Стандартизированный рабочий процесс сбора образцов фекалий человека и автоматизированной экстракции дезоксирибонуклеиновой кислоты с использованием процессора на магнитных частицах

Краткое содержание

Целью данного протокола является стандартизация сбора образцов фекалий человека и автоматизированной экстракции дезоксирибонуклеиновой кислоты с использованием процессора на магнитных частицах.

Аннотация

Секвенирование микробиома кишечника стало важным подходом к исследованию динамики микробных сообществ в здоровом состоянии и при патологиях. Изменения в составе микробиоты связывают с рядом заболеваний, связанных с образом жизни и возрастом, включая диабет, лейкоз и нейродегенеративные заболевания. Поскольку различные микроорганизмы обладают особыми физиологическими характеристиками и требованиями к окружающей среде, стандартизированный сбор, транспортировка и обработка образцов кала имеют решающее значение для сохранения целостности образцов и минимизации технической вариабельности. Различия, возникающие при преаналитической обработке и экстракции дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), могут повлиять на последующий анализ микробиома и интерпретацию данных. Целью данного протокола является предоставление стандартизированного рабочего процесса сбора образцов кала человека и автоматизированной экстракции ДНК с использованием набора MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit (набор для экстракции нуклеиновых кислот) и системы KingFisher Flex System (автоматизированный процессор на магнитных частицах). Рабочий процесс объединяет контролируемую обработку образцов с автоматизированной экстракцией нуклеиновых кислот для снижения ручной вариабельности и повышения последовательности процедур. Протокол включает стандартизированный сбор, хранение и подготовку образцов кала, автоматизированную экстракцию и выделение нуклеиновых кислот из сложных матриц кала. Репрезентативные результаты демонстрируют успешное выделение ДНК, подходящей для последующего применения, включая секвенирование гена 16S рибосомальной рибонуклеиновой кислоты (рРНК) и дробовое (shotgun) метагеномное секвенирование. Стандартизированный рабочий процесс обеспечивает воспроизводимую обработку образцов, облегчает масштабирование исследований микробиома и способствует большей согласованности между экспериментами. Визуальная демонстрация дает практические рекомендации по внедрению стандартизированной обработки образцов кала и автоматизированной экстракции нуклеиновых кислот для исследования микробиома кишечника.

Введение

Микробиом кишечника представляет собой сложную микробную экосистему, которая влияет на метаболизм, иммунитет и неврологические функции хозяина и все чаще связывается с различными заболеваниями, включая метаболические расстройства, болезнь Паркинсона, рак и нейродегенерацию^1,2. Он играет важную роль в поддержании физиологии хозяина, влияя на метаболизм, иммунную функцию, абсорбцию питательных веществ и устойчивость к патогенным микроорганизмам^3,4. Надежные и воспроизводимые измерения микробиома необходимы для преобразования этих взаимосвязей в понимание механизмов и клиническое применение. Достижения в технологиях секвенирования следующего поколения (NGS) произвели революцию в нашем понимании сложных микробных сообществ, обитающих в желудочно-кишечном тракте. Однако преаналитические переменные, такие как процедуры сбора образцов фекалий, условия хранения, обращение, транспортировка и методы экстракции дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), могут избирательно изменять структуру микробного сообщества, выход ДНК и результаты секвенирования^5,6. Подобные методологические несоответствия часто затрудняют сравнение данных различных исследований.

Среди критически важных преаналитических этапов экстракция ДНК является одним из наиболее значимых факторов, определяющих качество данных микробиома^7,8. Идеальный протокол экстракции должен стабильно обеспечивать получение высококачественной высокомолекулярной ДНК с минимальным уровнем контаминации при обработке большого количества образцов. Автоматизированные платформы для экстракции нуклеиновых кислот позволяют повысить воспроизводимость, сократить количество ошибок при ручных манипуляциях, снизить риск контаминации и увеличить пропускную способность. Эффективность этих автоматизированных платформ существенно зависит от параметров протокола, включая гомогенизацию образцов, условия механического разрушения (bead-beating), химию лизиса, условия инкубации и работу с магнитными частицами^9,10. Следовательно, создание стандартизированного рабочего процесса, объединяющего единообразный сбор образцов фекалий с автоматизированной экстракцией ДНК, необходимо для получения надежных и воспроизводимых наборов данных микробиома.

В данном видео представлен стандартизированный рабочий процесс сбора, обработки образцов фекалий человека и автоматизированной экстракции ДНК с использованием набора для экстракции нуклеиновых кислот и автоматизированного процессора на основе магнитных частиц, описанных выше. В протоколе особое внимание уделяется контролируемому обращению с образцами, эффективному механическому и химическому лизису, удалению ингибиторов и мерам контроля качества, подходящим для последующего применения, включая секвенирование ампликонов гена 16S рибосомальной рибонуклеиновой кислоты (рРНК), полногеномное секвенирование, количественную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и дробовое метагеномное секвенирование. Наглядная демонстрация предоставляет практическое руководство по стандартизированной обработке образцов фекалий и автоматизированной экстракции нуклеиновых кислот для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости исследований микробиома кишечника.

