Urol. 2024;21(2):67-90.
  11. Li Z, et al. The role of Cistanches Herba and its ingredients in improving reproductive outcomes: a comprehensive review. Phytomedicine. 2024;129:155681.
  12. Jiang X, et al. Shenling Baizhu San improves spermatogenic dysfunction in hyperuricemia mice by regulating Sirt3/Nrf2 to inhibit testicular ferroptosis. J Ethnopharmacol. 2025;340:119310.
  13. Deng W, Sun D, Cai B, Jin B. Yangjing capsule improves oligoasthenozoospermia by promoting nitric oxide production through the PLCγ1/AKT/eNOS pathway. Front Pharmacol. 2023;14:1056091.
  14. Zhao H, et al. Yangjing Capsule ameliorates spermatogenesis in male mice exposed to cyclophosphamide. Evid Based Complement Alternat Med. 2015;2015:980583.
  15. Jin B, et al. Yangjing Capsule improves testicular angiogenesis by activating the VEGFA/eNOS signaling pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2020;2020:1957267.
  16. Guo W, et al. Chlorocholine chloride exposure induced spermatogenic dysfunction via .iron overload caused by AhR/PERK axis-dependent ferritinophagy activation. Ecotoxicol Environ Saf. 2024;274:116193.
  17. Wang Z, et al. Yangjing Capsule extract promotes proliferation of GC-1 Spg cells. Evid Based Complement Alternat Med. 2014;2014:640857.
  18. Zhang P, et al. LncRNA-mediated adipogenesis in different adipocytes. Int J Mol Sci. 2022;23(13).
  19. Núñez-Martínez HN, Recillas-Targa F. Emerging functions of lncRNA loci beyond the transcript itself. Int J Mol Sci. 2022;23(11).
  20. Herman AB, Tsitsipatis D, Gorospe M. Integrated lncRNA function upon genomic and epigenomic regulation. Mol Cell. 2022;82(12):2252-2266.
  21. Wang JZ, et al. QKI-5 regulates the alternative splicing of the cytoskeletal gene ADD3 in lung cancer. J Mol Cell Biol. 2021;13(5):347-360.
  22. Zeng Y, et al. Nickel induces blood-testis barrier damage through ROS-mediated p38 MAPK pathways in mice. Redox Biol. 2023;67:102886.
  23. Luo D, He Z, Yu C, Guan Q. Role of p38 MAPK signaling in testis development and male fertility. Oxid Med Cell Longev. 2022;2022:6891897.
  24. Xia C, et al. LncRNA CCAT1 enhances chemoresistance in hepatocellular carcinoma by targeting QKI-5. Sci Rep. 2022;12(1):7826.
  25. Li K, et al. A long noncoding RNA binding to QKI-5 regulates germ cell apoptosis via .the p38 MAPK signaling pathway. Cell Death Dis. 2019;10(10):699.
  26. Zhou X, et al. ANKRD49 inhibits etoposide-induced intrinsic apoptosis of GC-1 cells by modulating NF-κB signaling. Mol Cell Biochem. 2019;457(1-2):21-29.
  27. Fang C, et al. Integrative proteomics and metabolomics approach to identify the key roles of icariin-mediated protective effects against cyclophosphamide-induced spermatogenesis dysfunction in mice. Front Pharmacol. 2022;13:1040544.
  28. Li K, et al. Adeno-associated-virus-mediated delivery of CRISPR-CasRx induces efficient RNA knockdown in the mouse testis. Theranostics. 2024;14(10):3827-3842.
  29. Yi H, et al. Retinoic acid mitigates NSC319726-induced spermatogenesis dysfunction through cuproptosis-independent mechanisms. Cell Biol Toxicol. 2024;40(1):26.
  30. Guo Y, Wang A, Liu X, Li E. Effects of resveratrol on reducing spermatogenic dysfunction caused by high-intensity exercise. Reprod Biol Endocrinol. 2019;17(1):42.
