Нефропротекторное действие этанола и фомепизола на модели метанольного отравления у крыс с предварительным введением метотрексата

Краткое содержание

В данном исследовании сравнивается нефропротекторное действие этанола и фомепизола на модели интоксикации метанолом у крыс, предварительно подвергнутых воздействию метотрексата для снижения фолат-зависимого клиренса формиата. Результаты воздействия на почки оценивались с помощью показателей функции почек, биомаркеров повреждения почек, маркеров воспаления, окислительно-восстановительных биомаркеров и гистопатологических данных.

Аннотация

Интоксикация метанолом вызывает метаболический ацидоз, повреждение органов и смерть; повреждение почек является предиктором неблагоприятных исходов. Этанол и фомепизол сравнивали на модели интоксикации метанолом у крыс, предварительно подвергнутых воздействию метотрексата. Тридцать самцов крыс линии Wistar были распределены по пяти группам: контрольная группа, группа метотрексата (MTX), группа MTX + метанол, группа MTX + метанол + фомепизол и группа MTX + метанол + этанол (n = 6 в каждой группе). MTX вводили перорально с помощью зонда в дозе 0,3 mg/kg/day с 1-го по 7-й день. Трем группам, подвергнутым воздействию метанола, вводили 3 g/kg метанола перорально с помощью зонда на 8-й день. Фомепизол вводили внутрибрюшинно в дозе 15 mg/kg через 4 h после введения метанола, затем по 10 mg/kg через 12, 24 и 36 h. Этанол вводили однократно перорально с помощью зонда в дозе 0,5 g/kg через 4 h после введения метанола. Образцы собирали на 10-й день. Первичная конечная точка проспективно не определялась. Оценивали функцию почек, повреждение гомогената почек, воспалительные биомаркеры, биомаркеры окислительно-восстановительного статуса в крови и гистопатологические показатели. Анализ дисперсии (ANOVA) выявил значимые групповые различия по содержанию цистатина C в гомогенате почек (p = 0,003), интерлейкина-6 (IL-6; p = 0,013), молекулы повреждения почек-1 (KIM-1; p = 0,017), уровня мочевины в сыворотке (p = 0,017) и уровня креатинина в сыворотке (p < 0,001). Апостериорный тест Данкана показал более низкие значения этих параметров в обеих группах, получавших антидоты, по сравнению с группой MTX + метанол. Значимых биохимических различий между двумя группами антидотов выявлено не было. Гистопатологические баллы были ниже в группах, получавших антидоты. Хотя фомепизол продемонстрировал более благоприятную описательную картину, полученные результаты не устанавливают его превосходство над этанолом. Интерпретация ограничена гетерогенностью дисперсии, множественным тестированием, неодинаковыми режимами введения антидотов, отсутствием измерений токсикокинетики и кислотно-основного равновесия, а также коротким периодом наблюдения. Будущие исследования должны включать прямые измерения уровней метанола и формиата, определение активности алкогольдегидрогеназы в цитозоле почек, анализ корреляций с биохимическими показателями функции почек, более длительные периоды наблюдения и сопоставимые режимы применения антидотов.

Введение

Отравление метиловым спиртом (метанолом) представляет собой серьезную токсикологическую проблему, сопровождающуюся значительным уровнем заболеваемости и смертности во всем мире, особенно после употребления нелегальных или кустарно произведенных алкогольных напитков. Хотя сам метанол обладает относительно низкой токсичностью, он преимущественно метаболизируется в печени алкогольдегидрогеназой (ADH) до формальдегида и впоследствии до муравьиной кислоты; результирующее накопление формиата может вызвать метаболический ацидоз с высоким анионным разрывом, оптическую нейропатию и полиорганное поражение^1,2. Формальдегид является короткоживущим промежуточным продуктом, в то время как накопление формиата считается основным фактором токсичности вследствие ингибирования митохондриальной цитохромоксидазы, клеточной гипоксии и окислительного стресса 3. Ранняя диагностика, коррекция метаболического ацидоза, антидотная терапия и гемодиализ являются основными терапевтическими подходами для снижения смертности².

При отравлении метанолом клинические проявления обычно становятся очевидными после латентного периода. Тошнота, рвота, боли в животе и легкое угнетение центральной нервной системы могут смениться метаболическим ацидозом с высоким анионным промежутком, одышкой, изменением психического статуса и зрительными симптомами^1,2. Размытость зрения, фотофобия, мидриаз, отек диска зрительного нерва и, в тяжелых случаях, необратимая слепота относятся к наиболее характерным токсическим эффектам, связанным с ингибированием митохондриальной цитохром-оксидазы под воздействием муравьиной кислоты^1,2. Современные стратегии лечения включают поддерживающую терапию; коррекцию метаболического ацидоза с помощью бикарбоната натрия; прием фолиновой или фолиевой кислоты; ингибирование алкогольдегидрогеназы этанолом или фомепизолом; а в отдельных тяжелых случаях — гемодиализ для ускорения выведения метанола и формиата^3,4. Фомепизол все чаще рассматривается как антидот первого выбора благодаря более предсказуемой фармакокинетике, более простой схеме дозирования и более низкому риску побочных эффектов; однако этанол остается важной альтернативой ввиду его доступности и низкой стоимости^4,5,6,7.

Хотя повреждение зрительного нерва и центральной нервной системы традиционно считались преобладающими проявлениями токсичности метанола, почки все чаще признаются клинически значимым органом-мишенью^8,9,10. В когортах пациентов с отравлением именно метанолом острое повреждение почек (ОПП) ассоциировалось с более тяжелым метаболическим ацидозом, дыхательной недостаточностью, полиорганной недостаточностью, необходимостью искусственной вентиляции легких, экстракорпоральной терапии, более длительной госпитализацией и более высокой госпитальной летальностью; в качестве факторов, связанных с развитием ОПП, также были определены дефицит объема жидкости, сепсис, рабдомиолиз и острый панкреатит^8,10. В когорте, описанной Chang et al., в многофакторном анализе ОПП оставалось независимым фактором, связанным с госпитальной летальностью; однако ретроспективный обсервационный дизайн исследования не позволяет утверждать, что именно ОПП стало причиной смерти⁸. Соответственно, ОПП следует интерпретировать как маркер большей тяжести заболевания и худшего прогноза при интоксикации метанолом. Напротив, в систематическом обзоре Wang et al. оценивались исходы для почек после отравления токсичными спиртами в более широком смысле, главным образом метанолом и этиленгликолем; следовательно, его выводы не относятся исключительно к метанолу⁹. В данном обзоре была отмечена значительная краткосрочная летальность и выявлены важные пробелы в данных относительно долгосрочного восстановления функции почек, продолжения диализа и стандартизированной отчетности об исходах для почек⁹.

Связь между токсичностью метанола и ОПП, вероятно, носит многофакторный характер. Накопление токсичных метаболитов может способствовать развитию патологии через ингибирование митохондрий, клеточную гипоксию, тяжелый метаболический ацидоз и окислительный дисбаланс, в то время как системные факторы, зафиксированные в клинических когортах — включая дефицит объема жидкости, гемодинамические нарушения, рабдомиолиз, сепсис, дыхательную недостаточность и полиорганную недостаточность — могут стать дополнительными факторами повреждения почек^1,2,3,8,10. Эти механизмы обеспечивают биологически и клинически обоснованную связь между отравлением метанолом и повреждением почек. Нарушения почечного обмена могут быть результатом воздействия циркулирующего формиата, ингибирования митохондрий, метаболического ацидоза и системного гемодинамического стресса. Однако конкретный вклад метаболизма спирта и альдегида в тканях почек остается неопределенным, поскольку концентрации метанола, формальдегида и формиата, активность АДГ в почках и функция митохондрий в настоящем исследовании не оценивались напрямую.

Основной методологической проблемой в экспериментальных исследованиях токсичности метанола является то, что крысы метаболизируют муравьиную кислоту быстрее, чем люди. Хотя накопление муравьиной кислоты является основным определяющим фактором токсичности метанола у людей, достижение сопоставимого уровня накопления и последующего повреждения органов у крыс затруднено в связи с их высокоэффективным фолат-зависимым метаболизмом формиата. Поэтому в экспериментальных моделях токсичности метанола часто используются агенты, подавляющие метаболизм фолатов^11,12. Предварительное введение метотрексата (MTX) использовалось для снижения фолат-зависимого клиренса формиата у крыс, что повышало их восприимчивость к токсичности метанола^11,12. Метотрексат сам по себе не вызывает токсичности метанола, и полученная модель не воспроизводит все аспекты отравления метанолом у человека. Поскольку метотрексат может независимо влиять на почечные, окислительные и воспалительные показатели, в исследование была включена группа, получавшая только MTX, для характеристики изменений, связанных с предварительной обработкой. Несмотря на эти ограничения, данная модель представляет собой контролируемую доклиническую платформу для сравнения характера почечных исходов в экспериментальных группах, получавших одинаковую предварительную обработку метотрексатом и протокол воздействия метанола, а также для оценки этих исходов на биохимическом, воспалительном, окислительном и гистопатологическом уровнях.

Ингибирование алкогольдегидрогеназы является основой антидотной терапии при интоксикации метанолом. Двумя препаратами, наиболее часто используемыми для этой цели в клинической практике, являются этанол и фомепизол (4-метилпиразол). Этанол конкурентно подавляет образование токсичных метаболитов благодаря своему более высокому сродству к ADH, чем у метанола, в то время как фомепизол, мощный и селективный ингибитор ADH, напрямую предотвращает превращение метанола в формальдегид и муравьиную кислоту^5,6. Однако полного консенсуса относительно сравнительной клинической эффективности, безопасности, удобства применения и органопротекторного действия этих двух антидотов не существует. Во многих центрах фомепизол считается более предпочтительным из-за стандартизированного режима дозирования, отсутствия необходимости мониторинга уровня препарата в сыворотке крови, отсутствия угнетения центральной нервной системы и более предсказуемых фармакокинетических свойств, тогда как терапия этанолом связана с потенциальными недостатками, включая гипогликемию, гепатотоксичность, изменение психического статуса и необходимость интенсивного мониторинга^6,7. Напротив, крупномасштабные клинические сравнения показали, что влияние двух антидотов на смертность и клинические исходы может быть схожим. В исследовании Zakharov et al., в котором оценивались случаи массовых отравлений, значимых различий в выживаемости между группами фомепизола и этанола обнаружено не было⁵.