Протокол

Исследование проводилось в соответствии с рекомендациями Институционального комитета по этике SKAN Research Trust и было одобрено данным комитетом (номер одобрения SKAN/IEC/2025/04). До сбора образцов от всех участников было получено письменное информированное согласие.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все реагенты, расходные материалы и оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка набора для сбора образцов фекалий

1. Соберите набор для сбора образцов фекалий, состоящий из стерильного контейнера-ловушки для фекалий, стерильной пробирки для сбора с завинчивающейся крышкой (объемом 30–50 mL) с прикрепленным шпателем, пробирки для сбора, предварительно заполненной стабилизирующим буфером, одноразовых перчаток, абсорбирующего материала, герметичного транспортного пакета с маркировкой «Биологическая опасность» и листа с инструкциями (Рисунок 1).
2. Промаркируйте каждую пробирку для сбора, указав уникальный идентификатор образца, дату и время сбора с помощью перманентного маркера или заранее распечатанной этикетки.
3. Приложите лист с инструкциями, в котором описаны процедура сбора образцов, меры предосторожности при обращении, условия хранения и требования к транспортировке.
   ​ПРИМЕЧАНИЕ: Стабилизирующий буфер поставляется предварительно заполненным в пробирке для сбора фекалий в составе набора. Производитель не раскрывает состав и объем стабилизирующего буфера. Соберите примерно 2–5 g фекального материала непосредственно в предварительно заполненную пробирку в соответствии с инструкциями производителя.

Рисунок 1Компоненты набора для сбора образцов фекалий. 
Комплект для сбора образцов фекалий включает одноразовые перчатки, стерильный контейнер для сбора кала, стерильную пробирку для сбора фекалий с завинчивающейся крышкой и прикрепленным шпателем, герметичный транспортный пакет с маркировкой «биологическая опасность», а также информационную брошюру с инструкциями для участников по сбору, обращению, хранению и транспортировке образцов фекалий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть эту фигуру в увеличенном размере.

2. Подготовка участника к сбору образцов

1. Попросите участника вымыть руки перед сбором образца.
2. Попросите участника опорожнить мочевой пузырь перед дефекацией, чтобы избежать загрязнения образца кала мочой.

3. Сбор образца фекалий с помощью фекального уловителя

1. Установите стерильный сборник кала на сиденье унитаза, чтобы предотвратить контакт образца кала с водой в унитазе.
2. В случае использования адгезивных сборников кала осторожно разверните устройство по указанным краям, не разрывая его. Следуйте инструкциям производителя, прилагаемым к сборнику, и надежно закрепите устройство на задней части сиденья унитаза для создания устойчивой поверхности для сбора.
3. В случае использования неадгезивных сборников кала расположите устройство поперек чаши унитаза в соответствии с инструкциями производителя для обеспечения устойчивой опоры.
4. Убедитесь, что во время сбора образца сборник кала не контактирует с водой в унитазе.
5. Проинструктируйте участника осуществить дефекацию непосредственно в сборник кала.
6. Перед работой с образцом наденьте одноразовые перчатки, входящие в набор для сбора.
7. Откройте стерильную пробирку для сбора и с помощью прилагаемого шпателя соберите фекальный материал как минимум из четырех-пяти различных зон кала, включая внешнюю поверхность и внутреннее ядро. Такой подход обычно позволяет получить примерно 2–5 g фекального материала, чего достаточно для экстракции ДНК.
8. Избегайте сбора фекального материала, который контактировал с краями сборника кала или любыми внешними поверхностями.
9. Сразу после сбора образца плотно закройте пробирку.
10. Тщательно перемешайте образец кала со стабилизирующим буфером, энергично встряхивая закрытую пробирку вручную до однородного суспендирования образца и полного исчезновения крупных комков.
11. Поместите герметично закрытую пробирку в герметичный транспортный пакет с маркировкой «биологическая опасность», содержащий абсорбирующий материал.
12. Осторожно сбросьте сборник кала вместе с калом в унитаз, следя за тем, чтобы содержимое не пролилось. Спустите воду, чтобы утилизировать сборник и кал вместе.

4. Хранение и транспортировка образцов фекалий

1. Храните образцы в соответствии со спецификациями используемого стабилизирующего буфера.
2. Храните образцы при комнатной температуре, если стабилизирующий буфер обеспечивает сохранность при температуре окружающей среды. В противном случае храните образцы при 4°C для краткосрочного хранения (≤24–48 h) или при −20°C...−80°C для длительного хранения.
3. Храните образцы согласно рекомендациям производителя. Образцы, собранные с использованием стабилизирующего буфера, примененного в данном исследовании, стабильны до 2 лет при комнатной температуре.
4. Транспортируйте образцы в герметичных пакетах для биоопасных отходов с абсорбирующим материалом для предотвращения утечки и загрязнения.
5. Соблюдайте рекомендуемый температурный режим при транспортировке образцов. При необходимости используйте изотермические контейнеры и охлаждающие элементы.
6. Обеспечьте соблюдение институциональных правил биобезопасности и соответствующих местных норм транспортировки биологических образцов.

