Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

In vitro инкубация с рубцовой жидкостью и гистологическое окрашивание отдельных компонентов клеточных стенок стеблей люцерны (Medicago sativa L.)

122 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/73286

⸱

18 сентября 2026 г.

 , 
1Department of Agronomy and Plant Genetics, University of Minnesota - Twin Cities, 2United States Department of Agriculture - Agricultural Research Service

В этой статье

Краткое содержание

В данном протоколе визуализируется отложение компонентов клеточной стенки — лигнина и пектина — в поперечных срезах стеблей люцерны (Medicago sativa L.). Цель состоит в том, чтобы идентифицировать специфические ткани стебля, на которые можно воздействовать при создании новых линий люцерны с желаемыми характеристиками перевариваемости стеблей.

Аннотация

Накопление компонентов клеточной стенки по мере роста растений ограничивает питательную ценность корма для жвачных животных. В частности, отложение лигнина в тканях растений препятствует расщеплению углеводов клеточной стенки — целлюлозы и гемицеллюлозы, тем самым снижая количество энергии, доступной из корма. Однако легкоперевариваемый пектиновый компонент клеточной стенки readily доступен для деградации. Информация об отложении лигнина и пектина в различных типах клеток стебля может дать понимание механизмов, лежащих в основе различий в перевариваемости стеблей у разных линий люцерны. Инкубация поперечных срезов стебля в рубцовой жидкости in vitro имитирует процессы, которые ткани стебля претерпевают в рубце. В сочетании с гистологическим окрашиванием и микроскопией этот метод позволяет визуализировать изменения в деградации тканей с течением времени, а также определить локализацию лигнина и пектина в стебле. Окраска по Виснеру дает реакцию с гваяцильными (G) альдегидными единицами лигнина, окрашивая их в фуксиновый цвет. Аналогично, рутений красный взаимодействует с карбоксильными группами пектина, окрашивая пектин в стебле в оттенках от розового до оранжевого и коричневого. В данном протоколе описывается переваривание поперечных срезов стебля люцерны после воздействия микробов рубца с последующим окрашиванием для визуализации распределения лигнина и пектина в клеточных стенках. Этот метод может быть использован для идентификации тканей стебля, в которых присутствуют или отсутствуют лигнин и пектин, что облегчает сравнение различных линий люцерны.

Введение

Каждая растительная клетка окружена клеточной стенкой. Целлюлоза, гемицеллюлоза, лигнин и пектин являются компонентами клеточной стенки и формируют растительную клетчатку, которая является необходимым элементом рациона жвачных животных. В то время как пектины представляют собой легкоперевариваемые (растворимые) полисахариды1, лигнин является неперевариваемым полимером, который ограничивает расщепление клетчатки2. Таким образом, лигнин снижает перевариваемость растений и, в конечном счете, уменьшает количество энергии, доступной жвачным животным из корма. Однако лигнин поддерживает важные физиологические функции растений, такие как транспорт воды по всему растению за счет укрепления элементов трахеид3. Предыдущие исследования показали, что изменения в составе клетчатки стебля, приводящие к снижению содержания лигнина или увеличению содержания пектина, могут повысить перевариваемость стебля и питательную ценность корма4. Таким образом, данный протокол сосредоточен на этих двух компонентах клеточной стенки. Общие концентрации лигнина и пектина в клеточных стенках стебля не дают достаточной информации для объяснения механизмов, лежащих в основе перевариваемости клетчатки стебля5. Инкубация in vitro с рубцовой жидкостью и гистологическое окрашивание позволяют получить представление на клеточном уровне, визуализируя различия в компонентах клеточных стенок у растений с разной степенью перевариваемости клетчатки стебля4,6. В настоящем протоколе в качестве модельного вида для иллюстрации распределения лигнина и пектина в тканях стебля, которые содержат больше лигнина, но меньше пектина, чем листья, используется люцерна (Medicago sativa L.), распространенная многолетняя кормовая бобовая культура.

In vitro инкубация с рубцовой жидкостью имитирует переваривание корма в желудке жвачных животных, что позволяет наблюдать влияние анатомии корма на перевариваемость. Благодаря созданию в пробирке условий, аналогичных условиям в рубце, поперечные срезы стеблей, закрепленные на предметных стеклах, можно извлекать в разные моменты времени для оценки степени деградации тканей после воздействия рубцовой жидкости6. Этот метод представляет собой относительно простой, быстрый и недорогой способ визуализации анатомических структур стеблей люцерны7 и изучения того, как меняются типы клеток с различными компонентами клеточной стенки по мере переваривания стебля.