Несмотря на прогностическую значимость ОПП при отравлении метанолом^8,9,10, повреждение почек привлекало значительно меньше внимания, чем глазная и неврологическая токсичность, а сравнительное воздействие этанола и фомепизола на почки остается недостаточно изученным. Таким образом, обоснована необходимость оценки состояния почек с использованием стандартных тестов функции почек, биомаркеров раннего повреждения канальцев, воспалительных цитокинов, параметров окислительно-восстановительного статуса и гистопатологии, чтобы определить, связаны ли две стратегии антидотной терапии с различными паттернами исходов для почек. Кроме того, данная контролируемая модель крыс с предварительным введением метотрексата может способствовать доклинической оценке потенциальных антидотов, методов направленного воздействия на почки и поддерживающей терапии в определенных экспериментальных условиях. Научная ценность этой модели заключается в сравнительной оценке в условиях острого эксперимента, а не в прямом воспроизведении клинической и метаболической сложности отравления метанолом у человека.

Различия в метаболизме метанола у грызунов и людей, наряду с использованием фармакологической предобработки для снижения фолат-зависимого клиренса формиата, остаются важными методологическими ограничениями. Более того, острая токсичность, индуцированная в экспериментальных условиях, может не в полной мере отражать различную продолжительность воздействия и сопутствующие заболевания, встречающиеся в клинической практике. Соответственно, результаты данной животной модели следует рассматривать как предварительные доклинические данные, которые не должны использоваться напрямую для принятия решений о лечении людей. Перед формулированием клинических выводов требуется подтверждение в надлежащим образом спланированных клинических исследованиях. В этом контексте основным пробелом в знаниях является вопрос о том, связаны ли этанол и фомепизол с различными паттернами исходов для почек при оценке стандартных показателей функции почек, биомаркеров тубулярного повреждения, воспалительных цитокинов, окислительно-восстановительных параметров и гистопатологии на модели крыс, подвергнутых предварительной обработке метотрексатом. Гипотеза исследования заключалась в том, что ингибирование алкогольдегидрогеназы с помощью этанола или фомепизола будет связано с ослаблением повреждения почек, с потенциальными различиями между вариантами лечения в оцениваемых областях исходов. Нефропротекция была определена операционально как более благоприятный паттерн исходов для почек, чем в группе MTX + Methanol. Этот паттерн включал более низкие концентрации мочевины и креатинина в сыворотке крови; более низкие уровни молекулы повреждения почек-1 (KIM-1), цистатина C, фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α), интерлейкина-6 (IL-6) и интерлейкина-1 бета (IL-1β) в почках; более низкие концентрации малонового диальдегида (MDA) в сыворотке крови; более высокую активность супероксиддисмутазы (SOD) в сыворотке, уровни восстановленного глутатиона (GSH) и активность каталазы (CAT) в крови; а также более низкие гистопатологические баллы для тубулярной дегенерации, тубулярного некроза, повреждения клубочков, сосудистого полнокровия, интерстициального воспаления и фиброза. Нефропротекция не рассчитывалась как единый композитный показатель; вместо этого отдельные исходы оценивались коллективно по этим взаимодополняющим областям. Соответственно, целью исследования было сравнение влияния этанола и фомепизола на функцию почек, тубулярное повреждение, воспаление, окислительно-восстановительный статус и гистопатологию почек в данной модели.

Протокол

Все экспериментальные процедуры были одобрены местным комитетом по этике экспериментов на животных Университета Кыршехир Ахи Эвран (решение об одобрении № 1, заседание № 12, дата одобрения: 12 июня 2025 г.) и проводились в соответствии с национальными и международными руководствами по содержанию и использованию лабораторных животных. На протяжении всего исследования принимались меры для минимизации боли и стресса, а также для использования минимально необходимого количества животных.

Приготовление химических реагентов
Метотрексат использовали в качестве средства для предварительной обработки, чтобы облегчить создание экспериментальной модели токсичности метанола. Поскольку фолат-зависимое окисление формиата у крыс протекает более эффективно, чем у людей, предварительная обработка метотрексатом применялась для снижения клиренса формиата и повышения чувствительности к токсичности метанола; он использовался как средство сенсибилизации модели, а не как заменитель воздействия метанола^11,12. Метотрексат был представлен в виде раствора 500 mg/5 mL, что соответствует стоковой концентрации 100 mg/mL. Раствор разбавляли стерильным 0.9% раствором хлорида натрия до получения конечной рабочей концентрации 0.06 mg/mL. Рабочий раствор вводили путем перорального зондирования в дозе 5 mL/kg, что соответствовало дозе метотрексата 0.3 mg/kg. Для крыс весом 200–220 g в начале исследования ежедневный объем введения составлял от 1.00 до 1.10 mL на животное и рассчитывался индивидуально на основе массы тела, зафиксированной при начале исследования. Масса тела в течение 7-дневного периода предварительной обработки метотрексатом повторно не измерялась. Метотрексат вводили один раз в день в течение 7 дней подряд (дни исследования с 1 по 7), а метанол вводили на 8-й день исследования после завершения протокола предварительной обработки метотрексатом. Данный режим соответствовал ранее опубликованным моделям предварительной обработки метотрексатом путем перорального зондирования¹³.

Метанол (чистота ≥99.8%) готовили непосредственно в день введения в виде 20% (v/v) водного рабочего раствора путем разбавления стерильной дистиллированной водой. Рабочий раствор готовили, смешивая 1 объем метанола с 4 объемами стерильной дистиллированной воды. В соответствии с ранее описанными моделями интоксикации метанолом у крыс, предварительно обработанных метотрексатом, группам 3–5 на 8-й день исследования вводили однократную дозу метанола в размере 3 g/kg путем перорального зондирования. Перед введением метанола ограничения в питании и питье не применялись. Необходимый объем введения рассчитывали индивидуально исходя из массы тела каждого животного; для 20% раствора метанола он составлял примерно 18.9 mL/kg. Для крысы весом около 220 g эта доза соответствовала 0.66 g метанола, а итоговый объем зондирования составлял примерно 4.2 mL. Такой режим воздействия метанола был выбран для обеспечения сопоставимости с ранее опубликованными моделями острой токсичности метанола у крыс, предварительно обработанных метотрексатом^13,14,15.

Рабочий раствор фомепизола готовили в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия до конечной концентрации 10 mg/mL. Насыщающую дозу 15 mg/kg вводили внутрибрюшинно через 4 ч после введения метанола, за чем следовали поддерживающие внутрибрюшинные дозы 10 mg/kg через 12, 24 и 36 ч. При рабочей концентрации 10 mg/mL объемы введения составили 1,5 mL/kg для насыщающей дозы и 1,0 mL/kg для каждой поддерживающей дозы. Для крысы с массой тела на момент начала исследования примерно 220 g эти дозы соответствовали примерно 0,33 mL для насыщающей дозы и 0,22 mL для каждой поддерживающей дозы. Все объемы введения рассчитывали исходя из массы тела, зафиксированной в начале исследования. Насыщающая и поддерживающие дозы фомепизола были выбраны с учетом установленных рекомендаций по лечению отравления метанолом^1,6.

В качестве препарата для сравнительного антидотного лечения использовали этанол. Абсолютный этанол (чистота ≥99.8%) разбавляли стерильной дистиллированной водой, смешивая 1 объем абсолютного этанола с 4 объемами стерильной дистиллированной воды для получения конечного 20% (v/v) водного рабочего раствора. Однократную дозу этанола вводили перорально через зонд в дозе 0.5 g/kg через 4 ч после введения метанола; поддерживающие дозы этанола не вводились. Объем введения составлял приблизительно 3.2 mL/kg. Для крысы с массой тела на момент начала исследования около 220 g это соответствовало конечному объему зондирования примерно 0.70 mL. Объем введения рассчитывали исходя из массы тела, зафиксированной в начале исследования. Концентрация, доза, путь и время введения этанола были выбраны на основе ранее опубликованных моделей крыс с предварительным введением метотрексата, в которых этанол использовался в качестве сравнительного антидота^13,14.

Все растворы готовили непосредственно в день введения и проверяли на гомогенность и отсутствие видимых частиц. Пероральное введение осуществляли с помощью канюли для зондирования из нержавеющей стали. При зондировании канюлю осторожно продвигали из ротовой полости в пищевод, избегая регургитации, утечки препарата из полости рта, аспирации и дыхательного дистресса. Внутрибрюшинные инъекции выполняли в асептических условиях, используя стерильные одноразовые шприцы и иглы. Все процедуры, связанные с приготовлением и введением химических веществ, проводили в соответствии с правилами техники безопасности в лаборатории учреждения.

Экспериментальные животные, условия содержания и рандомизация
В общей сложности 30 взрослых самцов крыс линии Wistar (альбиносы) в возрасте 8–12 недель и массой 220 ± 20 g были получены из Лаборатории исследований экспериментальных животных Университета Ahi Evran, Кырышехир, Тюркия. Крысы линии Wistar были выбраны, так как они широко используются в экспериментальных исследованиях токсичности и нефропротекции, что позволяет проводить сравнение с ранее опубликованными работами. Животные содержались при температуре 24 ± 2 °C с 12-часовым циклом свет/темнота. Стандартный гранулированный корм и водопроводная вода предоставлялись ad libitum на протяжении всего 10-дневного экспериментального периода. Перед началом экспериментальных процедур все животные прошли 7-дневный период акклиматизации.

Тридцать крыс были распределены по пяти экспериментальным группам с помощью процедуры рандомизации с использованием компьютера, с целевым показателем шесть животных на группу. Для каждой крысы генерировалось случайное целое число от 1 до 5, и животное назначалось в соответствующую экспериментальную группу. Как только группа набирала шесть животных, любой последующий результат, указывающий на эту группу, отбрасывался, и генерировалось новое случайное число до тех пор, пока не будет выбрана группа со свободным местом. Эта процедура продолжалась до тех пор, пока все 30 крыс не были распределены, в результате чего в каждой группе оказалось по 6 животных. Один и тот же исследователь генерировал случайные назначения и осуществлял распределение; отдельный оператор по распределению не привлекался. Группа 1 (Контроль) не получала экспериментального лекарственного лечения, и животные проходили тот же график отбора проб в конечных точках, что и остальные группы. Группа 2 (MTX) получала метотрексат перорально через зонд в дозе 0.3 mg/kg в течение 7 дней. Группа 3 (MTX + метанол) получала метотрексат в течение 7 дней, после чего на 8-й день исследования вводился метанол в дозе 3 g/kg. Группа 4 (MTX + метанол + фомепизол) получала предварительное лечение метотрексатом с последующим введением метанола, при этом лечение 4-метилпиразолом начиналось через 4 h. Группа 5 (MTX + метанол + этанол) получала предварительное лечение метотрексатом с последующим введением метанола, после чего через 4 h вводился этанол.