5. Прием и регистрация образцов

1. При поступлении в лабораторию проверьте каждый образец на наличие надлежащей маркировки, целостность пробирок и признаки утечки.
2. При необходимости присвойте лабораторный идентификатор, а также зафиксируйте дату и время сбора, условия хранения и продолжительность транспортировки.
3. Исключите образцы с признаками утечки, неправильной маркировкой или нарушенной целостностью.

6. Подготовка планшетов

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте все планшеты перед началом процесса экстракции. Выполняйте все этапы работы с реагентами и биологическими образцами в чистой зоне, используя соответствующие средства индивидуальной защиты, включая лабораторный халат, перчатки и средства защиты глаз. Рисунок 2 показывает автоматический процессор магнитных частиц (Рисунок 2А), позиции загрузки планшета (Рисунок 2B), адаптер для многолуночного планшета с глубокими лунками (Рисунок 2C), центрифугу, совместимую с планшетами (Рисунок 2D), гомогенизатор с шариками (Рисунок 2E), амортизирующая опора (Рисунок 2F), держатель планшета (Рисунок 2G), 96-луночный планшет с микросферами (Рисунок 2H), многолуночный планшет с глубокими лунками (Рисунок 2I), и планшета для элюции (Рисунок 2J).

Рисунок 2Оборудование и расходные материалы, используемые для автоматизированной экстракции дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из фекалий. 
(A) Автоматизированный процессор для работы с магнитными частицами. (B) Позиция загрузки планшета в автоматизированном процессоре для работы с магнитными частицами. (C) Адаптер для глубокодонных планшетов для центрифугирования. (D) Центрифуга, совместимая с планшетами. (E) Гомогенизатор с бисерным мельничным устройством. (F) Демпфирующая опора, используемая при бисерном измельчении. (G) Держатель (адаптер) для глубокодонных планшетов для бисерного измельчения. (H) Бисерный планшет на 96 лунок, входящий в состав набора для экстракции нуклеиновых кислот. (I) Глубокодонный планшет на 96 лунок. (J) Планшет для элюции на 96 лунок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Извлеките пластину с гребенкой наконечников из упаковки и подготовьте ее к загрузке в прибор.
2. Подготовьте элюирующую пластину (Рисунок 2J), добавив по 20 µL элюирующего буфера, входящего в комплект набора для экстракции нуклеиновых кислот, в каждую лунку 96-луночного планшета. Загерметизируйте планшет прозрачной адгезивной пленкой для предотвращения контаминации. Держите планшет запечатанным до его загрузки в автоматический процессор на магнитных частицах. Маркируйте планшет как «Элюирующая пластина».
3. Подготовьте промывочную пластину 4, добавив по 1 mL 80% этанола в каждую лунку глубокодонного планшета. Загерметизируйте планшет адгезивной пленкой для предотвращения испарения и контаминации.
4. Подготовьте промывочную пластину 3, добавив по 1 mL свежеприготовленного 80% этанола в каждую лунку отдельного глубокодонного планшета. Загерметизируйте планшет адгезивной пленкой.
5. Подготовьте промывочную пластину 2, добавив по 1 mL промывочного буфера в каждую лунку глубокодонного планшета. Загерметизируйте планшет адгезивной пленкой.
6. Подготовьте промывочную пластину 1, добавив по 1 mL промывочного буфера в каждую лунку глубокодонного планшета. Загерметизируйте планшет адгезивной пленкой.

7. Подготовка автоматического процессора магнитных частиц

1. Включите автоматический процессор на основе магнитных частиц. Убедитесь, что установлены соответствующие магнитная головка для 96-луночного глубокодонного планшета и нагревательный блок для 96-луночного глубокодонного планшета.
2. Перед обработкой образцов запустите соответствующий протокол проверки прибора (например, протокол Check_96dw_tip), используя чистый гребень для наконечников и пустой совместимый луночный планшет.
3. Подтвердите наличие необходимой программы экстракции в автоматическом процессоре на основе магнитных частиц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование неправильной магнитной головки или нагревательного блока может привести к снижению выхода нуклеиновых кислот и повреждению прибора.

8. Проведение лизиса образцов

1. Подготовьте карту планшета для фиксации положения каждого образца в 96-луночном планшете.
2. Центрифугируйте 96-луночный планшет с микросферами (Рисунок 2H) при 2,750 × g в течение 10 s, используя совместимую с планшетами центрифугу (Рисунок 2D) и адаптер (Рисунок 2C), чтобы осадить микросферы на дно каждой лунки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап предотвращает потерю микросфер при снятии герметизирующей пленки с планшета.
3. Осторожно снимите герметизирующую пленку с планшета, не тревожа микросферы.
4. Добавьте по 80 µL лизирующего буфера в каждую лунку планшета с микросферами.
5. При пипетировании избегайте аспирации микросфер.
6. Разморозьте замороженные образцы фекалий при комнатной температуре до полного размораживания. Аккуратно перемешайте образцы для гомогенизации и немедленно приступайте к экстракции ДНК. Избегайте повторных циклов замораживания-оттаивания, так как они могут снизить качество и выход ДНК.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для свежих образцов подвергните каждую пробирку с образцом фекалий, содержащую стабилизирующий раствор, воздействию вортекса в течение 5–10 s для обеспечения гомогенизации образца.
7. Перенесите по 20 µL каждого гомогенизированного образца в соответствующую лунку планшета с микросферами.
8. Для переноса образцов используйте одноканальный дозатор, оснащенный стерильными фильтрующими наконечниками с широким отверстием (обрезанными). Избегайте многократного пипетирования, чтобы минимизировать потерю микросфер и последующее снижение выхода ДНК.
9. Плотно закройте планшет адгезивной пленкой, убедившись, что все лунки и края планшета полностью герметизированы.