  31. Beeraka NM, et al. Ginsenoside Rh4 suppresses Notch3 and PI3K/Akt signaling to inhibit the growth and metastasis of gastric cancer cells. J Cancer Biomol Ther. 2025;2(1):145-156.
  32. Li P, et al. Proteomic analysis of cisplatin-induced spermatogenesis defects in mice. Ann Med. 2026;58(1):2612816.
  33. Wang Z, et al. Melatonin ameliorates paclitaxel-induced spermatogenesis and fertility defects in mice. J Cell Mol Med. 2022;26(4):1219-1228.
  34. Abdi M, et al. Cyclophosphamide-induced infertility and the impact of antioxidants. Am J Reprod Immunol. 2024;92(6):e70014.
  35. Özbilgin MK, Demirören S, Üçöz M, Oztatlici M. Cyclophosphamide suppresses spermatogenesis in the testes of mice through downregulation of miR-34b and miR-34c. Andrologia. 2021;53(7):e14071.
  36. Poojary KK, et al. Curcumin nanocrystals attenuate cyclophosphamide-induced testicular toxicity in mice. Toxicol Appl Pharmacol. 2021;433:115772.
  37. Cao J, et al. Single-cell map of human azoospermic testes caused by cyclophosphamide chemotherapy. Sci Data. 2024;11(1):163.
  38. Dong Y, et al. New insights into polycyclic aromatic hydrocarbons: Phenanthrene targets ribosomes to induce neuronal apoptosis. Aquat. Toxicol. 2026;298:107884.
  39. Wang Y, et al. Interplay between elemental imbalance-related PI3K/Akt/mTOR-regulated apoptosis and autophagy in arsenic (III)-induced jejunum toxicity of chicken. Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 2018;25(19):18662-18672.
  40. Liu H, et al. Integrating network toxicology, transcriptomics and experimental validation to elucidate the potential mechanisms of fluoride-induced neurotoxicity in zebrafish. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 2026;306:110549.
  41. Saleh DO, et al. Cyclophosphamide-induced testicular injury: the role of chrysin in mitigating iron overload and ferroptosis. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2025;398(5):5475-5489.
  42. Dong S, et al. Loss of lncRNAs 1700101O22Rik and 1700027A15Rik causes sperm malformation and subfertility. Andrology. 2025;13(5):1223-1235.
  43. Liu W, et al. A novel meiosis-related lncRNA, Rbakdn, contributes to spermatogenesis by stabilizing Ptbp2. Front Genet. 2021;12:752495.
  44. Sun TC, et al. LncRNAs induce oxidative stress and spermatogenesis by regulating endoplasmic reticulum genes and pathways. Aging (Albany NY). 2021;13(10):13764-13787.
  45. Hua R, et al. DNM3OS enhances the apoptosis and senescence of spermatogonia associated with nonobstructive azoospermia by providing miR-214-5p and decreasing E2F2 expression. Anal Cell Pathol (Amst). 2023;2023:1477658.
  46. Wang S, et al. Quaking 5 suppresses TGF-β-induced epithelial-mesenchymal transition and cell invasion in lung adenocarcinoma. EMBO Rep. 2021;22(6):e52079.
  47. Chen X, et al. The emerging roles of the RNA-binding protein QKI in cardiovascular development and function. Front Cell Dev Biol. 2021;9:668659.
  48. Li J, et al. Qiangjing tablets repair blood-testis barrier dysfunction in rats by regulating oxidative stress and the p38 MAPK pathway. BMC Complement Med Ther. 2022;22(1):133.
  49. Tang Z, et al. MRE11 is essential for the long-term viability of undifferentiated spermatogonia. Cell Prolif. 2024;57(9):e13685.
  50. Jiao Y, Feng Z, Zhang T, Chen X. Impact of Vitamin D(3) Supplementation on Androgens and Semen Parameters in Infertile Men: A Systematic Review and Meta-Analysis Based on Prospective Randomised Controlled Trials. Arch. Esp. 2025;78(6):772-781.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

BiologyYangjing Capsulesspermatogenic dysfunctionlncRNA NONMMUT031883 2Quaking I 5p38 MAPK pathway

Похожие статьи