Все три группы, подвергшиеся воздействию метанола, получили одинаковую предварительную терапию MTX и следовали одному и тому же протоколу введения метанола; они различались только в отношении последующего применения антидота. Распределение экспериментальных групп, протокол введения, время применения антидота и процесс сбора образцов обобщены на Рисунке 1. Априорный анализ мощности был проведен для однофакторного ANOVA с фиксированными эффектами для пяти независимых групп. При допущении большого стандартизированного размера эффекта (f Коэна = 0,70), уровне значимости 0,05 и статистической мощности 80% минимальный требуемый общий размер выборки был рассчитан как 30 животных, что соответствует шести животным в каждой группе. Расчетная мощность для общего размера выборки 30 составила примерно 80,9%. Предполагаемый размер эффекта (f Коэна = 0,70) был определен до начала эксперимента, исходя из ожиданий исследователей получить большой общий межгрупповой эффект в данной модели острой токсичности. Это предположение основывалось на суждении исследователя, а не на оценке, полученной из пилотных данных или конкретного предыдущего исследования. Для данного исследования не было заранее определено ни одного основного конечного результата; расчет размера выборки основывался на предполагаемом большом общем эффекте при совокупном сравнении пяти экспериментальных групп. Основной результат не может быть ретроспективно назначен в качестве заранее определенной конечной точки. Соответственно, расчет размера выборки не обеспечивает достаточной мощности для каждого отдельного результата или для попарных сравнений.

Протокол интоксикации метанолом и антидотного лечения
После периода акклиматизации животные в группах 2–5 получали метотрексат один раз в день в течение 7 дней подряд (дни исследования с 1 по 7). На 8-й день исследования животные в группах 3–5 получили однократную дозу 20% раствора метанола в количестве 3 g/kg путем перорального зондирования. Перед введением метанола голодание или иные ограничения в еде и воде не применялись.

В группе MTX + метанол + фомепизол через 4 ч после введения метанола вводили нагрузочную дозу фомепизола 15 mg/kg внутрибрюшинно, затем поддерживающие дозы 10 mg/kg вводили внутрибрюшинно через 12, 24 и 36 ч после введения метанола. В группе MTX + метанол + этанол через 4 ч после введения метанола однократно вводили этанол через зонд в дозе 0.5 g/kg перорально; поддерживающие дозы этанола не вводились. Эти две схемы антидотной терапии были выбраны в соответствии с установленными рекомендациями по дозированию фомепизола и ранее опубликованными протоколами сравнения с этанолом^1,6,13,14. Данные схемы не были предназначены для обеспечения сопоставимости по дозе, пути введения или экспозиции. Таким образом, повторное внутрибрюшинное введение фомепизола и однократное пероральное введение этанола представляли собой неравное фармакологическое сравнение. Успешное введение через зонд подтверждалось отсутствием регургитации, вытекания препарата из ротовой полости или респираторного дистресса во время процедуры. Успешное внутрибрюшинное введение подтверждалось отсутствием вытекания препарата, кровотечения или выраженного отека в месте инъекции.

После введения препаратов состояние здоровья животных, их подвижность, потребление пищи, осанка, внешний вид шерсти и признаки токсичности регулярно контролировались. Схема лечения была разработана таким образом, чтобы обеспечить начало образования токсичных метаболитов из метанола, позволяя при этом оценить защитные и терапевтические эффекты антидотов.

Эвтаназия, гуманные конечные точки и сбор образцов
На протяжении всего эксперимента состояние здоровья всех животных, потребление пищи и воды, подвижность и поведенческие изменения оценивались ежедневно. Критерии гуманной конечной точки были определены заранее как выраженная летаргия, невозможность употреблять пищу или воду, резкая потеря веса, ограничение подвижности, аномальная поза, стойкая пилоэрекция или явные признаки дистресса. Для животных, соответствующих любому из этих критериев, была запланирована гуманная эвтаназия. Однако в ходе исследования ни одно животное не достигло предопределенных критериев гуманной конечной точки.

Все животные в пяти экспериментальных группах были подвергнуты эвтаназии на 10-й день исследования. Для групп MTX + Methanol, MTX + Methanol + Fomepizole и MTX + Methanol + Ethanol эта конечная точка соответствовала 48 ч после однократного введения метанола на 8-й день исследования. Контрольная группа оставалась без лечения до 10-го дня исследования, тогда как группа только с MTX наблюдалась до 10-го дня исследования после завершения 7-дневного протокола введения MTX. Таким образом, для всех пяти групп общая продолжительность исследования была одинаковой, и эвтаназия с последующим сбором образцов проводились в один и тот же день исследования.

Для индукции глубокой анестезии использовали кетамин и ксилазин. Глубину анестезии подтверждали по отсутствию педального рефлекса. После достижения глубокой анестезии образцы крови собирали путем интракардиальной пункции. С помощью подходящего шприца и иглы получали примерно 3–5 mL крови. Кровь, предназначенную для определения концентраций мочевины и креатинина в сыворотке, активности СОД в сыворотке и концентрации МДА в сыворотке, переносили в пробирки без антикоагулянтов и оставляли до полного свертывания. Кровь для определения уровня GSH и активности CAT собирали отдельно в пробирки, содержащие этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA), и обрабатывали без стадии свертывания. После полного образования сгустка образцы сыворотки центрифугировали при 3,000 × g в течение 10–15 min при 4 °C. Отделенную сыворотку хранили при −80 °C до проведения анализа. Успешность отделения сыворотки подтверждали по прозрачному виду без признаков гемолиза. После забора крови эвтаназию проводили путем обескровливания под глубокой анестезией. Затем выполняли срединную лапаротомию и осторожно извлекали обе почки. После удаления окружающей жировой и соединительной ткани почки промывали холодным физиологическим раствором. Образцы тканей разделяли для гистопатологического и биохимического анализов. Образцы, предназначенные для гистопатологического исследования, помещали в 10% нейтрально-буферный формальдегид. Образцы для биохимического анализа надлежащим образом маркировали и хранили при −80 °C.

Сбор образцов, биохимические анализы и оценка результатов проводились исследователями, которые не знали, к какой экспериментальной группе относятся животные. Ни одно животное не было исключено из анализа.

Биохимические анализы
Концентрацию мочевины в сыворотке определяли с помощью ферментативного кинетического анализа с использованием уреазы и глутаматдегидрогеназы на автоматическом биохимическом анализаторе. Мочевина гидролизовалась уреазой с образованием аммиака, который затем в присутствии глутаматдегидрогеназы вступал в реакцию с 2-оксоглутаратом и восстановленным никотинамидадениндинуклеотидом (NADH). Снижение абсорбции, вызванное потреблением NADH, измеряли кинетически. Концентрацию креатинина в сыворотке определяли колориметрическим методом на том же автоматическом биохимическом анализаторе.

Активность супероксиддисмутазы (SOD) в сыворотке определяли с помощью колориметрического анализа, основанного на генерации супероксидного радикала системой ксантин–ксантиноксидаза и его реакции с 2-(4-йодфенил)-3-(4-нитрофенил)-5-фенилтетразолиумхлоридом с образованием окрашенного продукта — формазана. Конечную абсорбцию измеряли при 505 nm. Концентрацию малонового диальдегида (MDA) в сыворотке определяли с помощью реакции с тиобарбитуровой кислотой. Образцы сыворотки смешивали с холодным трихлоруксусной кислотой для осаждения белков и центрифугировали при 7,500 × g в течение 5 min при 4 °C. Полученный супернатант смешивали с равным объемом тиобарбитуровой кислоты и инкубировали при 90 °C в течение 60 min. Затем пробирки с реакционной смесью охлаждали в водяной бане при низкой температуре в течение 10 min и измеряли абсорбцию при 532 nm. Концентрации MDA рассчитывали по соответствующей калибровочной кривой. Содержание восстановленного глутатиона (GSH) в крови с ЭДТА-антикоагулянтом измеряли модифицированным методом Эллмана. После осаждения белков трихлоруксусной кислотой депротеинизированные образцы вводили в реакцию с 5,5′-дитиобис(2-нитробензойной кислотой) в 500 mM Трис-буфере при pH 8.2, затем измеряли абсорбцию при 412 nm. Активность каталазы (CAT) в крови с ЭДТА-антикоагулянтом измеряли с помощью двухэтапного колориметрического анализа. Образцы инкубировали с известным количеством перекиси водорода, и после прекращения ферментативной реакции количество остаточной перекиси водорода определяли с использованием хромогенного реагента при 405 nm.

Поскольку активность SOD и концентрация MDA измерялись в сыворотке крови, а уровень GSH и активность CAT — в крови с антикоагулянтом ЭДТА, а не в гомогенатах тканей почек, нормализация этих окислительно-восстановительных параметров по общей концентрации белка в тканях не применялась. Для интерпретации профиля окислительно-восстановительных биомаркеров более высокие концентрации MDA в сыворотке рассматривались как признак усиленного перекисного окисления липидов, в то время как более низкая активность SOD в сыворотке, уровни GSH в крови и активность CAT в крови считались признаками снижения антиоксидантной способности; изменения в противоположном направлении интерпретировались как более благоприятный окислительно-восстановительный профиль.

Для проведения иммуноферментного анализа (ELISA) тканей почек примерно 50 mg ткани почек, хранившейся при −80 °C, гомогенизировали на льду в 500 µL буфера для гомогенизации, содержащего коктейль ингибиторов протеаз, что соответствует фиксированному соотношению ткани к буферу 1:10 (масса/объем). Для каждой крысы готовили один индивидуальный гомогенат ткани почек. Образцы от разных животных обрабатывали независимо, не объединяя их на żadном этапе. Гомогенаты центрифугировали при 14,000 × g в течение 10 min при 4 °C; супернадант, полученный от каждого животного, собирали отдельно и разделяли на аликвоты для запланированных анализов тканей почек. Общая концентрация белка отдельно не измерялась, поэтому результаты ELISA тканей не нормировали по этому показателю. Конечные концентрации, рассчитанные по соответствующим стандартным кривым для каждого анализа, выражали в ng/L для TNF-α и IL-6 и в ng/mL для IL-1β, KIM-1 и цистатина C.