9. Выполните механический лизис (дезинтеграция с помощью бусин)

1. Закрепите герметично закрытый планшет в гомогенизаторе с шариками (Рисунок 2E), используя соответствующий держатель для планшетов (Рисунок 2G) и амортизирующую опору (Рисунок 2F).
2. Сбалансируйте прибор, поместив планшет равного веса напротив планшета с образцами.
3. Установите на приборе частоту 30 Hz и время 2 min, затем запустите программу.
4. Дайте программе завершиться без прерываний.
5. После завершения работы осторожно извлеките планшет, не нарушая герметичности запечатывания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте амортизирующую опору, чтобы предотвратить повреждение планшета во время гомогенизации с шариками.

10. Выполнение обработки после лизиса

1. Центрифугируйте планшет при 2,750 × g в течение 5 мин при комнатной температуре, используя сбалансированную конфигурацию.
2. Осторожно перенесите 40 µL супернатанта из каждой лунки в новый глубокодонный планшет, который будет использоваться в качестве планшета с образцами (Sample Plate).
3. На этом этапе избегайте переноса бусин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Планшет с образцами не содержит бусин и не требует предварительного центрифугирования.
4. Герметично закройте планшет с образцами, если не планируете приступать к работе немедленно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости храните герметично закрытый планшет с лизатами при 4°C в течение ночи. В качестве альтернативы храните герметично закрытый планшет с образцами при −20°C до 3 месяцев. Перед дальнейшей обработкой доведите образцы до комнатной температуры.

11. Приготовление смеси сорбирующих бусин

1. Непосредственно перед использованием приготовьте смесь сорбирующих магнитных частиц, смешав 50 µL буфера для связывания нуклеиновых кислот с 20 µL магнитных частиц на один образец. Тщательно перемешайте до получения гомогенной суспензии.
2. Рассчитайте общий объем смеси сорбирующих магнитных частиц, исходя из количества образцов.
3. Для заполнения всего 96-луночного планшета приготовьте смесь сорбирующих магнитных частиц, добавив 48.0 mL буфера для связывания нуклеиновых кислот и 1.92 mL магнитных частиц в стерильную коническую пробирку. Тщательно перемешайте до получения конечного объема 49.92 mL (520 µL на лунку).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте дополнительный объем для одной или двух лунок, чтобы компенсировать погрешности при пипетировании.
4. Осторожно перемешайте суспензию сорбирующих магнитных частиц путем инверсии до достижения гомогенности.
5. Перенесите смесь сорбирующих магнитных частиц в чистый резервуар для реагентов.
6. Непосредственно перед дозированием ресуспендируйте магнитные частицы, прокачав суспензию пипеткой вверх-вниз три-четыре раза, чтобы предотвратить осаждение частиц.
7. С помощью многоканального дозатора внесите по 520 µL смеси сорбирующих магнитных частиц в каждую лунку подготовленного планшета с образцами.
8. Пипетируйте медленно из-за высокой вязкости раствора, избегая образования пузырьков. Перед каждым этапом дозирования осторожно ресуспендируйте смесь сорбирующих магнитных частиц в резервуаре для реагентов, чтобы обеспечить равномерное распределение частиц по всем лункам.

12. Изменение программы прибора MagMAX_Microbiome_Stool_Flex (модифицированная программа экстракции)

1. Загрузите и установите программное обеспечение BindIt (ПО для редактирования протоколов) в соответствии с инструкциями производителя.
2. Загрузите программу для прибора с веб-сайта производителя.
3. Запустите программное обеспечение для редактирования протокола и дождитесь завершения его инициализации.
4. Нажмите «Открыть» и выберите загруженную программу прибора.
5. Измените параметры протокола, как описано в Таблица 1.
6. Сохраните измененный протокол и закройте программное обеспечение.
7. Подключите компьютер к автоматическому процессору магнитных частиц с помощью USB-кабеля или последовательного кабеля RS-232C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед подключением компьютера убедитесь, что автоматический процессор магнитных частиц выключен.
8. Включите автоматический процессор магнитных частиц и дождитесь завершения инициализации.
9. Запустите программное обеспечение для редактирования протоколов и убедитесь, что оно обнаружило автоматический процессор магнитных частиц.
10. Перенесите модифицированную программу экстракции в автоматический процессор на магнитных частицах.
11. Подтвердите успешный перенос модифицированной программы экстракции, после чего выключите автоматический процессор магнитных частиц.