Гистологическое окрашивание поперечных срезов стебля позволяет визуализировать компоненты клеточной стенки. Флорглюцинол и соляная кислота (HCl) в сочетании образуют окраску по Виснеру, которая выявляет ткани стебля, содержащие богатые гваяцилом единицы лигнина8, путем реакции с мономерами G C6C3 альдегида (кониферильдегида)9. Лигнин состоит из множества мономерных субъединиц; однако в данной статье термин «лигнин» относится исключительно к G-мономеру, так как именно этот мономер реагирует с окраской по Виснеру10 и, следовательно, визуализируется с помощью данного протокола. Некоторые ткани, такие как сосуды ксилемы, всегда лигнифицированы6. В остальных случаях отложение лигнина в тканях стебля люцерны начинается после инициации вторичного (камбиального) роста и совпадает с прекращением удлинения межузлий стебля6. Рутений красный связывается с пектиновыми веществами, которые содержат карбоксильные группы, иногда этерифицированные и имеющие общие боковые цепи11. Карбоксильные группы пектинов, присутствующие в срединной пластинке и первичных клеточных стенках, взаимодействуют с рутением красным11. Пектин участвует в растяжении клеток и, следовательно, присутствует в клетках во время первичного роста. В данном тексте термин «пектин» в целом относится к совокупности пектинов, которые могут присутствовать. Сочетание гистологического окрашивания с инкубацией in vitro в условиях рубца облегчает наблюдение за локализацией компонентов клеточной стенки в стебле и позволяет проследить, как различные типы клеток изменяются в процессе переваривания в рубце. В конечном счете, данный протокол может быть использован для идентификации содержащих лигнин и пектин клеток стебля, а также для характеристики закономерностей распределения этих веществ в различных линиях люцерны и при разном времени инкубации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Данное исследование было проведено в соответствии с институциональными правилами работы с животными (IACUC 2301-40689B).

1. Маркировка пробирок с образцами

  1. Подготовка и маркировка пробирок с образцами для инкубации, хранения и окрашивания
    1. Заранее промаркируйте пять отдельных наборов одноразовых конических центрифужных пробирок объемом 50 mL с завинчивающимися крышками для каждого образца. На каждой пробирке укажите идентификатор образца и время инкубации в соответствии с описанными ниже целями использования.
    2. Промаркируйте пробирки для хранения перед инкубацией и добавьте 35 mL ультрачистой воды.
    3. Промаркируйте пробирки для инкубации, которые будут использоваться в разделах 3 и 4. Распределите пробирки по отдельным штативам в зависимости от времени инкубации (0, 4, 8, 24, 48 или 96 h).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте промышленный перманентный маркер, чтобы надписи не стерлись в водяной бане.
    4. Промаркируйте пробирки для хранения после инкубации и добавьте 35 mL смеси 100% глицерина и ультрачистой воды в соотношении 50:50. Используйте эти пробирки для хранения переваренных поперечных срезов на предметных стеклах до момента окрашивания.
    5. Промаркируйте пробирки для подготовки к окрашиванию и добавьте 35 mL смеси абсолютного этанола и ультрачистой воды в соотношении 50:50. Используйте эти пробирки для вымывания глицерина из поперечных срезов перед окрашиванием.
    6. Промаркируйте пробирки для гидратации и добавьте 35 mL ультрачистой воды.

2. Изготовление поперечных срезов стебля и их закрепление на предметных стеклах

  1. С помощью пинцета поочередно выбирайте сегменты стеблей из образцов и вырезайте центральную часть сегмента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте четыре стебля на образец в качестве технических повторов для каждого биологического повтора. Выбирайте четыре стебля случайным образом из всех доступных стеблей в образце. Используйте дополнительный набор стандартных стеблей в качестве контроля для всех серий инкубации.
  2. Вырежьте два прямоугольника из экструдированного пенополистирола толщиной примерно 0,6 cm и длиной 2,5 cm. Вырежьте небольшой клин вдоль всей длины каждого кусочка, чтобы междоузлие стебля плотно прилегало к двум кускам пенопласта.
  3. Закрепите стебель в таком «сэндвиче» на предметном столике скользящего микротома, способного делать срезы толщиной 100 μm. С помощью тонкой кисти нанесите каплю воды на стебель и лезвие микротома для обеспечения чистого среза.
  4. Сделайте поперечные срезы стебля толщиной 100 μm. С помощью кисти перенесите каждый срез в предварительно промаркированную чашку Петри с ультрачистой водой для временного хранения и удалите из чашки остатки пенопласта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Замените лезвие микротома, если пенопласт рвется, так как это может указывать на затупление лезвия.
  5. Вручную промаркируйте два стандартных предметных стекла размером 25 mm × 75 mm для каждого образца для каждого времени инкубации (2 окрашивания × 6 временных точек = 12 стекол на образец для каждого из биологических повторов). Укажите на каждой этикетке идентификатор образца, время инкубации и тип окрашивания.
  6. Отрежьте кусок двустороннего скотча шириной 2 mm и длиной 2,5 cm. Расположите короткую сторону скотча на расстоянии 0,5 cm от нижнего края стекла клейкой стороной вниз и, используя перчатки, плотно прижмите сторону с вощеной бумагой для обеспечения адгезии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте этот шаг на плоской поверхности, чтобы избежать поломки предметных стекол.
  7. Используя диссекционный микроскоп, ориентируйте все поперечные срезы в одном направлении. Снимите вощеную бумагу с двустороннего скотча и, сохраняя ориентацию срезов, перенесите их на скотч на промаркированном предметном стекле с помощью смоченной тонкой кисти. Поддерживайте срезы слегка увлажненными.
  8. Накройте поперечные срезы вощеной бумагой и слегка прокатите по ней кистью, чтобы плотно зафиксировать срезы на двустороннем скотче. Снимите вощеную бумагу и поместите закрепленное стекло с четырьмя поперечными срезами в предварительно промаркированную пробирку для хранения, описанную в шаге 1.1.2, убедившись, что ультрачистая вода полностью покрывает закрепленные срезы.
  9. Для окрашивания рутением красным и по Виснеру поместите по два стекла спина к спине в каждую пробирку так, чтобы двусторонний скотч был обращен наружу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После закрепления всех срезов и помещения стекол в пробирки с ультрачистой водой, при необходимости храните стекла в течение ночи при комнатной температуре.