Молекула повреждения почек-1 (KIM-1) и цистатин С оценивались в качестве биомаркеров повреждения почек, в то время как фактор некроза опухоли-α (TNF-α), интерлейкин-6 (IL-6) и интерлейкин-1β (IL-1β) оценивались как маркеры воспаления почек. Содержание всех пяти аналитов в гомогенатах тканей почек измеряли с помощью наборов ELISA, специфичных для крыс, согласно протоколам производителей. Для соответствующих анализов аналитическая чувствительность и диапазон измерений составили 2,51 ng/L и 5–1 000 ng/L для TNF-α, 0,052 ng/L и 0,1–40 ng/L для IL-6, 0,08 ng/mL и 0,2–60 ng/mL для IL-1β, 0,01 ng/mL и 0,05–10 ng/mL для KIM-1 и 0,25 ng/mL и 0,5–100 ng/mL для цистатина С соответственно. Перед анализом все реагенты, стандарты и супернатанты тканей почек доводили до комнатной температуры. Стандартные кривые строили отдельно для каждого цикла анализа в соответствии с рекомендациями производителя. Стандарты и супернатанты тканей почек добавляли в лунки, предварительно покрытые антителами, после чего добавляли соответствующее биотинилированное детектирующее антитело и конъюгат стрептавидина с пероксидазой хрена. Образцы и реагенты ELISA инкубировали в течение 1 h при 37 °C. После пяти циклов промывки с использованием автоматического мойщика микропланшетов добавляли растворы субстрата A и B и инкубировали в течение 10 min при 37 °C. Цветовую реакцию останавливали с помощью кислого стоп-раствора, и измеряли оптическую плотность при 450 nm. Для каждого аналита значения оптической плотности с поправкой на холостую пробу переводили в концентрации с использованием соответствующей стандартной кривой для данного анализа.

Все биохимические анализы проводились в стандартизированных условиях, и все образцы обрабатывались по одним и тем же процедурам. Измерения методом ELISA в тканях почек проводились в двух повторностях. Для каждого аналита рассчитывалось среднее значение двух технических повторностей, чтобы получить одно значение на уровне одного животного. Технические повторности и отдельные аликвоты, полученные из одного и того же гомогената конкретного животного, не считались независимыми наблюдениями. В качестве экспериментальной единицы рассматривалось отдельное животное, и в статистический анализ включался один результат на уровне животного для каждого параметра.

Гистопатологическая обработка и оценка степени повреждения почек
Образцы тканей были подготовлены для микроскопического исследования с использованием стандартных гистопатологических процедур. Ткани почек фиксировали в 10% нейтрально буферизированном формальдегиде при комнатной температуре в течение 72 h. После фиксации ткани подвергали дегидратации в сериях этанола с возрастающей концентрацией: 50%, 70%, 80%, 96% и 100%, выдерживая в каждой концентрации по 1 h. Затем ткани проходили стадию просветления в два этапа с использованием ксилола и были залиты в парафиновые блоки. С помощью ротационного микротома из парафиновых блоков изготавливали срезы толщиной 5 µm.

Для окрашивания гематоксилином и эозином срезы депарафинизировали и регидратировали, окрашивали гематоксилином в течение 5 min и промывали под проточной водопроводной водой в течение 5 min. Дифференцировку проводили с использованием кислотного спирта, после чего срезы выдерживали в растворе аммиака в течение 1 min. Затем срезы подвергали доокрашиванию эозином в течение 2 min. Впоследствии срезы дегидратировали в серии возрастающих концентраций спирта, просветляли в ксилоле и заключали в соответствующий среду для заключения.

Для окрашивания по методу трихрома Массона срезы депарафинизировали и регидратировали, затем инкубировали в протравливающем растворе при 56 °C в течение 60 min и промывали под проточной водой в течение 10 min. После этого срезы последовательно обрабатывали железистым гематоксилином по Вайгерту в течение 10 min, смесью биэбриховой scarlet-кислого фуксина в течение 15 min, фосфорно-вольфрамовой кислотой в течение 10 min и анилиновым синим в течение 10 min. На заключительном этапе срезы выдерживали в 1% уксусной кислоте в течение 5 min, дегидратировали, просветляли в ксилоле и заключали в среду.

Успешность окрашивания подтверждалась четким окрашиванием ядер, сохранностью цитоплазматического контраста, сохранением структуры почек и отчетливой визуализацией структур соединительной ткани. Все окрашенные препараты оценивали в стандартных условиях с помощью светового микроскопа, оснащенного системой цифровой визуализации.

Гистопатологическую оценку проводил один опытный патологоанатом, который не знал о принадлежности животных к экспериментальным группам. Гистопатологический скоринг выполнялся при 200× увеличении. Для каждого животного и каждого гистопатологического параметра исследовали 10 случайно выбранных микроскопических полей. Поле с наиболее выраженными изменениями для оцениваемого параметра использовалось для присвоения животному единого целочисленного балла по шкале 0–4. Повреждение канальцев оценивали по степени расширения канальцев, накоплению белкового материала в просвете канальцев, дегенерации эпителия канальцев и некрозу канальцев. Повреждение клубочков оценивали по дегенерации или атрофии клубочков, расширению полости капсулы Боумена и сосудистому полнокровию. Интерстициальное повреждение оценивали на основании интерстициального воспаления и фиброза. Для гистопатологического анализа использовали срезы почек каждого животного толщиной 5 мкм, окрашенные гематоксилином и эозином, а также по методу Массона. Репрезентативные микрофотографии были получены при 200× увеличении, масштабные отрезки соответствуют 100 µm. Количество отдельных гистологических срезов, исследованных для каждого животного, не было сохранено в записях исследования и, следовательно, не может быть указано.

Результаты окрашивания по Массону интерпретировали гистоморфологически, учитывая локализацию и морфологический характер отложения коллагена, а не только интенсивность синего окрашивания. Полуколичественная оценка интерстициального фиброза основывалась на этом гистоморфологическом анализе; процент коллаген-положительной площади количественно не определяли. Гистопатологическую оценку проводили полуколичественно, используя ранее описанные критерии оценки повреждения почек^16,17. Каждому животному присваивали целое числовое значение для каждого гистопатологического параметра по шкале от 0 до 4, где 0 = отсутствует, 1 = минимальный, 2 = легкий, 3 = умеренный и 4 = выраженный. Категории градаций представляли собой общую оценку морфологической степени тяжести каждого поражения, проведенную патологом «вслепую», а не непрерывное морфометрическое измерение.

Меры предосторожности и утилизация отходов
При работе с метанолом, формальдегидом, ксилолом, биологическими образцами и тканями животных использовались соответствующие средства индивидуальной защиты. Надевались лабораторные халаты, перчатки и средства защиты глаз. В связи с системной токсичностью и летучестью метанола все процедуры выполнялись с осторожностью. Процедуры с использованием формальдегида и ксилола по возможности проводились в химическом вытяжном шкафу. Острые предметы собирались в соответствующие контейнеры для утилизации острых отходов. Химические отходы и биологические материалы утилизировались в соответствии с институциональными процедурами по биобезопасности и обращению с опасными отходами.

Статистический анализ
Непрерывные биохимические показатели, биомаркеры повреждения почек, показатели воспаления, функции почек и окислительно-восстановительного статуса были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (mean ± SD). Нормальность распределения данных оценивали с помощью теста Шапиро–Уилка, а однородность дисперсий — с помощью теста Левена. Сравнение биохимических показателей между группами проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Проверка допущений выявила отклонения от нормального распределения в одной группе для сывороточного креатинина и неоднородность дисперсий для нескольких биохимических показателей. Первоначальный подход с использованием ANOVA был сохранен; тем не менее, эти отклонения могли повлиять на достоверность полученных значений p-value, в связи с чем результаты интерпретировали с осторожностью.

При обнаружении статистически значимого различия с помощью ANOVA проводили попарные сравнения между группами с использованием апостериорного теста Дункана для множественных сравнений. Значения с одинаковыми надстрочными буквами в пределах одной строки не имели статистически значимых различий согласно апостериорному тесту Дункана. Дополнительная поправка на множественность для биохимических показателей не применялась. Процедура Дункана не обеспечивала строгого контроля частоты ошибок I рода для всего семейства тестов, а анализ нескольких показателей дополнительно увеличивал риск получения ложноположительных результатов. В связи с этим результаты отдельных значимых сравнений интерпретировали с осторожностью.

Общие размеры эффекта для биохимических показателей оценивали с помощью эта-квадрат (η²), рассчитанного по формуле (F × df_between)/(F × df_between + df_error), где df_between = 4 и df_error = 25. Двусторонние 95% доверительные интервалы были рассчитаны путем обращения нецентрального F-распределения и преобразования пределов нецентральности (λ) по формуле λ/(λ + N), где N = 30. Эти дополнительные расчеты были выполнены в среде научных вычислений. Оценки были получены на основе округленных значений F-статистики, полученных в ходе основного статистического анализа, и, следовательно, являются приблизительными. Доверительные интервалы основывались на предположениях о нормальности и равенстве дисперсий модели ANOVA и не были скорректированы с учетом множественности исходов.

Гистопатологические баллы представляли собой порядковые полуколичественные показатели, представленные в виде среднего значения ± SD для описания средней степени поражения на уровне группы и вариабельности между животными. Для гистопатологических баллов инференциальное тестирование гипотез или попарные апостериорные сравнения не проводились. Следовательно, ANOVA, апостериорный тест Данкана и расчет значений p применялись только к биохимическим показателям, биомаркерам повреждения почек, показателям воспаления, функции почек и параметрам окислительно-восстановительного статуса. Значение p < 0.05 считалось статистически значимым.