Шаг	Действие	Параметры
1	Связывание	Перемешивание; 5 циклов сбора; 37°C
2	Сбор гранул	5 циклов магнитного сбора
3	Промывка 1	Перемешивание по 20 s × 3 цикла; 37°C
4	Промывка 2	Перемешивание по 20 s × 3 цикла; 37°C
5	Промывка 3	Перемешивание по 20 s × 2 цикла; 37°C
6	Промывка 4	Перемешивание; 1 цикл; 37°C
7	Сушка	Сушка на воздухе в течение 2 min
8	Элюция	75°C; 6 циклов перемешивания; предварительный нагрев включен
9	Сбор гранул	3 цикла магнитного сбора
10	Перенос элюата	Перенос очищенной нуклеиновой кислоты в планшет для элюции

Таблица 1: Автоматизированная программа экстракции для процессора магнитных частиц.
Обзор автоматизированной программы экстракции, выполняемой автоматическим процессором магнитных частиц в процессе выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Программа включает связывание нуклеиновых кислот, сбор магнитных частиц, последовательные этапы промывки, воздушную сушку, элюцию и перенос очищенной ДНК в элюционную пластину. Приведены рабочие параметры для каждого автоматизированного этапа.

13. Выполните автоматизированную экстракцию нуклеиновых кислот

1. Включите автоматический процессор магнитных частиц (Рисунок 2A), переключив главный выключатель питания, а затем нажав кнопку питания прибора. Дождитесь завершения инициализации системы.
2. С помощью панели управления прибором выберите модифицированную программу экстракции и запустите выполнение.
3. При появлении соответствующего запроса установите планшет с гребенкой наконечников в позицию 7 и нажмите Start для продолжения. Позиции установки планшетов указаны в Таблице 2 (Рисунок 2B).
4. Снимите герметизирующую пленку с планшета для элюции и установите его в позицию 6, соблюдая правильную ориентацию (лунка A1 должна совпадать с соответствующей позицией). Нажмите Start для продолжения.
5. Снимите герметизирующую пленку с промывочного планшета 4, содержащего 80% этанола, установите планшет в позицию 5 с правильной ориентацией и нажмите Start.
6. Снимите герметизирующую пленку с промывочного планшета 3, содержащего 80% этанола, установите планшет в позицию 4 и нажмите Start.
7. Снимите герметизирующую пленку с промывочного планшета 2, установите планшет в позицию 3 и нажмите Start.
8. Снимите герметизирующую пленку с промывочного планшета 1, установите планшет в позицию 2 и нажмите Start.
9. При появлении соответствующего запроса установите планшет с образцами в позицию 1, соблюдая правильную ориентацию.
10. Закройте крышку прибора и нажмите Start для запуска автоматического цикла экстракции.
11. Дайте программе завершиться без прерываний (примерно 35–40 min).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В Таблице 1 приведена сводная информация о программе автоматической экстракции, выполняемой прибором.

Планшет	Положение	Тип планшета	Реагент	Объем на лунку
Плашка с образцами	1	96-луночный глубокий планшет	Смесь лизата образца и связывающих микросфер	920 µL
Промывочный планшет 1	2	96-луночный глубокий планшет	Промывочный буфер	1,000 µL
Промыть планшет 2	3	96-луночный глубокодонный планшет	Промывочный буфер	1,000 µL
Промывочная планшета 3	4	96-луночный глубокий планшет	80% этанол	1,000 µL
Промывочный планшет 4	5	96-луночный глубокодонный планшет	80% этанол	1,000 µL
Планшет для элюции	6	96-луночный планшет	Элюирующий буфер	200 µL
Пластина-гребень для наконечников	7	Стандартный многолуночный планшет с глубокими лунками	гребенка с наконечниками для 96-луночного глубокого планшета	Нет данных

Таблица 2: Конфигурация загрузки планшетов для автоматизированной экстракции нуклеиновых кислот.
Позиции загрузки планшетов, типы планшетов, реагенты и объемы реагентов, используемые для автоматизированной экстракции ДНК с помощью процессора на магнитных частицах. Планшет с образцами (Sample Plate) содержит смесь лизата образца и связывающих магнитных частиц. N/A означает, что жидкий реагент в планшет с гребенкой для наконечников (Tip Comb Plate) не добавлялся.

​14. Элюция и хранение нуклеиновых кислот

1. После завершения работы откройте прибор и осторожно извлеките планшет для элюции, чтобы избежать проливания элюатов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если в планшете для элюции наблюдается видимый перенос магнитных частиц, перенесите элюаты в стандартный 96-луночный планшет и поместите его на магнитную подставку на 5–10 min. Перенесите очищенный супернатант в новый 96-луночный планшет или соответствующим образом маркированные пробирки с помощью многоканального дозатора.
2. Перенесите элюированную ДНК в соответствующим образом маркированные пробирки или планшеты для хранения.
3. Храните элюированную ДНК при 4°C для краткосрочного использования, при −20°C для хранения до 6 месяцев или при −80°C для длительного хранения.

15. Выполните очистку после завершения работы

1. Извлеките все использованные планшеты и гребенки для наконечников из автоматического процессора магнитных частиц.
2. Утилизируйте все расходные материалы в соответствии с внутренними правилами учреждения по биологической безопасности и утилизации химических отходов.
3. Очистите места любых разливов с помощью подходящего лабораторного дезинфицирующего средства.
4. Выключите автоматический процессор магнитных частиц, а затем основной источник питания.