3. Подготовка поперечных срезов стебля к инкубации in vitro

  1. Используйте одноразовые центрифужные пробирки объемом 50 mL с завинчивающимися крышками, подготовленные для инкубации (см. 1.1.3). Сгруппируйте все пробирки с образцами для каждого интервала инкубации на одном пластиковом штативе.
  2. С помощью аналитических весов с точностью до четвертого знака после запятой отвесьте 0,2 g стандартного образца стеблей кукурузы с размером частиц 1 mm на весовую бумагу и аккуратно перенесите материал в каждую инкубационную пробирку, за исключением пробирок для 0 h, которые служат неинкубированным контролем. Закройте пробирки крышками и отставьте их до использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: стандартный образец стеблей кукурузы обеспечивает энергию для поддержания жизнедеятельности микробов рубца во время инкубации, поскольку биомассы поперечных срезов стебля недостаточно для поддержания микробной активности.
  3. Наполните циркуляционный водяной термостат достаточным количеством воды и доведите его температуру до 39 °C перед началом инкубации. Отрегулируйте уровень воды так, чтобы она доходила до отметки 35 mL на пробирках объемом 50 mL; при необходимости используйте аэратор для поддержания равномерной циркуляции воды и температуры.
  4. Приготовление буфера Макдугалла (McDougall’s buffer) для инокуляционного раствора
    1. Приготовьте буфер Макдугалла не ранее чем за 2 дня до начала инкубации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смешайте буфер Макдугалла с жидкостью из рубца в соотношении 4:1 для приготовления инокуляционного раствора. Отрегулируйте объем буфера в соответствии с количеством образцов и приготовьте достаточное количество инокуляционного раствора, чтобы обеспечить 30 mL на пробирку.
    2. Отмерьте 1 600 mL ультрачистой воды. Перенесите 1 L в плоскую колбу Эрленмейера объемом 3 L, а 600 mL оставьте для переноса и промывки реагентов.
    3. Поместите магнитный перемешиватель в колбу Эрленмейера и установите колбу на магнитную мешалку.
    4. Установите пластиковую воронку в колбу Эрленмейера. Добавьте 15,7 g бикарбоната натрия (NaHCO₃), 5,9 g безводного дигидрофосфата натрия (Na₂HPO₄), 0,91 g хлорида калия (KCl), 0,75 g хлорида натрия (NaCl), 0,19 g семигидрата сульфата магния (MgSO₄·7H₂O) и 0,06 g дигидрата хлорида кальция (CaCl₂), добавляя реагенты по одному и дожидаясь полного растворения каждого перед добавлением следующего. Используйте часть зарезервированных 600 mL ультрачистой воды для промывки воронки после каждого добавления.
    5. После добавления дигидрата хлорида кальция установите диффузор CO₂ для облегчения растворения и проведите продувку раствора. После того как раствор станет прозрачным, продолжайте продувку еще в течение 10–15 min.
    6. Плотно закройте колбу пробкой и закрепите пробку малярным скотчем, так как при нагревании буфера в контейнере может повыситься давление.
    7. Храните раствор при 20 °C до 2 дней. Поместите раствор в водяную баню с температурой 39 °C за день до использования или непосредственно в водяную баню с температурой 39 °C, если он будет использован на следующий день.