Результаты

Все 30 животных были включены в анализ, по шесть животных в каждой из пяти экспериментальных групп. Все животные из пяти групп были выведены из эксперимента и взяты на анализ на 10-й день исследования. Для трёх групп, подвергшихся воздействию метанола, этот момент соответствовал 48 часам после введения метанола. Таким образом, общая продолжительность исследования и время сбора образцов были одинаковыми для всех экспериментальных групп. Оценку повреждения почек и биомаркеров воспаления, функции почек и параметров, связанных с окислительно-восстановительными процессами, а также гистопатологические находки проводили, как описано ниже.

Биохимические показатели: повреждение почек и биомаркеры воспаления
Результаты исследования повреждения почек и воспалительных биомаркеров, измеренных в гомогенатах почечной ткани, представлены в Таблица 1Однофакторный дисперсионный анализ показал наличие значимых общих различий между пятью группами по уровню цистатина C [F(4,25) = 5,329, p = 0,003], IL-6 [F(4,25) = 3,907, p = 0,013], KIM-1 [F(4,25) = 3,673, p = 0,017], ФНО-α [F(4,25) = 7,660, p < 0,001] и ИЛ-1β [F(4,25) = 11,584, p < 0,001]. Пост-хок сравнения групп проводили с использованием критерия Данкана’множественный тест диапазона, с обозначением принадлежности групп надстрочными буквами в Таблица 1Уровни цистатина C, ИЛ-6 и КИМ-1 в гомогенате почечной ткани были наиболее высокими в группе МТХ + метанол, тогда как значимых различий между группами Контроль, только МТХ, МТХ + метанол + фомепизол и МТХ + метанол + этанол по этим показателям не наблюдалось. Уровни ФНО-α в гомогенате почечной тканиα и ИЛ-1β также были самыми высокими в группе МТХ + метанол. В группе только МТХ наблюдались более высокие уровни ТНФ-α и ИЛ-1β в гомогенатах тканей почек по сравнению с группой контроля, тогда как группы, получавшие антидот, показали промежуточные значения (Таблица 1).

Функция почек и параметры, связанные с окислительно-восстановительными процессами
Показатели функции почек в сыворотке и параметры, связанные с окислительно-восстановительным состоянием, полученные из крови, были представлены в Таблица 2Однофакторный дисперсионный анализ показал наличие значимых общих различий между пятью группами по уровню мочевины в сыворотке [F(4,25) = 3,694, p = 0,017], сывороточный креатинин [F(4,25) = 12,988, p < 0,001], активность сывороточной СОД [F(4,25) = 11,621, p < 0,001], уровень ГСТ в крови [F(4,25) = 10,164, p < 0,001], активность каталазы в крови [F(4,25) = 10,631, p < 0,001] и концентрация МДА в сыворотке [F(4,25) = 8,814, p < 0,001]. Пост-хок сравнения групп проводили с использованием критерия Данкана’множественный тест диапазона, с обозначением принадлежности групп надстрочными буквами в Таблица 2.

Концентрации мочевины в сыворотке, креатинина в сыворотке и МДА в сыворотке были наиболее высокими в группе МТХ + метанол. Концентрации мочевины в сыворотке и МДА в сыворотке не различались достоверно между контрольной группой, группой только МТХ, группой МТХ + метанол + фомепизол и группой МТХ + метанол + этанол, тогда как уровень креатинина в сыворотке был наименьшим в контрольной группе (Таблица 2).

Группа МТХ + метанол также показала наименьшую активность сывороточной СОД, уровень ГСК в крови и активность каталазы в крови. По сравнению с группой МТХ + метанол, группа, получавшая фомепизол, демонстрировала значительно более высокую активность сывороточной СОД и каталазы в крови, тогда как соответствующее повышение в группе, получавшей этанол, не было статистически значимым. Уровень ГСК в крови существенно не различался между группами, получавшими только МТХ, МТХ + метанол и две группы, получавшие антидоты,Таблица 2).

По сравнению с контрольной группой, в группе, получавшей только МТХ, наблюдались более высокие уровни ФНО в гомогенате почечной тканиα и ИЛ-1β и более низкую активность сывороточной СОД, уровень ГСК в крови и активность КАТ, но не имели значимых различий в уровнях цистатина С, ИЛ-6 или КИМ-1 в гомогенате почечной ткани, а также в концентрации мочевины в сыворотке, креатинина в сыворотке или МДА в сыворотке.

Гистопатологические находки и оценки почечных повреждений
Результаты гистопатологического исследования почечных тканей были представлены в Таблица 3Была отмечена описательная вариация между группами по таким признакам, как расширение канальцев, накопление белкового материала, дегенерация эпителия канальцев, некроз канальцев, дегенерация клубочков, увеличение капсулы Боумена’пространство, васкулярная гиперемия, интерстициальное воспаление и интерстициальный фиброз

В группе контроля почечная ткань сохраняла нормальную гистологическую структуру, патологические изменения в клубочковых или канальцевых структурах не выявлены. В группе МТХ наблюдались умеренная дегенерация канальцев, васкулярный застой и интерстициальное воспаление.

Группа МТХ + метанол показала наивысшие значения повреждений по оцениваемым параметрам канальцев, клубочков, сосудов и интерстиция. Обе группы, получавшие антидоты, имели описательно более низкие значения повреждений по сравнению с группой МТХ + метанол. При описательном сравнении группа, получавшая фомепизол, демонстрировала более низкие значения повреждений по сравнению с группой, получавшей этанол, по большинству параметров, в особенности по степени расширения канальцев, некрозу канальцев, дегенерации клубочков, увеличению капсулы Боумена’пространство, васкулярная гиперемия и интерстициальный фиброз (Таблица 3). Эти сравнения носили описательный характер, и никакие статистические выводы по гистопатологическим показателям не проводились. Представительные изображения гистопатологии почек, полученные с использованием гематоксилина и эозина и по Массону’окрашивании по методу трихрома показаны в Рисунок 2.

В целом, группа МТХ + метанол показала наиболее высокие значения почечного повреждения и воспалительных биомаркеров, наименее благоприятные показатели функции почек и редокс-статуса, а также наибольшие баллы гистопатологического повреждения. Обе группы, получавшие антидоты, демонстрировали более благоприятные показатели состояния почек по сравнению с группой МТХ + метанол, причём группа, получавшая фомепизол, показала более стабильно положительные результаты по всем оцениваемым параметрам. Группа только с МТХ также продемонстрировала изменения отдельных параметров, связанных с воспалением и редокс-статусом, по сравнению с контрольной группой.

НАЛИЧИЕ ДАННЫХ:
Сырые данные на уровне животных, подтверждающие биохимические, маркеры повреждения почек, воспалительные, функциональные почечные и редокс-связанные анализы, представлены в Дополнительный файл 1.

Рисунок 1: Схема эксперимента и временная шкала вмешательства. Схематическое представление экспериментальной модели отравления метанолом у крыс. Взрослых самцов белых крыс линии Вистар распределили на пять групп: контрольная, только метотрексат (MTX), MTX + метанол, MTX + метанол + фомепизол и MTX + метанол + этанол (n = 6 в группе). В течение 10-дневного исследования животным предоставляли стандартный гранулированный корм и водопроводную воду ad libitum; до или после введения метанола голодание или иные ограничения в питании и воде не применялись. Контрольной группе не проводили никакого экспериментального воздействия. Животным во 2-й группе–5 получали МТХ перорально с помощью зонда в дозе 0,3 мг/кг один раз в сутки в течение семи последовательных дней (дни исследования 1–7). Животные в группах 3–5 получали однократную дозу метанола в количестве 3 г/кг перорально с помощью зонда на 8-й день исследования. В группе МТХ + Метанол + Фомепизол начальную дозу фомепизола в количестве 15 мг/кг вводили внутрибрюшинно через 4 ч после введения метанола, затем вводили поддерживающие дозы по 10 мг/кг через 12, 24 и 36 ч. В группе МТХ + Метанол + Этанол этанол вводили однократно в дозе 0,5 г/кг перорально с помощью зонда через 4 ч после введения метанола. Все животные были выведены из эксперимента на 10-й день исследования. Для групп 3–5, что соответствовало 48 ч после введения метанола. Образцы крови и почек были собраны для анализа функции почек, биомаркеров почечного повреждения, воспалительных цитокинов, биомаркеров, связанных с окислительно-восстановительными процессами, а также гистопатологии почек. Сокращения: MTX = метотрексат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Типичные гистопатологические находки в почечной ткани из экспериментальных групп. Представлены типичные срезы почек из групп Контроль, MTX, MTX + Метанол, MTX + Метанол + Фомепизол и MTX + Метанол + Этанол. Верхний ряд показывает окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) окрашивание, тогда как нижний ряд представляет Masson’окрашивание по методу трихром. В группе контроля сохранялась нормальная почечная архитектоника с обычной морфологией клубочков и канальцев. Синее окрашивание коллагена, выявленное в базальных мембранах клубочков и канальцев, стенках сосудов и интерстициальной соединительной ткани в группе контроля, рассматривалось как физиологический коллаген, а не как признак патологического фиброза. В группе МТХ наблюдались умеренная дегенерация канальцев, сосудистый полнокровие и воспалительные изменения. В группе МТХ + метанол отмечалось более выраженнное повреждение почек, характеризующееся дегенерацией канальцев (*), сосудистым полнокровием (+), расширением капсулы Боумена’s пространство (x), трубчатый некроз (↑), интерстициальный воспалительный процесс (↕) и накопление коллагена в перигломерулярной области, соответствующее гистоморфологическим признакам фибротических изменений (‡), как наблюдалось в реакции Массона’окрашенном по методу трихром. Группа, получавшая фомепизол, показала более низкие баллы гистопатологического повреждения по сравнению с группой МТХ + метанол, с относительно сохранными тубулярными и клубочковыми структурами и менее выраженным некрозом, воспалением, васкулярным полнокровием и изменениями, связанными с коллагеном. Группа, получавшая этанол, также показала более низкие баллы гистопатологического повреждения по сравнению с группой МТХ + метанол; однако остаточные тубулярные, клубочковые и сосудистые изменения были более выражены, чем в группе, получавшей фомепизол. Фотомикрографии получены при увеличении 200× увеличение, а масштабные линейки соответствуют 100 µм. Массон’окрашивание по методу Массона использовали в качестве вспомогательного гистоморфологического подтверждения; различия в интенсивности синей окраски между образцами не использовали в качестве количественного показателя для межгруппового сравнения выраженности фиброза. Обозначения: * дегенерация канальцев; + васкулярный полнокровие; x расширение капсулы Боумена’s пространство; ↑ тубулярный некроз; ↕ воспаление интерстициальной ткани; ‡ накопление перигломерулярного коллагена, соответствующее фибротическим гистоморфологическим изменениям. МТХ, метотрексат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Переменная	Контроль (n = 6)	MTX (n = 6)	MTX + метанол (n = 6)	MTX + метанол + фомепизол (n = 6)	MTX + метанол + этанол (n = 6)	p	η² (95% ДИ)
Цистатин C (нг/мл)	26.07 ± 12.05a	32.01 ± 1.86a	45.23 ± 10.51b	32.49 ± 1.60a	31.27 ± 4.60a	0.003	0.460 (0.084 – 0.597)
ИЛ-6 (нг/л)	7.66 ± 1.38a	8.72 ± 2.45a	11.02 ± 0.83b	7.96 ± 1.54a	8.12 ± 1.77a	0.013	0.385 (0.023 – 0.535)
KIM-1 (нг/мл)	2.21 ± 1.00a	2.47 ± 0.24a	3.45 ± 0.81b	2.28 ± 0.58a	2.32 ± 0.37a	0.017	0.370 (0.013 – 0.522)
TNF-α (нг/л)	118.66 ± 22.95a	190.51 ± 5.84b	238.29 ± 34.68c	147.10 ± 24.31аб	168.41 ± 75.41аб	<0.001	0.551 (0.181 – 0.668)
ИЛ-1β (нг/мл)	8.43 ± 0.59a	12.53 ± 1.05c	15.26 ± 1.46d	10.05 ± 2.86аб	11.17 ± 2.37бк	<0.001	0.650 (0.316 – 0.743)

Таблица 1: Почкиевые повреждения и биомаркеры воспаления в экспериментальных группах. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD), по шесть животных в группе. Все биомаркеры определяли в гомогенатах почечной ткани. Цистатин C, KIM-1 и IL-1β концентрации выражены в нг/мл; ИЛ-6 и ФНО-α концентрации выражены в нг/л. Указано p значения получены с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) по пяти группам. После получения значимого результата общего теста, пост-хок сравнения проводились с использованием критерия Данкана’множественный диапазонный тест. В каждой строке группы, имеющие хотя бы одну общую надстрочную букву, не различаются значимо, тогда как группы без общих букв различаются значимо на уровне 0,05. Дополнительная коррекция на множественность не применялась при сравнении биомаркеров. Среди некоторых биомаркеров была выявлена гетерогенность дисперсий; поэтому результаты дисперсионного анализа и теста Данкана следует интерпретировать с осторожностью. Сокращения: MTX = метотрексат; KIM-1 = молекула повреждения почек-1; IL-6 = интерлейкин-6; TNF-α = фактор некроза опухоли-альфа; ИЛ-1β = интерлейкин-1β; SD = стандартное отклонение; ANOVA = дисперсионный анализ; CI = доверительный интервал. η² представляет общую величину эффекта по пяти группам. Двусторонние 95% доверительные интервалы основаны на модели, предполагают нормально распределённые ошибки с равными дисперсиями и не скорректированы на множественные исходы. Следовательно, доверительные интервалы следует интерпретировать с осторожностью, если эти предположения нарушаются.

Переменная	Контроль	MTX	MTX + метанол	MTX + метанол + фомепизол	MTX + метанол + этанол	p	η² (95% ДИ)
Мочевина в сыворотке (мг/дл)	39.64 ± 13.69a	46.88 ± 9.49a	98.75 ± 59.24b	48.03 ± 19.64a	60.44 ± 18.53a	0.017	0.371 (0.014–0.523)
Сывороточный креатинин (мг/дл)	0.50 ± 0.10a	0.54 ± 0.05аб	0.72 ± 0.03c	0.54 ± 0.03аб	0.60 ± 0.05b	<0.001	0.675 (0.356–0.762)
Активность сывороточной СОД (ед/мл)	470.40 ± 40.49d	371.16 ± 17.64c	219.29 ± 85.06a	319.38 ± 107.20бк	256.22 ± 67.89аб	<0.001	0.650 (0.317–0.743)
Глутатион в крови (ммоль/л)	58.74 ± 31.90b	26.36 ± 5.92a	11.10 ± 3.73a	19.56 ± 1.66a	13.66 ± 5.32a	<0.001	0.619 (0.272–0.720)
Активность каталазы в крови (Ед/мл)	220.82 ± 74.08c	160.88 ± 55.18b	68.90 ± 13.41a	129.45 ± 7.49b	110.14 ± 20.18аб	<0.001	0.630 (0.287–0.728)
Сывороточный МДА (нмоль/мл)	13.17 ± 2.03a	17.29 ± 6.36a	31.83 ± 9.94b	17.93 ± 2.04a	19.34 ± 4.65a	<0.001	0.585 (0.225–0.694)

Таблица 2: Показатели функции почек и параметры, связанные с окислительно-восстановительными процессами, в экспериментальных группах. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD), по шесть животных в группе. Концентрации мочевины и креатинина в сыворотке, активность супероксиддисмутазы (SOD) и концентрацию малонового диальдегида (MDA) определяли в сыворотке крови, тогда как уровень восстановленного глутатиона (GSH) и активность каталазы (CAT) измеряли в крови, антикоагулированной этилендиаминтетрауксусной кислотой (EDTA). Концентрации мочевины и креатинина в сыворотке выражали в мг/дл, активность SOD и CAT — в Ед/мл, уровни GSH — в ммоль/л, концентрации MDA — в нмоль/мл. Указано p значения получены с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) по пяти группам. После получения значимого результата общего теста, пост-хок сравнения проводились с использованием критерия Данкана’множественный тест диапазона. В каждой строке группы, имеющие хотя бы одну общую надстрочную букву, не различаются значимо, тогда как группы без общих букв различаются значимо на уровне 0,05. Дополнительная коррекция на множественность не применялась при сравнении биомаркеров. Для некоторых показателей была выявлена неоднородность дисперсий; поэтому результаты дисперсионного анализа и теста Данкана следует интерпретировать с осторожностью. Биомаркеры, связанные с окислительно-восстановительными процессами, являются косвенными индикаторами и не представляют собой прямых измерений функции митохондрий или молекулярных механизмов повреждения. η² представляет общую величину эффекта по пяти группам. Двусторонние 95% доверительные интервалы основаны на модели, предполагают нормально распределённые ошибки с равными дисперсиями и не скорректированы на множественные исходы. Следовательно, доверительные интервалы следует интерпретировать с осторожностью, если эти предположения нарушаются. Сокращения: MTX = метотрексат; SOD = супероксиддисмутаза; GSH = восстановленный глутатион; CAT = каталаза; MDA = малоновый диальдегид; EDTA = этилендиаминтетрауксусная кислота; SD = стандартное отклонение; ANOVA = дисперсионный анализ; CI = доверительный интервал.

Переменная	Контроль	MTX	MTX + метанол	MTX + метанол  + Фомепизол	MTX + метанол + этанол
Тубулярное расширение	0.16 ± 0.40	1.50 ± 0.54	3.50 ± 0.54	0.83 ± 0.40	1.66 ± 0.51
Накопление белкового материала	0.00 ± 0.00	1.33 ± 0.51	3.16 ± 0.40	0.66 ± 0.51	1.33 ± 0.51
Дегенерация трубочного эпителия	0.16 ± 0.40	1.83 ± 0.40	3.83 ± 0.40	1.00 ± 0.00	2.00 ± 0.00
Тубулярный некроз	0.00 ± 0.00	1.00 ± 0.00	3.33 ± 0.51	0.83 ± 0.40	1.33 ± 0.51
Дегенерация клубочков	0.16 ± 0.40	1.33 ± 0.51	3.33 ± 0.51	1.00 ± 0.00	1.66 ± 0.51
Боумен'увеличение пространства	0.00 ± 0.00	1.16 ± 0.40	3.00 ± 0.00	0.83 ± 0.40	1.66 ± 0.51
Сосудистый застой	0.00 ± 0.00	1.33 ± 0.51	3.16 ± 0.40	0.83 ± 0.40	1.66 ± 0.51
Интерстициальное воспаление	0.00 ± 0.00	1.00 ± 0.00	3.00 ± 0.63	0.83 ± 0.40	1.16 ± 0.40
Интерстициальный фиброз	0.00 ± 0.00	1.00 ± 0.00	2.83 ± 0.40	0.66 ± 0.51	1.16 ± 0.40

Таблица 3: Описательные гистопатологические баллы в экспериментальных группах. Данные представлены описательно как среднее ± стандартное отклонение (SD), по шесть животных в группе. Гистопатологические оценки были получены по срезам почек, окрашенным гематоксилином и эозином (H&и Массон’трихром; значения оценок являются безразмерными. Каждому животному присваивалась одна целочисленная оценка по каждому гистопатологическому параметру по шкале от 0–4, где 0 = отсутствует, 1 = минимально, 2 = умеренно, 3 = выражено, 4 = тяжелое. Десятичные значения, представленные в таблице, отражают средние арифметические значения индивидуальных целочисленных показателей, полученных от шести животных в каждой экспериментальной группе, и не представляют собой оценки отдельных животных или непрерывную систему оценки. Стандартные отклонения отражают вариабельность между животными в пределах каждой группы. Статистический анализ с использованием методов индуктивной статистики или пост-хок парных сравнений для гистопатологических оценок не проводился; поэтому выявленные различия между группами следует интерпретировать описательно, а не как статистически значимые различия. Гистопатологическая оценка включала расширение канальцев, накопление белкового материала, дегенерацию эпителия канальцев, некроз канальцев, дегенерацию клубочков, увеличение капсулы Боумена’пространство, васкулярная гиперемия, интерстициальное воспаление и интерстициальный фиброз

Дополнительный файл 1: Исходные данные, подтверждающие биохимический анализЭта таблица содержит исходные данные на уровне животных, использованные для биохимического, почечного биомаркерного, воспалительного и редокс-связанного анализов, описанных в рукописи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Основным выводом данного исследования стало то, что в группе MTX + метанол наблюдался наиболее выраженный профиль повреждения почек по функциональным, воспалительным, редокс-зависимым и гистопатологическим показателям. В этой группе были зафиксированы самые высокие уровни мочевины в сыворотке, креатинина в сыворотке, цистатина C в почках, KIM-1, TNF-α, IL-6, IL-1β и MDA, а также самая низкая активность SOD, уровни GSH и активность CAT, что сопровождалось наивысшими показателями гистопатологического повреждения. В обеих группах, получавших антидоты, наблюдались более благоприятные показатели состояния почек, чем в группе MTX + метанол, при этом в группе, получавшей фомепизол, эти показатели были более стабильно благоприятными по всем оцениваемым параметрам. Однако данные результаты были получены на остром модели крыс с предварительным введением MTX при использовании разных режимов применения антидотов: повторным внутрибрюшным введением фомепизола против однократного перорального введения этанола. Различия в путях введения и частоте дозирования ограничивают возможность прямого сравнения нефропротективной эффективности, и наблюдаемые результаты не позволяют установить превосходство фомепизола над этанолом. В группе только с MTX уровни TNF-α и IL-1β были выше, а активность SOD, уровни GSH и активность CAT ниже, чем в контрольной группе, в то время как уровни цистатина C в почках, IL-6, KIM-1, мочевины в сыворотке, креатинина в сыворотке и MDA оставались статистически сопоставимыми между группами. Такая картина указывает на то, что предварительное введение MTX способствовало формированию фонового воспалительного и редокс-профиля. Соответственно, дополнительные изменения, наблюдаемые в группе MTX + метанол, возникли на фоне предварительного введения MTX и не могли быть приписаны исключительно метанолу. Поскольку группа только с метанолом в исследование не включалась, независимый вклад метанола и потенциальные взаимодействия между MTX и метанолом не могли быть полностью разделены.