Результаты

Образцы фекалий от семи участников были успешно собраны с использованием описанного рабочего процесса сбора, что позволило получить образцы с достаточной массой и подходящей консистенцией для последующей обработки. После сбора образцы хранились при комнатной температуре. Большинство образцов имели однородную текстуру и окраску, что соответствует надлежащим условиям сбора и хранения, в то время как в небольшой части наблюдалась незначительная вариабельность консистенции, что может отражать биологические различия между участниками. В процессе транспортировки не было обнаружено видимых загрязнений или утечек, и все образцы были обработаны в течение подтвержденного окна стабильности набора для сбора (до 2 лет при комнатной температуре), что подтверждает устойчивость и надежность рабочего процесса сбора (Рисунок 1).

Автоматизированный рабочий процесс экстракции ДНК выполняли с использованием автоматического процессора на основе магнитных частиц (Рисунок 2A), конфигурации загрузки планшета (Рисунок 2B), адаптера для глубокодонного планшета (Рисунок 2C), совместимой с планшетами центрифуги (Рисунок 2D), гомогенизатора с использованием микросфер (Рисунок 2E), демпфирующей опоры (Рисунок 2F), держателя планшета (Рисунок 2G), планшета с микросферами (Рисунок 2H), глубокодонного планшета (Рисунок 2I) и элюирующего планшета (Рисунок 2J) в соответствии с программой автоматизированной экстракции, приведенной в Таблице 1, и конфигурацией загрузки планшета, представленной в Таблице 2. Концентрация и чистота ДНК оценивались для репрезентативных образцов фекалий, результаты представлены в Таблице 3. Концентрацию ДНК измеряли с помощью анализа Qubit double-stranded DNA High Sensitivity (флуориметрический анализ количественного определения ДНК) на флуориметре Qubit (прибор для флуориметрического количественного определения ДНК) согласно инструкциям производителя. Образцы смешивали с рабочим раствором, инкубировали в течение 2 min при комнатной температуре и измеряли вместе с двумя стандартами анализа. Отношения абсорбции A₂₆₀/A₂₈₀ и A₂₆₀/A₂₃₀ определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop (микрообъемный спектрофотометр). Концентрация ДНК варьировала от 36 до 87 ng/µL, при этом все образцы элюировали в постоянном объеме 20 µL, что позволило напрямую сравнить общий выход ДНК в разных пробах (Таблица 3).

Образец	Концентрация ДНК (нг/µL)	A260/A280	A260/A230	Объем элюции (µL)	Общий выход ДНК (нг)
Образец А	62	1.83	1.71	200	12,400
Образец B	36	1.89	1.51	200	7,200
Образец C	87	1.92	1.85	200	17,400
Образец D	50	2.03	1.87	200	10,000
Образец E	55	1.97	1.81	200	11,000
Образец F	85	1.99	1.88	200	17,000
Образец G	44	2.01	1.51	200	8,800
Холостая проба при экстракции	0	—	—	200	0

Таблица 3: Репрезентативные показатели выхода и чистоты ДНК после автоматизированной экстракции из образцов фекалий человека.
Репрезентативная концентрация ДНК, чистота (соотношения поглощения A₂₆₀/A₂₈₀ и A₂₆₀/A₂₃₀), объем элюирования и общий выход ДНК, измеренные после автоматизированной экстракции ДНК из образцов фекалий человека. Концентрация ДНК была определена с помощью флуориметрического анализа. Холостая проба экстракции служила отрицательным контролем и не дала детектируемого количества ДНК.

Типичные результаты продемонстрировали вариабельность выхода ДНК в различных образцах. Более высокие концентрации ДНК были получены для образца A (62 ng/µL), образца F (85 ng/µL) и образца C (87 ng/µL), в то время как промежуточные концентрации наблюдались для образца D (50 ng/µL) и образца E (5 ng/µL). Образцы B и G дали самые низкие концентрации ДНК (36 ng/µL и 4 ng/µL соответственно). Отношения абсорбции A₂₆₀/A₂₈₀ варьировали от 1,83 до 2,03, тогда как отношения A₂₆₀/A₂₃₀ варьировали от 1,51 до 1,8 (Таблица 3). Такая вариабельность ожидаема для образцов фекалий и может отражать различия в составе образцов и биологическую вариабельность, в дополнение к техническим вариациям, связанным с обработкой материала. В контрольном холостом опыте экстракции ДНК обнаружено не было, что указывает на отсутствие detectable-загрязнений в процессе экстракции. Типичная амплификация почти полноразмерного гена 16S рРНК бактерий привела к образованию ожидаемого ПЦР-ампликона размером примерно 1,5 kb в образцах ДНК фекалий, в то время как в отрицательном контроле (без матрицы) амплификация отсутствовала (Рисунок 3).