4. Инкубация срезов стебля in vitro

  1. В день инкубации в вытяжном шкафу поместите 47 mL воды и 4 mL 1 N NaOH в стакан объемом 100 mL и добавьте 0,625 g цистеин-HCl. Во второй стакан объемом 100 mL добавьте 0,625 g сульфида натрия в 47 mL воды; храните эти два раствора раздельно до приготовления инокуляционного раствора.
  2. Заполните изолированный термос горячей водой, чтобы создать теплую среду для транспортировки микроорганизмов рубца от коровы в лабораторию. Подготовьте пятигаллонное ведро для переноса горячей воды из термоса.
  3. Отправьтесь в коровник для сбора жидкости из рубца канюлированной коровы, назначенной для эксперимента руководством коровника.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для минимизации вариабельности собирайте жидкость из рубца примерно в одно и то же время суток и от одной и той же коровы на протяжении всего эксперимента. Согласуйте с руководством коровника время вашего визита для сбора жидкости.
  4. Найдите нужную корову и наденьте соответствующие средства индивидуальной защиты, включая лабораторный халат, средства защиты глаз, бахилы и перчатки по плечо.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры в шагах 4.4–4.8 должны выполняться только персоналом, уполномоченным в соответствии с применимым протоколом IACUC.
  5. Перелейте теплую воду из термоса в пятигаллонное ведро. Подготовьте два слоя марли (grade 50) для фильтрования содержимого рубца.
  6. Сбор жидкости из рубца канюлированной коровы
    1. Осторожно откройте канюлю и поместите пробку в пятигаллонное ведро с теплой водой, чтобы избежать загрязнения пробки. С помощью руки в перчатке удалите достаточное количество материала из рубца, чтобы получить доступ к границе раздела твердой и жидкой фаз.
    2. Достигнув границы раздела фаз, соберите несколько горстей материала и отожмите его через два слоя марли (grade 50), размером примерно 45 cm квадрат, в предварительно нагретый термос с завинчивающейся крышкой. Отработанный материал после отжима жидкости через марлю утилизируйте.
    3. Повторяйте шаг 4.6.2 до тех пор, пока в термосе не соберется 1 L жидкости из рубца на каждую серию из 60 инокуляционных пробирок, корректируя объем в зависимости от количества образцов для инкубации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для канюлированных коров существуют определенные лимиты на объем жидкости из рубца, которую можно извлекать в неделю. Свяжитесь с управляющим коровником, чтобы убедиться, что объем извлеченной жидкости не превышает установленный лимит для данной коровы.
  7. После сбора достаточного количества жидкости из рубца плотно закройте термос для сохранения температуры. Установите канюлю на место и используйте теплую воду в пятигаллонном ведре для очистки.
  8. При выходе из коровника выбросьте использованные бахилы, перчатки и марлю в соответствующий контейнер для утилизации. Как можно быстрее вернитесь в лабораторию, чтобы сохранить температуру жидкости из рубца и аноксические условия.
  9. По возвращении в лабораторию соедините два раствора восстановителей (см. шаг 4.1) в вытяжном шкафу и перемешайте их для приготовления восстановительного раствора.
  10. Поместите стеклянный стакан объемом не менее 2 L с большим магнитным перемешивателем на нагревательную магнитную мешалку, установленную на температуру <30 °C, и расположите диффузор CO₂ над жидкостью. Добавьте 1 600 mL буфера Макдугалла и медленно перемешивайте, следя за тем, чтобы диффузор CO₂ не касался жидкости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При такой низкой температуре можно использовать полипропиленовый стакан. Используйте CO₂ для вытеснения O₂ и поддержания аноксических условий.
  11. Застелите большую воронку двумя слоями марли (grade 50) и поместите ее над мерным цилиндром объемом 2 L. Отфильтруйте 400 mL жидкости из рубца и добавьте ее к буферу Макдугалла (см. шаг 3.4.7) для приготовления инокуляционного раствора.
  12. Добавьте 80 mL восстановительного раствора (см. шаг 4.9) в инокуляционный раствор и медленно перемешайте. Не допускайте контакта диффузора CO₂ с жидкостью.
  13. В вытяжном шкафу снимите крышки с инкубационных пробирок и распределите их по отдельным штативам в соответствии с временем инкубации. Откройте пробирки для предварительной инкубации, чтобы подготовить их к переносу предметных стекол (см. шаг 1.1.2).
  14. Поочередно выбирайте по одной пробирке для предварительной инкубации и с помощью пинцета переносите закрепленные стеклянные предметные стекла в соответствующую инкубационную пробирку (см. шаг 1.1.3). Поместите каждую инкубационную пробирку с закрепленными стеклами в небольшой штатив для образцов, а пробирку для предварительной инкубации отставьте в сторону.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 4.14–4.15 следует выполнять вдвоем. По возможности минимизируйте охлаждение смеси жидкости из рубца с буфером.
  15. Наберите 30 mL инокуляционного раствора в шприц объемом 60 mL, оснащенный тупой иглой с большим просветом. Медленно введите раствор по стенке инкубационной пробирки, продуйте пробирку CO₂ в течение примерно 20 s, закройте крышкой и верните в штатив.
  16. Поместите штативы с инокулированными пробирками в водяную баню при 39 °C. Осторожно перемешивайте пробирки круговыми движениями не реже одного раза в день и ежедневно меняйте положение штативов, чтобы избежать неравномерного нагрева.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образование пузырьков газа в пробирках указывает на активную ферментацию.
  17. По окончании каждого периода инкубации извлеките соответствующий штатив из водяной бани. Открывайте пробирки по одной, извлекайте каждое стекло и осторожно промойте его ультрачистой водой, чтобы удалить твердые частицы и остатки инокуляционного раствора.
  18. Поместите промытые стекла в пробирки для хранения после инкубации, содержащие смесь глицерина с водой, описанную в шаге 1.1.4.

5. Окрашивание поперечного среза на лигнин

  1. Если предметные стекла хранились в смеси глицерина и воды (50:50), перенесите оба стекла с закрепленными поперечными срезами в пробирки для промывки перед окрашиванием, содержащие раствор этанола и сверхчистой воды (см. 1.1.5). Храните пробирки в холодильнике в течение ночи для удаления глицерина перед окрашиванием.
  2. Приготовьте 3% раствор флороглюцинола (PG), растворив 0,3 g PG в 10 mL абсолютного этанола в конической колбе Эрленмейера объемом 25 mL, обернутой алюминиевой фольгой для защиты светочувствительного реагента от света. Закройте колбу пробкой, подпишите её (название раствора, дата приготовления и имя составителя) и храните при 20 °C.
  3. Извлеките стекла из охлажденных пробирок и временно перенесите их в пробирки для гидратации, описанные в шаге 1.1.6, содержащие 100% сверхчистую воду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте поперечные срезы в гидратированном состоянии во время манипуляций, чтобы минимизировать окисление, которое может повредить срезы и повлиять на последующую визуализацию.
  4. Приготовьте краситель Виснера в вытяжном шкафу с помощью дозатора, смешав в стакане объемом 50 mL 50 μL 3% PG в этаноле (см. 5.2) и 25 μL соляной кислоты (HCl).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скорректируйте количество реагентов в соответствии с числом предметных стекол, сохраняя соотношение PG к HCl как 2:1.
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Работайте с соляной кислотой в вытяжном шкафу, так как она вызывает коррозию металлов, тяжелые ожоги кожи и повреждения глаз, а также может вызвать раздражение дыхательных путей. Избегайте вдыхания паров или аэрозолей, используйте соответствующие защитные перчатки, одежду, средства защиты глаз и лица, а после работы тщательно промойте открытые участки кожи.
  5. Извлеките одно стекло из пробирки и осторожно промокните стекло вокруг двустороннего скотча салфеткой с низким ворсом, чтобы краситель не стекал с ленты. Поместите стекло на небольшой пластиковый лоток и с помощью пипетки нанесите несколько капель красителя Виснера на поперечные срезы. 
  6. Установите таймер на 12 min и накройте стекла алюминиевой фольгой для защиты от света. В процессе окрашивания проверяйте поперечные срезы и при необходимости снова наносите краситель, чтобы предотвратить высыхание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте высыхания поперечных срезов, так как окисление может повредить ткань и повлиять на последующую визуализацию.
  7. Через 12 min осторожно удалите излишки красителя Виснера салфеткой с низким ворсом. Промойте ткань перед закреплением, чтобы минимизировать воздействие коррозионных паров HCl на объектив микроскопа.
  8. Нанесите 1–2 капли 50% смеси глицерина и сверхчистой воды на каждый поперечный срез и накройте покровным стеклом размером 24 mm × 30 mm (толщина № 1,5). Немедленно приступите к микроскопическому анализу и визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Получите изображения в течение 6–8 h, так как окрашивание по Виснеру чувствительно ко времени; со временем окраска может стать желтой и диффундировать из поперечного среза.

6. Окрашивание поперечных срезов на пектин

  1. Следуйте шагу 5.1, чтобы удалить смесь глицерина и ультрачистой воды с хранимых предметных стекол перед окрашиванием.
  2. Приготовьте 0,02% раствор рутенического красного, растворив 0,02 g рутенического красного в 100 mL ультрачистой воды в колбе Эрленмейера объемом 125 mL, обернутой алюминиевой фольгой для защиты светочувствительного реагента от света. Закройте колбу пробкой, подпишите ее, указав название раствора, дату приготовления и имя подготовившего, и храните при 20 °C.
  3. Извлеките предметные стекла из пробирок с этанолом и ультрачистой водой, находившихся в холодильнике, и перенесите правильно промаркированные стекла с закрепленными срезами в пробирки со 100% ультрачистой водой (см. 1.1.6) для временного хранения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте меры предосторожности при гидратации, описанные в шаге 5.3.
  4. С помощью пинцета извлеките одно предметное стекло из ультрачистой воды и промокните воду вокруг фиксирующей ленты безворсовой салфеткой, чтобы предотвратить растекание красителя по стеклу. Поместите стекло на небольшой пластиковый лоток.
  5. Нанесите несколько капель раствора рутенического красного (см. 6.2), чтобы равномерно покрыть поперечные срезы. Накройте стекла алюминиевой фольгой на 10 min для защиты от света, затем осторожно промойте стекло ультрачистой водой в течение 2 min для удаления красителя.
  6. Удалите излишки воды с предметного стекла и нанесите 1–2 капли 50% смеси глицерина и ультрачистой воды на каждый поперечный срез. Накройте поперечные срезы покровным стеклом размером 24 mm × 30 mm (толщина № 1.5) и переходите к микроскопическому анализу и визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения оптимальных результатов проведите микроскопический анализ в тот же день.

7. Визуализация в светлом поле

  1. Изучите поперечные срезы при светлом поле с помощью микроскопа с 10-кратным увеличением×, 20×и 40× увеличение. См. Таблица 1 для параметров и настроек сбора изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Использование центрифужных пробирок для имитации условий в рубце позволило относительно быстро и недорого in vitro переваривание (расщепление) Medicago sativa поперечные срезы стебля. С помощью скользящего микротома, 100 μmтолстые поперечные срезы *M. sativa* стебли подготавливали (Рисунок 1A). Поперечные срезы стеблей закрепляли на предметных стеклах с помощью двусторонней клейкой ленты (Рисунок 1B) и погружали в раствор инокулята руб...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Материал люцерны, использованный в данном исследовании, состоял из клонов пяти линий люцерны. Две экспериментальные линии были отобраны после двух циклов дивергентного отбора по перевариваемости нейтрально-детергентной клетчатки in vitro (IVNDFD) от материнских растений с либо низкой IVNDFD через 16 ч и низкой IVNDFD через 96 ч, либо с высокой IVNDFD через 16 ч и высокой IVNDFD через 96 ч12. В исследование также были включены три коммерческие линии с неизвестным генетическим фоном; м...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что исследование проводилось без каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов. Упоминание торговых марок или коммерческих продуктов в данной публикации служит исключительно целью предоставления конкретной информации и не подразумевает рекомендации или одобрения со стороны Министерства сельского хозяйства США (USDA). USDA является работодателем и поставщиком услуг, обеспечивающим равные возможности. Все эксперименты были проведены в соответствии с действующим законодательством Соединенных Штатов, страны, в которой они осуществлялись.

Благодарности

Авторы выражают благодарность Р. Теду Джео за его ценные замечания относительно предыдущих смежных работ. Благодарим Центр визуализации Университета Миннесоты — Твин-Ситиз за предоставление доступа к программному обеспечению для получения и анализа микроскопических изображений, использованному при подготовке иллюстраций к публикации. Данная работа была поддержана Министерством сельского хозяйства США — Службой сельскохозяйственных исследований [062-21500-001-000D] и соглашением о неоказании помощи в рамках сотрудничества (№ 58-5062-2-016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Алюминиевая фольгаНабережная7106BW18 дюймов × 1000 футов; используется для защиты светочувствительных окрашивающих растворов от света
Дигидрат хлорида кальция, мин. 99%Sigma Life ScienceC7902-500GCAS № 10035-04-8; реагент для метода Макдугалла’буфер S
Программное обеспечение камерыNikonNIS-Elements AR 5.42.0464-битное программное обеспечение для визуализации, используемое для получения и анализа изображений
Газ диоксид углеродаMathesonUN1013Технический класс; используется для поддержания аноксических условий во время подготовки и инкубации
Циркуляционный водяной термостатТочность—Циркуляционный водяной термостат с регулируемой температурой, используемый для поддержания образцов при 39 °C
Стандарт стебля кукурузыУниверситет МиннесотыНДСобрано осенью 2023 года в Сент-Поле, штат Миннесота, США; измельчено до 1 мм и использовано в качестве микробного субстрата
Покрывное стеклоThermo Scientific341924 мм × 30 мм, толщина № 1.5, 1 унция
Цветовая микроскопная камера Digital Sight 10 с полнокадровым CMOS-сенсором FXNikonMQA20000Цифровая цветная камера, используемая для получения микроскопических изображений в светлом поле
Диссекционный микроскопNikonSMZ18Стереомикроскоп, используемый для ориентации и позиционирования поперечных срезов стебля
Двусторонняя клейкая лентаДвусторонняя виниловая офисная лента SelloTape42702 мм × 53 м; используется для закрепления поперечных срезов стебля на предметных стеклах
Электронные весыИGH-202Аналитические весы с дискретностью четыре десятичных знака
Колба Эрленмейера (125 мл)Kimax25600колба объемом 125 мл; совместима с пробкой № 5
Коническая колба Эрленмейера (25 мл)Pyrex4980колба объемом 25 мл; совместима с пробкой № 0
Этанол (200 proof)Fisher Scientific04-355-720Абсолютный этанол, используемый для приготовления окрашивающих растворов и промывки перед окрашиванием
Жесткая теплоизоляция из экструдированного пенополистиролаOwens Corning14077881 дюйм × 2 фута × пенопластовая плита толщиной 2 фута, R-5, 15 PSI; используется для поддержки междоузлий стебля во время секционирования
ПинцетFisher Scientific10-316AЛабораторный пинцет, используемый для работы с сегментами стебля, предметными стеклами и закрепленными срезами
Предметные стеклаFisherBrand12550325 мм × 75 мм × 1 мм; используется для закрепления поперечных срезов стебля
Круглодонная колба (6 л)PyrexCLS43205L-4EAстеклянная колба объемом 6 л, используемая для приготовления или работы с большими объемами растворов
Глицерин, жидкий, лабораторной чистотыFisher Science Education525342CCAS № 56-81-5; глицерин, используемый в смолах для заключения препаратов и растворах для хранения
Двуслойная марля 50-й плотностиМагазин JINIOHEEB0FL27KXRN100% хлопок, отбеленный белый; используется для фильтрации содержимого и жидкости рубца
Мерный цилиндр (10 мл)Pyrex700024мерный цилиндр на 10 мл, используемый для измерения объемов жидкостей
Соляная кислотаFisherA1445-500CAS № 7647-01-0; используется совместно с флорглюцинолом для приготовления реактива Виснера
Промышленный суперперманентный маркермаркер Sharpie13601Тонкий наконечник; используется для маркировки пробирок для инкубации водостойкими знаками
Гидрат гидрохлорида L-цистеинаSigma-AldrichC121800-10GCAS № 345909-32-2; восстановитель, используемый при приготовлении инкубационного раствора
Безворсовые салфеткиKimberly-Clark341554,5 дюйма × 8,5 дюймов; используется для удаления излишков жидкости с предметных стекол без оставления ворсинок
Низкопрофильный нож микротомаLeica 81963065-LPСменное низкопрофильное лезвие, используемое для подготовки однородных поперечных срезов стеблей
Сульфат магния гептагидратFisher ChemicalM80-500CAS № 10034-99-8; реагент для метода Макдугалла’буфер s
Магнитный перемешиватель (якорь)Fisher Scientific03-411-78376 мм × 12 мм; используется для перемешивания буфера и инокуляционных растворов
Адресные этикетки для рассылкиЭвери51671/2 дюйма × 1 3/4 дюйма; используется для идентификации образцов и предметных стекол
Кисть для рисованияЛоу-Корнелл—Серия 7000, круглая кисть № 3; тонкая кисть используется для переноса и манипулирования поперечными срезами стебля
Чашки Петри с крышкамиЛабораторная посуда Becton Dickinson8173111960 мм × 15 мм; используется для временного хранения поперечных срезов стебля в ультрачистой воде
Флорглюцинол, 1,3,5-тригидроксибензолSigma-AldrichP3502-25GCAS № 108-73-6; реагент, используемый для приготовления реактива Виснера
Пипетка (100 μL)GilsonP 1000; 767547MДозирующая пипетка с регулируемым объемом, используемая для внесения окрашивающих растворов
Пластиковая универсальная воронкаNalgene10-437-23E150 мм; используется для переноса реагентов и фильтрации
Полипропиленовый стакан (4 л)Nalgene1201-4000Химически стойкий стакан объемом 4 л, используемый для приготовления и перемешивания инокуляционных растворов
Хлорид калияFisher ChemicalP217-500CAS № 7447-40-7; реагент для метода Макдугалла’буфер S
ЛезвияПерсона66-0089толщиной 0,009 дюйма; используется для ручной обрезки материала стебля
Рутениевый красный, аммониат рутения оксихлоридаSigmaR-2751CAS № 11103-72-3; гистологический краситель, используемый для визуализации пектиновых веществ
НожницыFiskars1063071Ножницы общего назначения, используемые для разрезания ленты, пенопласта и других расходных материалов
Конические центрифужные пробирки с завинчивающимися крышками (50 мл)Corning430828Полипропилен, непирогенный; используется для размещения образцов, инкубации, промывки и хранения
Слайсер-микротом (Sledge microtome)Leica2000RСкользящий микротом (микротом-салазки), используемый для подготовки 100 μm—толстые поперечные срезы стебля
Бикарбонат натрия, квалификации ACSFisher ChemicalS233-3CAS № 144-55-8; реагент для метода Макдугалла’буфер S
Хлорид натрияFisher Chemical—CAS № 7647-14-5; реагент для метода Макдугалла’буфер S
Гидроксид натрияFisher ChemicalS318-500CAS № 1310-73-2; используется при приготовлении восстановителя
безводный дигидрофосфат натрия (Na2HPO4)Sigma AldrichS-9763CAS 7558-79-4
Сульфид натрия безводный, ACS, мин. 98,0%Oakwood Chemicals245960CAS № 1313-84-4; восстановитель, используемый при приготовлении инкубационного раствора
Лабораторная ложка-шпатель SpoonulaFisher Scientific14-375-10Лабораторный шпатель, используемый для переноса порошкообразных реагентов
Магнитная мешалкаThermolyne от Sybron7200Магнитная мешалка, используемая для перемешивания буферных и инокуляционных растворов
Шприц (60 мл) с иглой широкого сеченияMonoject935401028шприц объемом 60 мл с иглой большого диаметра, используемый для внесения инокуляционного раствора
Штативы для пробирокThermo Scientific14-809-44Штативы, используемые для организации и поддержки инкубационных пробирок объемом 50 мл
ТермометрFisherBrand13201663Лабораторный термометр, используемый для проверки температуры раствора и водяной бани
Вертикальный микроскопNikonEclipse NiВертикальный светлопольный микроскоп, используемый для визуализации и получения изображений окрашенных поперечных срезов стебля
Вспомогательный насосLittle Giant Pump Co.502203Модель 2E-38N; 115 В перем. тока, 60 Гц, 1,7 А; используется для циркуляции воды и поддержания равномерной температуры в ванне
Взвешивающая бумагаНаучные продукты VWR12578-165Одноразовая весовая бумага, используемая для взвешивания и переноса твердых реагентов и субстрата из стеблей кукурузы

Ссылки

  1. Cosgrove DJ. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2005;6(11):850-861.
  2. Moore KJ, Jung H-JG. Lignin and fiber digestion. Journal of Range Management. 2001;54(4):420-430.
  3. Barros J, Serk H, Granlund I, Pesquet E. The cell biology of lignification in higher plants. Annals of Botany. 2015;115(7):1053-1074.
  4. Jung HG, Engels FM. Alfalfa stem tissues: cell wall deposition, composition, and degradability. Crop Science. 2002;42(2):524-534.
  5. Jung HG, Lamb JFS. Stem morphological and cell wall traits associated with divergent in vitro neutral detergent fiber digestibility in alfalfa clones. Crop Science. 2006;46(5):2054-2061.
  6. Engels FM, Jung HG. Alfalfa stem tissues: cell-wall development and lignification. Annals of Botany. 1998;82(5):561-568.
  7. Akin DE. Section to slide technique for study of forage anatomy and digestion. Crop Science. 1982;22(2):444-446.
  8. Jung HG, Deetz DA. Cell wall lignification and degradability. In: Jung HG, Buxton DR, Hatfield RD, Ralph J, eds. Forage Cell Wall Structure and Digestibility. American Society of Agronomy, Crop Science Society of America, Soil Science Society of America; Madison, WI; 1993:315-346.
  9. Blaschek L, et al. Cellular and genetic regulation of coniferaldehyde incorporation in lignin of herbaceous and woody plants by quantitative Wiesner staining. Frontiers in Plant Science. 2020;11:109.
  10. Blaschek L, et al. Different combinations of laccase paralogs nonredundantly control the amount and composition of lignin in specific cell types and cell wall layers in Arabidopsis. The Plant Cell. 2023;35(2):889-909.
  11. Nevins DJ. Analysis of forage cell wall polysaccharides. In: Jung HG, Buxton DR, Hatfield RD, Ralph J, eds. Forage Cell Wall Structure and Digestibility. American Society of Agronomy, Crop Science Society of America, Soil Science Society of America; Madison, WI; 1993:105-132.
  12. Xu Z, Heuschele DJ, Lamb JFS, Jung H-JG, Samac DA. Improved forage quality in alfalfa (Medicago sativa L.) via selection for increased stem fiber digestibility. Agronomy. 2023;13(3):770.
  13. Pradhan Mitra P, Loqué D. Histochemical staining of Arabidopsis thaliana secondary cell wall elements. Journal of Visualized Experiments. 2014;(87):51381.
  14. De Micco V, Aronne G. Combined histochemistry and autofluorescence for identifying lignin distribution in cell walls. Biotechnic & Histochemistry. 2007;82(4–5):209-216.
  15. Kraus JE, et al. Astra Blue and Basic Fuchsin double staining of plant materials. Biotechnic & Histochemistry. 1998;73(5):235-243.
  16. Ursache R, Andersen TG, Marhavý P, Geldner N. A protocol for combining fluorescent proteins with histological stains for diverse cell wall components. The Plant Journal. 2018;93(2):399-412.
  17. Baldacci-Cresp F, et al. A rapid and quantitative safranin-based fluorescent microscopy method to evaluate cell wall lignification. The Plant Journal. 2020;102(5):1074-1089.
  18. Casero PJ, Knox JP. The monoclonal antibody JIM5 indicates patterns of pectin deposition in relation to pit fields at the plasma-membrane-face of tomato pericarp cell walls. Protoplasma. 1995;188(1-2):133-137.
  19. Pesquet E, Cesarino I, Kajita S, Pawlowski K. Physiological roles of lignins – tuning cell wall hygroscopy and biomechanics. New Phytologist. 2025;248(6):2674-2706.
  20. Jung HG, Engels FM. Alfalfa stem tissues: rate and extent of cell-wall thinning during ruminal degradation. NJAS: Wageningen Journal of Life Sciences. 2001;49(1):3-13.
  21. Yeung EC. A beginner’s guide to the study of plant structure. Tested Studies for Laboratory Teaching. 1998;19:125-142.
  22. Jensen, W.A. Botanical Histochemistry: Principles and Practice. Freeman W.H. & Co. San Francisco, CA. (1962).
  23. Ruzin, SE. Plant Microtechnique and Microscopy. Oxford University Press; New York, NY; 1999.
  24. Gronwald JW, Bucciarelli B. Comparison of stem morphology and anatomy of two alfalfa clonal lines exhibiting divergent cell wall composition. Journal of the Science of Food and Agriculture. 2013;93(11):2858-2863.
  25. Dai R, et al. Overexpression MsJAR1 gene increased lateral branches and plant height in alfalfa (Medicago sativa L.). Scientific Reports. 2025;15(1):16956.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Инкубация в рубцовой жидкостистебли люцерныотложение лигнинаотложение пектинаперевариваемость стеблейокраска по Виснерерутений красныйпитание жвачных животных на кормах

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.