Исходя из установленных данных о токсикологии метанола, накопление токсичных метаболитов представляло собой вероятный фактор развития повреждения почек. Метанол метаболизируется преимущественно в печени под действием ADH с образованием формальдегида и последующим переходом в муравьиную кислоту^1,3,18,19,20. Таким образом, на почки могли воздействовать прежде всего циркулирующий формиат и вызванные им системные метаболические нарушения, а не интенсивный локальный метаболизм метанола. Однако нельзя исключать вклад метаболизма спирта или альдегида в тканях почек, поскольку концентрации метанола, формальдегида и формиата, а также активность ADH в почках не измерялись. Муравьиная кислота ингибирует митохондриальную цитохром-c-оксидазу, нарушая тем самым окислительное фосфорилирование, снижая выработку ATP и вызывая гистотоксическую гипоксию; этот процесс может привести к лактоацидозу, повышенной генерации активных форм кислорода и повреждению мембран^1,2,3,19,20. По сравнению с печенью, которая является основным местом метаболизма метанола, почки могут быть особенно чувствительны к последующим эффектам формиата и системным метаболическим нарушениям. Эпителиальные клетки проксимальных канальцев имеют высокие энергетические потребности и особенно уязвимы к митохондриальной дисфункции, окислительному стрессу и нарушениям микроциркуляции. Следовательно, опосредованная формиатом гипоксия, метаболический ацидоз и воспаление могут способствовать повреждению почек^{2,8,9,21,22,23}. Клинические исследования, демонстрирующие связь острого повреждения почек с метаболическим ацидозом, дыхательной недостаточностью, рабдомиолизом, сепсисом и полиорганной недостаточностью, позволяют предположить, что повреждение почек может отражать общую системную токсическую нагрузку^8,9,10,21. Более быстрое фолат-зависимое окисление формиата у крыс по сравнению с людьми представляло собой существенное ограничение экспериментальных моделей^1,11,12. Соответственно, предварительное введение метотрексата использовалось для снижения клиренса формиата и повышения чувствительности к токсичности метанола, а не для полного воспроизведения клинических и метаболических особенностей отравления метанолом у человека.

Почечная дисфункция была продемонстрирована посредством комбинированной оценки стандартных биохимических параметров и биомаркеров повреждения почек. Повышенные концентрации мочевины и креатинина в сыворотке крови в группе MTX + Methanol свидетельствовали о нарушении фильтрационной и экскреторной способности почек. Повышенные уровни цистатина C и KIM-1 в почках указывали на то, что функциональные нарушения сопровождались повреждением канальцев. Учитывая связь KIM-1 с повреждением проксимальных канальцев, данное повышение соответствовало дегенерации, дилатации и некрозу эпителия канальцев^24,25. Повышение уровней цистатина C также подтверждало наличие нарушения функции почек^26,27. Более низкие уровни этих биомаркеров в группах, получавших фомепизол и этанол, свидетельствовали о смягчении повреждения почек, при этом более выраженная тенденция наблюдалась в группе, получавшей фомепизол. Характер изменения биомаркеров редокс-статуса указывал на окислительный стресс как на возможный фактор повреждения почек, а не на доказанный механизм. MDA обычно используется в качестве индекса перекисного окисления липидов, тогда как GSH способствует поддержанию клеточного редокс-гомеостаза^28,29. В экспериментальных моделях интоксикации метанолом и ассоциированной с метанолом оптической нейропатии окислительный стресс, перекисное окисление липидов и снижение антиоксидантной способности также были связаны с повреждением тканей^10,15,20. Снижение активности SOD в сыворотке, повышение концентрации MDA в сыворотке, а также снижение уровней GSH в крови и активности CAT в группе MTX + Methanol соответствовали снижению антиоксидантной способности и усилению перекисного окисления липидов; однако эти измерения не позволили установить лежащий в основе митохондриальный или молекулярный механизм. Более низкие концентрации MDA в сыворотке и частичное восстановление активности SOD в сыворотке и CAT в крови в группах, получавших антидоты, соответствовали более благоприятному профилю редокс-биомаркеров, при этом более стабильный благоприятный паттерн наблюдался в группе, получавшей фомепизол.

Более высокие значения TNF-α, IL-6 и IL-1β в группе MTX + метанол соответствовали провоспалительному профилю почек. Поскольку эти цитокины не были специфичны для конкретного пути, а сам MTX был связан с изменениями отдельных маркеров воспаления, полученные данные указывали на воспаление как на возможный фактор, а не как на подтвержденный механизм повреждения почек. Митохондриальная дисфункция, клеточная гипоксия и окислительный стресс, опосредованные муравьиной кислотой, могут служить основой для активации путей воспаления; следовательно, окислительный стресс и воспаление могут развиваться как взаимодополняющие процессы при токсичности метанола^1,2,3,15. В экспериментальных моделях интоксикации метанолом сообщалось о связи воздействия метанола с инфильтрацией воспалительных клеток, гистопатологическими повреждениями и повышенным уровнем провоспалительных маркеров, таких как IL-1β и TNF-α^13,15. Эти результаты согласуются с повышенными уровнями провоспалительных цитокинов и высокими показателями интерстициального воспаления, тубулярной дегенерации и тубулярного некроза, наблюдаемыми в группе MTX + метанол. В совокупности эти данные соответствовали многофакторному процессу, включающему воздействие токсичных метаболитов, окислительный стресс, воспаление, нарушение микроциркуляции и системную токсическую нагрузку; однако эти пути не оценивались напрямую. Более низкие уровни TNF-α, IL-6 и IL-1β в группах, получавших антидот, позволяют предположить, что ингибирование образования токсичных метаболитов также могло ограничить воспалительную реакцию. Гистопатологические данные предоставили корреляты повреждения почек на тканевом уровне, при этом в группе MTX + метанол наблюдались самые высокие показатели повреждения по тубулярным, гломерулярным, сосудистым и интерстициальным параметрам. В обеих группах, получавших антидот, показатели гистопатологического повреждения были описательно ниже, а в группе, получавшей фомепизол, показатели были описательно ниже, чем в группе, получавшей этанол, по большинству параметров. Однако, поскольку статистическая проверка гистопатологических показателей не проводилась, эти наблюдения не подтвердили статистически значимую гистопатологическую защиту или превосходство какого-либо из антидотов^16,17.

Антидотное действие этанола и фомепизола при интоксикации метанолом основано на подавлении метаболизма, опосредованного алкогольдегидрогеназой, что снижает образование формальдегида и муравьиной кислоты. Этанол выступает в роли конкурентного субстрата, в то время как фомепизол функционирует как прямой и мощный ингибитор алкогольдегидрогеназы^{1,3,4,6,7,30,31,32}. Более благоприятные показатели исходов для почек, наблюдаемые в обеих группах, получавших антидот, соответствовали ожидаемым эффектам ингибирования алкогольдегидрогеназы. Тем не менее, в текущей литературе не представлено данных о неоспоримом клиническом превосходстве фомепизола над этанолом. Хотя фомепизол часто предпочтительнее из-за более простого дозирования, предсказуемой фармакокинетики и меньшего профиля побочных эффектов, этанол остается эффективной альтернативой^{1,3,4,6,7,30,32}. В данных по массовым отравлениям метанолом, представленных Zakharov et al., не было выявлено явных различий между двумя антидотами по показателям смертности, продолжительности пребывания в отделении интенсивной терапии или необходимости проведения диализа; следовательно, интерпретации относительно клинического превосходства требуют осторожности⁵. При использовании апостериорного критерия Дункана не было выявлено статистически значимых прямых различий в биохимических исходах между группами, получавшими фомепизол и этанол. Более того, фомепизол вводился многократно, тогда как этанол вводился однократно. Режимы введения не были сопоставимы по пути введения, частоте дозирования или системной экспозиции. Следовательно, описательно более благоприятная динамика, связанная с применением фомепизола, могла отражать различия в графике дозирования, пути введения или экспозиции препарата, помимо различий между самими антидотами, и не доказывала более высокую биохимическую эффективность, клиническое превосходство или предпочтительность данного метода лечения^5,6,30,32. Основным преимуществом исследования стала комплексная оценка уровней мочевины и креатинина в сыворотке крови, цистатина C, KIM-1, провоспалительных цитокинов, окислительно-восстановительных биомаркеров и гистопатологических показателей в рамках взаимодополняющих функциональных, тубулярных, воспалительных, редокс-зависимых и структурных областей. Данная модель, ориентированная на повреждение почек, может стать полезной доклинической основой для оценки режимов антидотной терапии, дополнительных ренопротекторных вмешательств и биомаркеров повреждения почек в условиях сниженного фолат-зависимого клиренса формиата^8,9,10,21.