Рисунок 3Электрофорез в агарозном геле ампликонов полимеразной цепной реакции (ПЦР) гена 16S рибосомальной рибонуклеиновой кислоты (рРНК) бактерий. 
Репрезентативный электрофорез в агарозном геле, демонстрирующий амплификацию почти полноразмерного (~1,5 т.п.н.) гена 16S рРНК бактерий с использованием универсальных праймеров 27F и 1525R после экстракции ДНК из образцов кала человека. Дорожка M: маркер молекулярной массы ДНК (шаг 10 п.н.); дорожка 1: отрицательный контроль (без матрицы); дорожки 2–8: репрезентативные образцы ДНК кала, демонстрирующие ожидаемый ПЦР-ампликон размером ~1,5 т.п.н. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Успешная реализация данного протокола подтверждается выделением измеримого количества ДНК, пригодной для последующих молекулярных исследований, включая анализы на основе ПЦР, секвенирование гена 16S рРНК, дробовое метагеномное секвенирование и подготовку библиотек. В совокупности эти репрезентативные результаты демонстрируют, что данный протокол позволяет стабильно выделять ДНК из образцов фекалий человека, при этом иллюстрируя диапазон вариаций, которые могут быть встречены в биологических образцах.

Обсуждение

Описываемый здесь протокол представляет собой стандартизированный рабочий процесс сбора образцов фекалий человека и автоматизированной экстракции ДНК для исследований микробиома. К критическим этапам относятся репрезентативный забор фекалий из нескольких участков стула, тщательная гомогенизация с использованием стабилизирующего буфера, надлежащее хранение и транспортировка в рекомендуемых условиях, эффективный механический лизис и осторожное обращение во время автоматизированной экстракции. Строгое соблюдение этих этапов сводит к минимуму техническую вариабельность и обеспечивает воспроизводимое выделение ДНК. В предыдущих исследованиях также было установлено, что сбор образцов, условия хранения, гомогенизация и экстракция ДНК являются основными источниками вариабельности в анализах микробиома, и была подчеркнута важность стандартизированных рабочих процессов для получения воспроизводимых результатов^5,6,7,8. Представленные результаты демонстрируют успешный сбор образцов без видимого загрязнения или утечки, а также измеримый выход ДНК во всех протестированных образцах.

На выход ДНК может влиять несколько процедурных факторов, которые следует учитывать при реализации метода. Недостаточный механический или химический лизис, неполная гомогенизация, неэффективное связывание нуклеиновых кислот или потеря образца при переносе и промывке могут привести к снижению выхода ДНК. Различия в составе фекалий, микробной биомассе и консистенции образцов также могут способствовать разному количеству извлекаемой ДНК в разных пробах. Поэтому для получения стабильных результатов важна тщательная реализация протокола, особенно на этапах гомогенизации образца, диспергирования с помощью бусин (bead beating) и автоматизированной экстракции. При поиске и устранении неисправностей следует сосредоточиться на проверке приготовления реагентов, настройки приборов, загрузки планшетов и выполнения программы автоматизированной экстракции перед обработкой образцов. Аналогичные рекомендации были представлены в исследованиях по оценке аналитических рабочих процессов микробиома и методологий экстракции ДНК^5,6,7,8,11.

Основным ограничением данного метода является наблюдаемая вариабельность выхода ДНК между биологическими образцами. Как показывают репрезентативные результаты, различия в концентрации ДНК могут отражать как естественную биологическую изменчивость образцов фекалий, так и техническую вариабельность, возникающую в процессе обработки образцов. Следовательно, концентрация ДНК сама по себе не должна рассматриваться как единственный показатель эффективности экстракции. В зависимости от планируемого последующего применения могут потребоваться дополнительные меры оценки качества и пригодности ДНК. Для дальнейшей оценки качества ДНК и ее пригодности для последующего молекулярного анализа методом ПЦР с использованием универсальных праймеров 27F и 1525R был амплифицирован ген 16S рРНК бактерий. Успешная амплификация ожидаемого фрагмента гена 16S рРНК размером примерно 1.5 kb была подтверждена электрофорезом в агарозном геле (Рисунок 3>), что доказывает, что экстрагированная ДНК обладает достаточным качеством для последующего использования, включая секвенирование и другие молекулярные анализы. Предыдущие сравнительные исследования также показали, что выход ДНК не обязательно коррелирует с эффективностью последующего секвенирования или точностью профилирования микробиома^8,11.