Интерпретация результатов была ограничена рядом факторов. Возможность прямого обобщения данных на клинические случаи интоксикации метанолом была ограничена использованием экспериментальной модели на животных и межвидовыми метаболическими различиями. Метотрексат может оказывать независимое влияние на почечные, воспалительные и окислительные показатели³³, а отсутствие группы, получавшей только метанол, не позволило полностью отделить эффекты метанола от потенциальных взаимодействий между MTX и метанолом. Концентрации метанола, формальдегида, формиата, этанола и фомепизола в сыворотке крови или тканях не измерялись, а активность ADH в неочищенной фракции цитозоля почек не оценивалась; следовательно, метаболическая сенсибилизация, образование токсичных метаболитов, воздействие антидота и ингибирование метаболизма метанола не могли быть подтверждены напрямую, и корреляционный анализ с биохимическими показателями функции почек не был проведен. Кислотно-основные показатели, включая pH, уровень бикарбоната, избыток оснований и анионный разрыв, не измерялись. Период наблюдения в течение 48 h позволял оценить только острые исходы для почек и не давал возможности установить факт восстановления почек, стойкость или обратимость повреждений, а также хронические структурные изменения. Окрашивание трихромом по Массону оценивалось гистоморфологически без количественного измерения площади коллаген-положительных зон, а молекулярные или биохимические маркеры фиброза, включая экспрессию α-smooth muscle actin, содержание коллагена и концентрацию 4-hydroxyproline, не оценивались. Гистопатологическая оценка, проведенная одним слепым патологом, исключила возможность оценки межэкспертного согласия, а полуколичественная градация поражений потенциально оставалась зависимой от классификации конкретного наблюдателя. Режимы введения антидотов были фармакологически неодинаковы; концентрации в тканях почек, определенные методом ELISA, не были нормализованы по общей концентрации белка; молекулярный анализ митохондриальной функции и путей гибели клеток не проводился; размер выборки был ограничен; в исследование были включены только самцы крыс. Будущие исследования должны включать группы, получавшие только метанол и только MTX, сопоставимые режимы введения антидотов, последовательные измерения концентраций метанола, формиата и антидота, определение активности ADH в почках, измерение кислотно-основного состояния, количественную оценку фиброза, более длительный период наблюдения и надлежащим образом спланированную клиническую валидацию. В заключение, воздействие метанола в данной модели крыс, предварительно получавших метотрексат, было связано с нарушением функции почек, повышением уровня биомаркеров повреждения почек и воспаления, неблагоприятным окислительно-восстановительным профилем и гистопатологическими повреждениями. В обеих группах, получавших антидоты, наблюдались более благоприятные показатели состояния почек, чем в группе MTX + Methanol. Фомепизол продемонстрировал более стабильно благоприятную описательную картину по всем оцениваемым параметрам; однако отсутствие значимых прямых биохимических различий между группами антидотов, описательный характер гистопатологических сравнений, неодинаковые режимы введения антидотов и отсутствие токсикокинетических измерений не позволили сделать выводы о его превосходстве над этанолом. Данные результаты ограничены моделью крыс с предварительным введением метотрексата и не определяют воздействие антидотов на почки при воздействии метанола без предварительного введения метотрексата или при отравлении метанолом у людей. Для оценки воспроизводимости и более широкой применимости этих результатов необходимы дальнейшие исследования, включающие прямые токсикокинетические измерения, механистические оценки, сопоставимые режимы дозирования антидотов и более длительный период наблюдения.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
10% нейтральный буферный формалин	Merck	Не указано	Фиксация тканей для гистопатологического исследования.
Абсолютный этанол (≥99,8%)	Sigma-Aldrich, USA	Не указано	Разводили стерильной дистиллированной водой до получения конечного 20% (об/об) раствора; вводили однократно перорально через зонд в дозе 0,5 г/кг через 4 ч после введения метанола.
Настольная центрифуга	Nüve	NF048	Подготовка образцов и центрифугирование.
Биотинилированные антитела	Компоненты набора ELISA BT Lab	Входит в набор	Детектирующие антитела
Набор для определения CAT (каталазы)	Otto Scientific	Otto3051	Колориметрическое измерение активности каталазы (CAT) в крови с ЭДТА-антикоагулянтом.
Коктейль ингибиторов протеаз cOmplete Mini без ЭДТА	Roche / Sigma-Aldrich	11836170001	Добавляли в буфер для гомогенизации при подготовке гомогенатов тканей почек для анализа ELISA.
Набор для определения креатинина	Otto Scientific	OttoBC139	Оценка уровней креатинина в сыворотке крови.
Цифровой гомогенизатор	Daihan Scientific	HG-15D	Гомогенизация тканей
Автоматический промыватель планшетов ELx50 Auto Strip Washer	Bio-Tek Instruments, USA	ELx50	Промывка при анализе ELISA
Микропланшетный ридер ELx800	Bio-Tek Instruments, USA	ELx800	Измерение абсорбции для анализа ELISA и колориметрических тестов; абсорбция при ELISA измерялась при 450 нм.
Эозин Y (желтоватый)	Merck	1.15935.0025	Гистопатологическое окрашивание
Фомепизол (4-метилпиразол)	Hüsnü Arsan A.., Анкара, Тüркия	Не указано	Готовили в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия до конечной концентрации 10 мг/мл; вводили внутрибрюшинно в виде нагрузочной дозы 15 мг/кг через 4 ч после введения метанола, с последующим введением поддерживающих доз 10 мг/кг через 12, 24 и 36 ч после введения метанола.
Набор для определения GSH (глутатиона)	Otto Scientific	Otto3053	Колориметрическое измерение уровней восстановленного глутатиона (GSH) в крови с ЭДТА-антикоагулянтом.
Раствор гематоксилина по Харрису	BSLAB	BS-002	Гистопатологическое окрашивание
Соляная кислота (HCl)	Merck	7647-01-0	Регулировка pH
IBM SPSS Statistics	IBM Corp.	IBM SPSS Statistics Version 29.0	Статистический анализ; RRID:SCR_016479.
Кетамина гидрохлорид (Ketalar)	Pfizer,USA	Не указано	Общий наркоз перед забором крови и тканей почек.
Световой микроскоп	Nikon Eclipse	Ni-U	Гистопатологическое исследование
Набор для окрашивания по Массону (трихром)	MOSLAB (Medical Olympus Sanayi Tic. Ltd. ti., Тüркия)	BKMTO001	Гистопатологическое окрашивание
Набор для определения MDA (малонового диальдегида)	Otto Scientific	Otto1001	Колориметрическое измерение уровней малонового диальдегида (MDA) в сыворотке в качестве индекса перекисного окисления липидов.
Метанол (≥99,8%)	Sigma-Aldrich, USA	322415	Вводили перорально (3 г/кг) для индукции экспериментального отравления метанолом.
Метотрексат (Emthexate 500 мг/5 мл)	Teva Pharma Belgium	Не указано	Коммерческая формуляция 100 мг/мл разводили стерильным 0,9% раствором хлорида натрия до получения конечной рабочей концентрации 0,06 мг/мл; вводили перорально через зонд в объеме 5 мл/кг, что соответствует 0,3 мг/кг, один раз в день в течение 7 дней подряд.
Биохимический анализатор Mindray	Mindray	BS-400	Измерение уровней мочевины и креатинина в сыворотке крови.
Парафин, гистологической чистоты	Не указано	Не указано	Заливка тканей.
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	Merck	P4417	Промывание тканей
Набор ELISA для определения цистатина-C крысы	BT Lab, China	E0145Ra	Количественное определение уровней цистатина C в гомогенатах тканей почек; аналитическая чувствительность 0,25 нг/мл; диапазон детектирования 0,5–100 нг/мл.
Набор ELISA для определения IL-1β крысы	BT Lab, China	E0119Ra	Количественное определение уровней IL-1β в гомогенатах тканей почек; аналитическая чувствительность 0,08 нг/мл; диапазон детектирования 0,2–60 нг/мл.
Набор ELISA для определения IL-6 крысы	BT Lab, China	E0135Ra	Количественное определение уровней IL-6 в гомогенатах тканей почек; аналитическая чувствительность 0,052 нг/л; диапазон детектирования 0,1–40 нг/л.
Набор ELISA для определения KIM-1 крысы	BT Lab, China	E0549Ra	Количественное определение уровней KIM-1 в гомогенатах тканей почек; аналитическая чувствительность 0,01 нг/мл; диапазон детектирования 0,05–10 нг/мл.
Набор ELISA для определения TNF-α крысы	BT Lab, China	E0764Ra	Количественное определение уровней TNF-α в гомогенатах тканей почек; аналитическая чувствительность 2,51 нг/л; диапазон детектирования 5–1 000 нг/л.
Буфер для лизиса и экстракции RIPA	Thermo Scientific	89900	Гомогенизация и лизис тканей почек для анализа ELISA.
Набор для определения SOD (супероксиддисмутазы)	Otto Scientific	Otto3047	Колориметрическое измерение активности супероксиддисмутазы (SOD) в сыворотке крови.
Цитрат натрия	Merck	03-04-6132	Приготовление буфера
Гидроксид натрия (NaOH)	Merck	1310-73-2	Регулировка pH
Игла для кормления из нержавеющей стали (канюля для перорального зондирования 22 G)	Instech Laboratories, USA	Не указано	Многоразовая канюля из нержавеющей стали, используемая для перорального введения у крыс.
Стоп-раствор	Компоненты набора ELISA BT Lab	Входит в набор	Остановка реакции ELISA
Стрептавидин-пероксидаза	Thermo Scientific	SHRP248-B	Система детекции ELISA
Раствор субстрата TMB	Компоненты набора ELISA BT Lab	Входит в набор	Хромогенный субстрат
Tris-HCl	Thermo Scientific	1185-53-1	Приготовление буфера
Набор для определения мочевины	Otto Scientific	OttoBC157	Измерение уровня мочевины в сыворотке крови.
Концентрат промывочного буфера	Компоненты набора ELISA BT Lab	Входит в набор	Промывка планшета
Белые крысы линии Wistar	Лаборатория по исследованию экспериментальных животных Университета Ahi Evran, , Тüркия	Лицензия на разведение/производство № 184	Самцы; возраст 8–12 недель; масса тела 220 ± 20 г
Ксилазина гидрохлорид (Rompun)	Bayer, Germany	Не указано	Общий наркоз перед забором крови и тканей почек.
Ксилол, гистологической чистоты	Не указано	Не указано	Гистологическая обработка и просветление тканей.