По сравнению с ручными методами экстракции, автоматизированные процессоры на основе магнитных частиц сокращают время непосредственной работы оператора, стандартизируют условия экстракции и обеспечивают высокую пропускную способность при обработке образцов, сводя к минимуму вариабельность, зависящую от оператора^9,10. Однако различия в консистенции кала и биомассе микроорганизмов могут влиять на эффективность лизиса и выход ДНК. Кроме того, микроорганизмы с прочными клеточными стенками могут подвергаться неполному лизису, что потенциально влияет на представительство определенных таксонов. Несмотря на эти ограничения, автоматизированная экстракция представляет собой надежный и эффективный подход для крупномасштабных исследований микробиома кишечника^5,6,7,8,9,10. Данный протокол сочетает стандартизированный сбор образцов кала с автоматизированным рабочим процессом экстракции ДНК, предлагая практичный и воспроизводимый подход для исследований микробиома, требующих единообразной обработки большого количества образцов. Такие стандартизированные методологии, как эта, способствуют воспроизводимости результатов в различных исследованиях и хорошо подходят для последующих молекулярных приложений, включая профилирование микробиома, метагеномное секвенирование и другие виды анализа на основе секвенирования^5,6,7,8,9,10.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
80% этанол (приготовленный из абсолютного этанола)	Merck	ET00161000	Приготовьте свежий раствор из абсолютного этанола согласно описанному в протоколе методу.
Абсорбирующий материал	Kimtech	34256	Входит в комплект транспортной сумки.
Адгезивная пленка для герметизации планшетов	Applied Biosystems	4306311	Адгезивная прозрачная пленка MicroAmp.
Автоматизированный процессор магнитных частиц (система очистки KingFisher Flex с 96-луночным глубоким блоком)	Thermo Fisher Scientific	5400630	Автоматизированная система экстракции нуклеиновых кислот.
Герметичный транспортировочный пакет с маркировкой «Биологическая опасность»	Zymo Research	R1180	Герметичный транспортировочный пакет для перевозки образцов.
Программное обеспечение BindIt	Thermo Fisher Scientific	5189009	Программное обеспечение, использованное для модификации и переноса протокола автоматизированной экстракции.
Пробирка для сбора образцов с закрепленным шпателем (30–50 мл)	Zymo Research	R1180	Стерильная пробирка для сбора образцов с завинчивающейся крышкой.
Амортизирующая поддержка	QIAGEN	69984	Набор адаптеров для TissueLyser (используется в качестве амортизирующей опоры при механическом измельчении бусинами).
Глубокодонный планшет (на 96 лунок)	Thermo Fisher Scientific	95040460	Плашка Deepwell 96 для KingFisher.
Одноразовые перчатки	Zymo Research	R1180	Рекомендуется использовать безтальковые перчатки.
Элюирующий буфер	Applied Biosystems	A42357	Поставляется в составе набора для выделения нуклеиновых кислот MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit.
Сборник фекалий	Zymo Research	R1180	Стерильное устройство для сбора образцов.
Нагревательный блок (на 96 глубоких лунок)	Thermo Fisher Scientific	Поставляется в комплекте с прибором	Компонент системы очистки KingFisher Flex.
Лабораторный халат	Местный поставщик	Нет данных	Средства индивидуальной защиты.
Буфер для лизиса	Applied Biosystems	A42357	Поставляется в комплекте с набором для выделения нуклеиновых кислот MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit.
Магнитные бусины	Applied Biosystems	A42357	Поставляется в составе набора для выделения нуклеиновых кислот MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit.
Магнитная головка (на 96 глубоких лунок)	Thermo Fisher Scientific	Входит в комплект 5400630	Магнитная головка с 96 глубокими лунками, поставляемая в комплекте с системой KingFisher Flex.
Магнитный штатив (на 96 лунок)	Thermo Fisher Scientific	12332D	Требуется только в случае обнаружения переноса магнитных частиц.
Многоканальный дозатор	Eppendorf	3125000052	Совместимо с 96-луночными планшетами.
Спектрофотометр NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	Используется для определения соотношений A260/280 и A260/230.
Буфер для связывания нуклеиновых кислот	Applied Biosystems	A42357	Поставляется в составе набора для выделения нуклеиновых кислот MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit.
Перманентный маркер	Маркер Sharpie	3002	В качестве альтернативы можно использовать заранее распечатанные этикетки.
Наконечники для дозаторов, стерильные с фильтром (10 µL)	Tarsons	528100	Стерильные градуированные наконечники с фильтром.
Наконечники для дозаторов, стерильные с фильтром (200 µL)	Tarsons	528104	Стерильные градуированные наконечники с фильтром.
Наконечники для пипеток, стерильные с фильтром (1,000 µL)	Tarsons	529106	Стерильные наконечники с фильтром; обрезать для подготовки наконечников с широким отверстием, где это указано в протоколе.
Адаптер для планшета для центрифуги	Eppendorf	5820710004	Адаптер для планшетов с глубокими лунками для ротора A-2-DWP-AT.
Центрифуга, совместимая с планшетами	Eppendorf	5810	Совместимо с адаптером Rotor A-2-DWP-AT.
Держатель планшета для гомогенизации с помощью стеклянных шариков	QIAGEN	69984	Набор адаптеров TissueLyser Adapter Set 2 × 96.
Заранее распечатанные этикетки (опционально)	Брэди	BBP12	Альтернатива перманентному маркеру.
Набор для высокочувствительного количественного определения двухцепочечной ДНК Qubit dsDNA HS Assay	Thermo Fisher Scientific	Q33231	Флуориметрический анализ для количественного определения ДНК.
Флуориметр Qubit	Thermo Fisher Scientific	Q33327	Прибор для флуориметрического количественного определения ДНК.
Резервуар для реагентов	Thermo Fisher Scientific	8093	Резервуар для матричного реагента.
Буфер для стабилизации образцов	Zymo Research	R1180	Набор для сбора фекалий с использованием DNA/RNA Shield.
Стерильная коническая пробирка	HiMedia	TCP106H	Используется для приготовления смеси связывающих микросфер.
бисерный гомогенизатор TissueLyser III	QIAGEN	9003240	Прибор для механического лизиса.
Пластина-гребенка для наконечников	Thermo Fisher Scientific	97002534	Гребенка с наконечниками KingFisher 96 для магнитов в глубоких лунках.
Промывочный буфер	Applied Biosystems	A42357	Поставляется в комплекте с набором для выделения нуклеиновых кислот MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit.