Методическая статья

Изготовление и использование 32-луночного микропланшета со встроенными светодиодами для динамического оптогенетического контроля

23 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/73445

⸱

22 сентября 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Texas A&M University, 2Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology

В этой статье

Краткое содержание

В данном протоколе описывается способ изготовления, программирования и эксплуатации 32-луночного микропланшета со встроенными светоизлучающими диодами (LED) для оптогенетических исследований (LEMOS 2.0) внутри планшетного ридера, что позволяет осуществлять высокопроизводительную оптогенетическую стимуляцию и количественное измерение экспрессии генов в микробных культурах.

Аннотация

Оптогенетический контроль позволяет осуществлять регулируемую светом экспрессию генов и обеспечивает программируемый интерфейс между живыми клетками и электронными системами. Однако рутинное прототипирование оптогенетических конструкций по-прежнему ограничено имеющейся инфраструктурой. Существующие платформы с замкнутым контуром часто требуют использования хемостатов, микрофлюидики, роботизированных систем или специализированных оптических датчиков, что может привести к увеличению стоимости, ограничению доступности или снижению точности измерений.

Здесь представлен LEMOS 2.0 — обновленный микропланшет со встроенными светоизлучающими диодами (LED) для оптогенетических исследований, представляющий собой недорогое устройство для оптогенетической стимуляции и характеристики генных цепей внутри стандартных микропланшетных ридеров. LEMOS 2.0 развивает оригинальную платформу LEMOS за счет увеличения пропускной способности с 16 до 32 микролунок и снижения утечки света между соседними микролунками, что позволяет использовать темные условия в качестве дополнительного состояния освещения. Устройство состоит из напечатанного на трехмерном (3D) принтере каркаса, индивидуально адресуемых светодиодов, расположенных рядом с каждой микролункой, перезаряжаемого аккумулятора и встроенного микроконтроллера для беспроводной связи по Bluetooth. Биосовместимые микролунки из полидиметилсилоксана (PDMS) отливаются непосредственно в устройстве методом репликационного формования, что обеспечивает стимуляцию бактериальных культур через прозрачную форму. Устройство помещается в стандартные планшетные ридеры, что позволяет проводить измерения оптической плотности и флуоресценции.

В данном протоколе описывается полный рабочий процесс LEMOS 2.0, включая изготовление устройства, сборку схемы, программирование Arduino, отливку микролунок из PDMS, настройку планшетного ридера, подготовку штамма и культуры, автоматизированное выполнение эксперимента, очистку устройства и анализ данных флуоресценции/OD600. В качестве демонстрации в протоколе используется оптогенетическая система CcaSR, в которой экспрессия sfGFP активируется зеленым светом и подавляется красным светом. LEMOS 2.0 предназначен для того, чтобы сделать оптогенетические манипуляции и характеристику экспрессии генов более доступными для пользователей «мокрой» лаборатории, обеспечивая более быстрые циклы «проектирование — сборка — тестирование — анализ» без необходимости использования специализированной инфраструктуры биореакторов или микрофлюидики.

Введение

Оптогенетика обеспечивает программируемый интерфейс между живыми клетками и электронными системами управления. Использование света для регуляции экспрессии генов позволяет управлять поведением клеток с высокой временной точностью, обратимостью и минимальным воздействием на культуральную среду1. В сочетании с флуоресцентными или люминесцентными репортерами оптогенетические системы позволяют измерять биологические состояния электронным способом и регулировать их посредством обратной связи1. Этот двунаправленный оптический интерфейс сделал возможным кибергенетический контроль клеточных процессов, включая экспрессию генов, рост клеток и состав популяции2,3,4. Однако многие успешные оптогенетические системы с замкнутым контуром требуют использования специализированных хемостатов5, микрофлюидных устройств4,6,7 или роботизированного отбора проб2,3,8, что может ограничивать доступность и затруднять рутинные циклы «проектирование — создание — тестирование — анализ» (design-build-test-learn).

Планшетные ридеры являются одними из наиболее широко используемых приборов для измерения роста микроорганизмов и динамики экспрессии генов. Они обеспечивают надежное измерение оптической плотности и флуоресценции в большом количестве образцов, поддерживают контроль условий окружающей среды и уже интегрированы в стандартные рабочие процессы синтетической биологии9. Однако пути освещения в стандартных коммерческих планшетных ридерах предназначены для оптических измерений, а не для программируемой, специфичной для каждой лунки оптогенетической активации в процессе роста культуры. В результате для оптогенетических экспериментов часто требуются отдельные устройства освещения10,11,12,13,14, роботизированный перенос между платформами стимуляции и измерения8,15 или специализированное оборудование для считывания данных5,16,17. Эти дополнительные этапы снижают временное разрешение, вносят вариативность при манипуляциях с образцами и усложняют управление с обратной связью.

Для устранения этого пробела ранее была разработана микропланшетная пластина со встроенными светодиодами для оптогенетических исследований, или LEMOS18. LEMOS представляет собой устройство, совместимое с ридером микропланшетов, в котором вокруг микролунок для культур расположены индивидуально адресуемые светодиоды. Устройство остается внутри коммерческого ридера микропланшетов на протяжении всего эксперимента, что позволяет осуществлять оптическую стимуляцию и измерение флуоресценции или оптической плотности при 600 nm (OD600) на одной и той же платформе. В первоначальной реализации LEMOS поддерживала 16 микролунок для культур и использовалась для демонстрации оптогенетической стимуляции с разомкнутым контуром и управления экспрессией генов с обратной связью по замкнутому контуру в периодической культуре18. Устройство было синхронизировано с внешним компьютером, чтобы светодиодное освещение можно было отключать в окнах измерения, сводя к минимуму прямые помехи при считывании показателей флуоресценции и оптической плотности.

В данном протоколе описывается обновленная версия устройства LEMOS 2.0 и его применение для оптогенетических экспериментов в микробных культурах. Конструкция LEMOS 2.0 была переработана с целью увеличения количества независимо адресуемых микролунок для культур с 16 до 32, что повышает пропускную способность экспериментов и позволяет тестировать большее количество условий, повторностей или архитектур контроллеров за один запуск. Дизайн устройства также был модифицирован для уменьшения утечки света между освещенными микролунками и соседними темными микролунками, что повышает надежность темных контролей и экспериментов с пространственно-структурированной стимуляцией. Эти модификации делают платформу более подходящей для сравнительного оптогенетического анализа, тестирования контроллеров в нескольких условиях и внедрения в рутинные протоколы лабораториями, которые уже используют ридеры для микропланшетов.

Система LEMOS 2.0 предназначена для экспериментов по культивированию микроорганизмов в периодическом режиме, требующих многократных измерений OD600 и флуоресценции с программируемым красным, зеленым, синим или темным освещением. Планшетный ридер должен поддерживать кинетические измерения OD600 и флуоресценции, контроль температуры, перемешивание, определение пользовательского расположения лунок для 32 микролунок LEMOS, а также автоматический экспорт файлов измерений в папку, отслеживаемую управляющим скриптом Python. Текущая реализация была валидирована с использованием микропланшетного ридера BioTek Synergy H1 с ПО BioTek Gen5 v3.14; внедрение с использованием другого программного обеспечения для ридеров потребует соответствующих модификаций формата экспорта, парсера файлов и этапов автоматизации экрана. Поскольку в устройстве используются светодиоды с пиками излучения 620–630 нм, 515–525 нм и 465–475 нм, пользователям следует выбирать оптогенетические актуаторы и флуоресцентные репортеры, спектры активации и считывания которых совместимы с этими каналами19,20. Новые штаммы-хозяева, репортеры, оптогенетические системы, среды, температуры культивирования, интервалы отбора проб или конструкции контроллеров, скорее всего, потребуют повторной калибровки интенсивности светодиодов, диапазона рабочего цикла, коррекции по холостой пробе, нормализации флуоресценции и параметров контроллера.

Данный протокол охватывает полный рабочий процесс LEMOS 2.0: изготовление устройства, сборку схемы, программирование Arduino, отливку микролунок из полидиметилсилоксана (PDMS), настройку планшетного ридера, подготовку штаммов и культур, автоматизированное выполнение эксперимента, очистку устройства и анализ данных флуоресценции/OD600. Хотя в примере рабочего процесса основное внимание уделяется оптогенетическому контролю экспрессии генов у бактерий, эта же схема может быть адаптирована для других микробных штаммов, флуоресцентных репортеров, оптогенетических систем активации и алгоритмов управления. Благодаря сочетанию программируемого освещения со стандартными измерениями на планшетном ридере, обновленная платформа LEMOS 2.0 обеспечивает доступный способ проведения высокопроизводительных экспериментов по оптогенетическому воздействию и управлению с обратной связью в периодических культурах.

Протокол

Все экспериментальные процедуры, включающие Escherichia coli штамм MG1655  проводились в специально отведенных лабораториях биологической безопасности уровня 2 (BSL-2) при университете Техас A&Университет М. Культуры бактерий и манипуляции с ними проводили в сертифицированных боксах биологической безопасности класса II в соответствии со стандартными правилами содержания. Процедуры выполняли в установленных условиях содержания, одобренных и проверенных комиссией Техасского A&М Институциональный комитет по биобезопасности (IBC) по разрешению № IBC2023-044.

1. Изготовление рамы LEMOS 2.0 и массива светодиодов

ПРИМЕЧАНИЕ: начните изготовление LEMOS 2.0 с 3D-печати каркаса LEMOS 2.0 и установки светодиодных лент в корпус устройства. Цель состоит в создании механически устойчивой конструкции, в которой каждый светодиод будет расположен рядом с соответствующей микролункой. Правильное размещение светодиодов на этом этапе имеет важное значение, поскольку несоосность может снизить равномерность стимуляции и увеличить оптическое перекрестное влияние между микролунками.

  1. 3D-напечатайте внутреннюю раму LEMOS 2.0 и формовочную форму для микролунок из ПДМС с использованием предоставленных STL-файлов в репозитории GitHub (github.com/synbiosystems/LEMOS-2.0). После печати удалите все вспомогательные материалы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать нить из полимолочной кислоты (PLA) и принтер с технологией послойного наплавления (FDM) со следующими параметрами печати: высота слоя 0,2 мм, заполнение 20% для рамы LEMOS 2.0 и заполнение 40% для литейной формы.
  2. Разрежьте светодиодные ленты по центру контактных площадок на два набора по 16 светодиодов. Убедитесь, что на каждом конце полосы имеется три контактные площадки для пайки, как более подробно описано в разделе 2.
  3. Сложите каждую светодиодную ленту пополам так, чтобы светодиоды были направлены наружу (Дополнительный рисунок 1A, Дополнительное видео 1).
  4. Вручную придайте светодиодной ленте форму, соответствующую геометрии устройства, и вставьте её между микрослоями, направив контактные площадки +5 В вниз, обратив внимание на стрелку на светодиодной ленте (Дополнительный рисунок 1A, Дополнительное видео 1). Постепенно корректируйте положение полоски до тех пор, пока каждый светодиод не окажется правильно установлен в своём слоте, прежде чем продолжить.

2. Сборка и проверка электрической цепи

ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите соединения питания, зарядки, микроконтроллера, переключателя и светодиода, необходимые для работы беспроводного устройства. После сборки устройство LEMOS 2.0 должно работать от встроенного аккумулятора, заряжаться через модуль зарядки и получать команды для светодиодов с периферийной платы Arduino. Перед подключением светодиодных лент проверьте каждое соединение питания, поскольку неправильная разводка напряжения может повредить микроконтроллер или светодиоды.

ВНИМАНИЕ: Для выполнения протокола требуется предварительное владение навыками пайки, включая соблюдение соответствующих мер безопасности (например, использование абсорбера дыма, защитных очков и методов предотвращения ожогов), уход за паяльником, а также базовые навыки пайки сквозных отверстий и проводов. Пользователям, не имеющим такого опыта, следует пройти обучение перед выполнением шагов данного раздела.

  1. Соберите все перечисленные электронные компоненты из Таблица материалов и проверьте наличие видимых механических повреждений. Ознакомьтесь со схемой подключения (Дополнительный файл 1).
  2. Настройте повышающий преобразователь напряжения на выходное напряжение 5 В вместо стандартных 12 В. Следуя схеме настройки на обратной стороне платы, отсоедините контактные площадки A и B, подав тепло от паяльника для удаления соединения.
  3. Припаяйте контакт VIN платы Arduino Nano BLE Rev2 (в дальнейшем — BLE Nano) к контакту OUT+ повышающего преобразователя, а контакт GND платы BLE Nano — к контакту OUT- повышающего преобразователя (Дополнительный рисунок 1B).
  4. Припаяйте повышающий преобразователь IN– подключите к отрицательному контакту (-) модуля зарядки аккумулятора
  5. Разделите два провода 'Кабель JST PH 2-контактный – Женский разъём, 100 мм' отсоединив концы, подключаемые к батарейке, от белого корпуса. Укоротите каждый конец до ~70 мм, чтобы лучше вписать их в устройство, отрезав длину от концов, не подключаемых к батарейке (Дополнительный рисунок 1C).
  6. Измените переключатель. Во-первых, удалите монтажные штырьки в каждом углу. Во-вторых, укоротите все штырьки до 30 % их длины. Затем полностью удалите T1, T3 и B3 (обозначение: T = верхний, B = нижний, нумерация слева направо от 1 до 4 при взгляде непосредственно на штырьки, когда переключатель находится сверху)Дополнительный рисунок 1D).
  7. Припаяйте красный кабель JST к контакту B2, оставив конец для подключения батареи открытым для подключения к батарее’s разъемом «папа» позже (Дополнительный рисунок 1D).
  8. Припаяйте соединительный провод между B1 и B4.
  9. Припаяйте вывод B+ модуля зарядки аккумулятора к B1, следя за тем, чтобы соединительный провод из предыдущего шага также оставался припаянным к B1 (Дополнительный рисунок 1E).
  10. Припаяйте вывод IN+ повышающего преобразователя к контакту T4.
  11. Припаяйте положительный (+) контакт модуля зарядки батареи к контакту T2.
  12. Припаяйте черный кабель JST к модулю зарядки аккумулятора B– закрепите. Оставьте конец для подключения к батарее свободным для последующего подключения к батарее’с разъёмом-штекером
  13. Проверьте соединения в режиме нормальной работы устройства. Подключите литий-ионную батарею к схеме с помощью проводов для подключения батареи, оставленных свободными на этапах пайки, при этом переключатель должен находиться в среднем положении (выключено)Дополнительный рисунок 1E).
  14. Переведите переключатель в левое/включенное положение (сторона с двумя занятыми контактами).
  15. Проверьте подачу питания на BLE Nano по индикатору питания на плате (обозначен ‘ВКЛ’, рядом с портом USB), который должен загореться зелёным цветом (Дополнительный рисунок 1E, Дополнительное видео 1).
  16. Проверьте подачу питания на повышающий преобразователь по встроенному светодиоду, который должен загореться синим цветом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если светодиодные индикаторы не загораются, перед продолжением проверьте все соединения с помощью мультиметра.
  17. Удалите первую светодиодную ленту (установленную на шаге 1.4) и припаяйте провода к обеим группам контактных площадок VIN, DIN и GND. Вставьте светодиодную ленту обратно, пропустив провода через порт на боковой стороне рамы (Дополнительный рисунок 1F, Дополнительное видео 1).
  18. Повторите с второй светодиодной лентой в соответствии с Дополнительное видео 1.
  19. Припаяйте первую светодиодную ленту к контактам GND, D13 и VIN платы BLE Nano.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для пайки к выводу VIN требуется припаять два провода к одному и тому же выводу Arduino. Припаяйте один провод внутрь отверстия вывода, а второй — на внешнюю сторону отверстия для штифта, в углубление на плате Nano
  20. Припаяйте две светодиодные ленты вместе.
  21. Проверьте соединения мультиметром в режиме проверки целостности цепи, прикоснувшись к выводу VIN на BLE Nano и к контактной площадке +5 В на последнем не припаянном светодиоде. Повторите то же самое для GND.
  22. Закрепите светодиодные ленты с помощью термоклеевого пистолета (Дополнительный рисунок 1F, Дополнительное видео 1). Двигайтесь медленно, приклеивая за один раз только одну или две пары светодиодов, давая клею остыть между нанесениями. При необходимости используйте пинцет, чтобы удерживать светодиоды на месте.

3. Программирование центральной и периферийных плат Arduino

ПРИМЕЧАНИЕ: Запрограммируйте две платы Arduino, используемые для беспроводной связи и управления светодиодами. Центральная плата Arduino (Arduino Nano IOT 33) во время эксперимента подключена к компьютеру и передаёт команды из скрипта на Python. Периферийная плата Arduino (Arduino Nano 33 BLE Rev 2) установлена в устройстве LEMOS 2.0 и управляет светодиодной матрицей. Перед началом эксперимента на обе платы необходимо загрузить соответствующие скетчи. Визуальные индикаторы успешного подключения к другому устройству доступны путём раскомментирования указанных строк в скетчах Arduino: Центральная – Строки 34–37, мигание желтого светодиода; периферийный – Строки 99–106, зеленый светодиод мигает. После подтверждения успешного соединения между устройствами снова закомментируйте эти строки. В противном случае мигающие светодиоды могут включаться, когда устройство находится внутри планшетного ридера, что потенциально может исказить измерения.

  1. Скачайте файлы Arduino из репозитория GitHub: LEMOS_Central.ino, LEMOS_Peripheral.ino. Скачайте и установите последнюю версию интегрированной среды разработки Arduino (IDE) с сайта http://www.arduino.cc/en/software.
  2. Установите последнюю версию пакета платы из Менеджера плат (Инструменты > Доска > Менеджер по доскам) (Дополнительный рисунок 2A).
    Центральный: платы Arduino SAMD
    Периферийные устройства: платы Arduino Mbed OS Nano
  3. Установите следующие библиотеки Arduino в Менеджере библиотек (Инструменты > Управление библиотеками) (Дополнительный рисунок 2B): 'ArduinoBLE’ для связи по технологии Bluetooth Low Energy между периферийными и центральными устройствами, а также ‘Adafruit_NeoPixel’ для программирования светодиодов
  4. Откройте файл Arduino LEMOS_Central.ino в среде Arduino IDE.
  5. Подключите соответствующее устройство к компьютеру с помощью кабеля данных универсальной последовательной шины (USB).
  6. Выберите правильный последовательный порт (COM) для подключенного устройства (Инструменты > Порт). Если номер COM-порта неясен, наблюдайте, какой порт появляется и исчезает при подключении и отключении устройства.
  7. Выберите плату Arduino Nano 33 IoT из меню платИнструменты > Доска).
  8. Загрузите скрипт на устройство.
  9. Повторите то же самое для файла LEMOS_Peripheral.ino и периферийного устройства (Arduino Nano 33 BLE Rev 2).

4. Формование микрослойков ПДМС методом репликативного литья

ПРИМЕЧАНИЕ: Изготовьте оптически прозрачные микролунки из ПДМС непосредственно внутри рамки LEMOS 2.0 методом репликационного формования21Микролунки из ПДМС удерживают бактериальные культуры во время экспериментов с использованием планшетного фотометра и должны иметь прозрачное дно без пузырьков для достоверного измерения оптической плотности600 и измерения флуоресценции. Пыль, пузырьки или неполное отверждение могут вызвать вариабельность между лунками и должны избегаться при отливке. Перед отливкой необходимо убедиться, что поверхность вытяжного шкафа чиста, поскольку любая пыль или загрязнения в PDMS нарушат его оптическую прозрачность и приведут к нестабильным значениям оптической плотности600 показания по микролункам

ОСТОРОЖНО: работайте в вытяжном шкафу при обращении с неотвержденным PDMS. Избегайте контакта отвердителя с кожей.

  1. Обеззараживайте внутреннюю часть рамы LEMOS 2.0, где формуются микролунки, распыляя 70 % этанол, избегая прямого контакта с любыми электрическими компонентами, кроме светодиодов. Дайте раме LEMOS 2.0 полностью высохнуть перед формованием микролунок из PDMS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: воздействие этанола на светодиоды безопасно, но повредит все остальные электрические компоненты.
  2. Опрыскайте форму для отливки микрослойков из ПДМС разделительным агентом и подождите 10 мин, чтобы аэрозоль осел на поверхности пластика. Повторное нанесение через дополнительные 10 мин может улучшить отделение формы, однако является необязательным.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Агент для облегчения демонтажа (например, Ease Release 200) делает формовочную матрицу гидрофобной, что позволяет легко извлекать формовочную матрицу из отвержденных микролунок из ПДМС.
  3. Взвесьте и смешайте отвердитель и основу силиконового эластомера 184 в соотношении 10:1 по массе (основа к отвердителю) в одноразовом пластиковом стаканчике.
    ПРИМЕЧАНИЕ: для одного устройства LEMOS 2.0 рекомендуется использовать 2,5 г отвердителя и 25 г основы, в сумме получая 27,5 г смеси; при одновременном формовании нескольких устройств пропорционально увеличьте количество компонентов.
  4. Тщательно перемешивайте в течение не менее 5 мин с помощью одноразовой шпателки или деревянной палочки, снимая смесь со стенок и дна стакана для обеспечения полного смешивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательное перемешивание имеет критическое значение. Недостаточно перемешанный PDMS будет отверждаться неравномерно и приведет к нестабильным фоновым значениям оптической плотности600 показания по микролункам
  5. Поместите чашку с смесью ПДМС в вакуумный эксикатор. Подайте вакуум (не менее 65 см рт. ст. / 25 дюймов рт. ст.) на 45–60 мин, пока из смеси не исчезнут все видимые пузырьки воздуха. По мере того как пузырьки воздуха поднимаются к поверхности, ПДМС будет расширяться и может перелиться через край ёмкости. Используйте контейнер объёмом не менее 3× объем смеси
    ПРИМЕЧАНИЕ: Остаточные воздушные пузырьки в отвержденном PDMS изменят оптическую прозрачность дна микролунок, что приведет к нестабильному исходному уровню оптической плотности600 измерения
  6. Закрепите раму LEMOS 2.0 на внешней оболочке с помощью зажимов подходящего размера с четырёх сторон.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Зажимы для бумаг уменьшают количество ПДМС, проникающего в зазор между внешней оболочкой и рамой LEMOS 2.0. Избыток ПДМС в этом зазоре может увеличить общую высоту устройства и помешать тому, чтобы рама LEMOS 2.0 плотно прилегала к внешней оболочке. Наклеивание капроновой ленты Каптон по нижнему периметру рамы LEMOS 2.0, рядом с микролунками, дополнительно снижает просачивание.
  7. Аккуратно налейте дегазированный ПДМС в рамку LEMOS 2.0. Используйте шприц, чтобы добавить ПДМС в каждую микролунку рамки, обеспечивая их заполнение с минимальным количеством пузырьков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образование мелких пузырьков неизбежно; со временем они поднимутся на поверхность и исчезнут. Немедленно после дегазации наливайте дегазированный ПДМС, чтобы свести к минимуму повторное попадание пузырьков при обращении.
  8. Поместите 3D-печатную литейную форму в рамку, заполненную PDMS. Аккуратно и равномерно прижмите форму, следя за тем, чтобы круглые выступы на литейной форме вошли в отверстия рамки LEMOS 2.0. Форма определяет квадратные микролунки, расположенные рядом со светодиодами. Удалите излишки PDMS, вытекающие с краёв, чистой безворсовой салфеткой.
  9. Дайте PDMS отвердеть при комнатной температуре (25 °С) °C) на ровной поверхности не менее 30 ч. При необходимости ускорить отверждение, поместите устройство при 37 °при 4 °C в течение 4 ч, но только после удаления всех видимых пузырьков воздуха из ПДМС
    ОСТОРОЖНО: не подвергайте устройство LEMOS воздействию температур выше 37 °так как это может привести к перегреву и повреждению встроенной литий-ионной батареи.
  10. Удалите формовочную матрицу после отверждения микролунок из ПДМС, удерживая её за края и равномерно поднимая вверх. Убедитесь, что микролунки из ПДМС остаются в рамке.
  11. Проверьте каждую микролунку, чтобы убедиться в оптической прозрачности стенок и отсутствии пузырьков на дне. Устройство LEMOS 2.0 со свежими микролунками из ПДМС теперь готово к использованию.

5. Настройка микропланшетного ридера и рабочего процесса экспорта данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Настройте микропланшетный ридер для получения кинетических измерений, совместимых с LEMOS 2.0, и автоматизации экспорта данных. Ридер должен распознавать пользовательскую схему расположения лунок LEMOS 2.0, измерять оптическую плотность (OD)600 и измеряйте флуоресценцию в заданные интервалы времени, экспортируя файлы данных в папку, отслеживаемую управляющим скриптом на Python. Перед биологическими экспериментами выполните измерение фонового сигнала с использованием стерильной среды, чтобы подтвердить, что показания микролунок из PDMS и настройки планшетного ридера обеспечивают стабильные результаты. В настоящем протоколе используется микропланшетный ридер BioTek Synergy H1, управляемый программным обеспечением BioTek Gen5 версии 3.14.

  1. Запустите Gen5.
  2. Перейти к Типы планшетов и импорт LEMOS 2.0.xml с GitHub или, в качестве альтернативы, настройте пользовательскую схему планшета для LEMOS 2.0 в Gen5, обратившись к Дополнительный файл 2 (Раздел 1)  и Дополнительный файл 3.
  3. Выполните базовое измерение с помощью устройства LEMOS 2.0 (микролунки, заполненные 200 µл стерильной среды M9CA, закрытой пленкой медицинского качества [например, пленка Breathe-Easy]). Запишите OD600 и значения фоновой флуоресценции для всех 32 микролунок и сравните эти значения с данными, полученными для стандартной микропластины на 96 лунок. Если обнаружено большое расхождение, повторно отформуйте микролунки из PDMS, поскольку наиболее вероятной причиной являются пузырьки или загрязнения в отвержденном PDMS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плёнка Breathe-Easy проницаема для газов, обеспечивая аэробные условия для роста клеток, и в то же время остаётся оптически прозрачной, чтобы не мешать флуоресцентным измерениям и определению оптической плотности600 измерения
  4. Откройте протокол эксперимента closed_loop_protocol.prt из репозитория GitHub в Gen5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для удобства в репозитории GitHub доступен предварительно настроенный шаблон файла эксперимента template.xpt. Однако параметры подробно описаны ниже Дополнительный файл 2 (Раздел 2) и Дополнительный файл 3 для предоставления справочной информации по устранению неполадок пользователям с различными версиями Gen5.

6. Подготовка бактериальных культур для экспериментов с LEMOS 2.0

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте бактериальные культуры для эксперимента по оптогенетическому временному ходу с использованием LEMOS 2.0. Тщательный подход к подготовке культур важен, поскольку начальная плотность и экспозиция свету до начала эксперимента могут повлиять на измеряемую динамику экспрессии генов. Демонстрационный штамм — Escherichia coli (E. coliMG1655, несущий pSR58.6 и pNO286-322. pSR58.6 содержит сверхскладывающийся зелёный флуоресцентный белок (sfgfp) при PcpcG2 и конститутивный CcaR, устойчивость к хлорамфениколу и участок начала репликации pColE1. Плазмида pNO286-3 содержит конститутивный CcaS, устойчивость к спектиномицину и участок начала репликации p15A. Вместе эти плазмиды воссоздают систему индуцируемой зелёным светом и репрессируемой красным светом экспрессии генов. Плазмиды pSR58.6 и pNO286-3 были трансформированы в химически компетентные E. coli MG1655 с использованием стандартной трансформации методом теплового шока23Пластины хранили в коробке, чтобы защитить клетки от воздействия окружающего света и предотвратить преждевременную активацию оптогенетической схемы.

  1. Засейте отдельные пробирки объемом 14 мл с закругленным дном, содержащие по 2 мл бульона M9CA с добавлением 50 µг/мл спектиномицина и 25 µг/мл хлорамфеникол. Используйте эту питательную среду на всех последующих этапах культивирования в ходе всего эксперимента.
  2. Накройте каждую пробирку алюминиевой фольгой и инкубируйте в течение ночи (14–16 ч) при 37 °при перемешивании со скоростью 220 об/мин
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фольгирование обеспечивает темноту и предотвращает нежелательную активацию системы CcaSR. Альтернативно, культуры можно инкубировать при постоянном красном свете, поместив пробирки в светодиодный корпус, подключённый по той же электрической схеме, что описана в разделе 2, что более точно имитирует репрессированное состояние системы до начала эксперимента.
  3. Перенесите 100 µL каждой ночью выращенной культуры в 2 мл свежей среды в новой культуральной пробирке, обернутой фольгой. Инкубировать в течение 4 ч при 37 °С °при перемешивании со скоростью 220 об/мин
  4. Измерьте ОП600 каждой субкультуры через 4 ч с использованием ридера микропланшетов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: культуры должны достичь значения ОП600 0,4–0.6.
  5. Разбавьте каждую культуру до OD600 = 0,1 в свежей среде, пипетируйте 200 µпо 10 мкл в каждую микролунку устройства LEMOS 2.0, соблюдая осторожность при пипетировании, чтобы избежать образования пузырьков воздуха, и запечатайте устройство медицинской пленкой для герметизации.

7. Запуск временного эксперимента по оптогенетике с использованием LEMOS 2.0

ПРИМЕЧАНИЕ: Запустите автоматизированный эксперимент LEMOS 2.0, синхронизировав микропланшетный ридер, центральный Arduino и управляющий скрипт на Python. Во время выполнения эксперимента компьютер координирует измерения с помощью ридера, экспорт данных, Bluetooth-связь и управление светодиодами. Крайне важно, чтобы окно программы Gen5 оставалось видимым, поскольку скрипт на Python использует автоматизацию на основе экрана для взаимодействия с программным обеспечением ридера. Успешный запуск подтверждается появлением экспортированных файлов данных в указанной папке, выводом в терминале, подтверждающим установление Bluetooth-связи, и обновлением команд светодиодам на каждом интервале управления.

  1. Переведите переключатель влево, чтобы включить устройство LEMOS 2.0. Первый светодиод на светодиодной ленте в устройстве LEMOS 2.0 загорится зелёным цветом.
  2. Подключите центральный Arduino к компьютеру с помощью USB-кабеля и выберите его в Arduino IDE из выпадающего меню (Инструменты > Доска).
  3. Откройте Последовательный монитор и подключите периферийный Arduino, размещённый в LEMOS 2.0, к центральному Arduino.
  4. Отключите индикаторный светодиод на светодиодной ленте, введя букву 'о' в последовательный монитор.
  5. Откройте файл эксперимента LEMOS-start-data.xpt в Gen5 и снимите базовое показание культур в устройстве, убедившись, что OD600 и значения флуоресценции соответствуют ожидаемым. Закройте файл эксперимента.
  6. Откройте файл протокола, сохранённый на шаге 5.4, в программе Gen5 и сохраните его как эксперимент, ссылаясь на Дополнительный файл 2 (Раздел 3) и Дополнительный файл 3.
  7. Убедитесь, что в системе установлен Python версии 3.10 или выше, и установите необходимые пакеты с помощью предоставленного файла requirements.txt.
  8. Открыть control_duty_cyle.py (для экспериментов с коэффициентом заполнения) или control_pid.py (для экспериментов с ПИД) в любой подходящей интегрированной среде разработки, например Visual Studio Code или Spyder.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что рабочая директория установлена в папку, содержащую все скрипты на Python, чтобы они могли импортироваться во время выполнения скрипта. Выбор интегрированной среды разработки (IDE) не имеет принципиального значения.
  9. В Основное раздел скрипта на языке Python, измените файл переменную в соответствии с именем файла эксперимента Gen5, выбранным на шаге 7.6
  10. Расположите файл эксперимента и скрипт на языке Python рядом друг с другом (Рисунок 1).
  11. Щелкните Запустить в эксперименте Gen5, затем прервать его, как только начнется кинетический этап.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скрипт Python ищет Продолжайте кнопка после нажатия ЗапуститьОднако в новом файле эксперимента эта кнопка не отображается до тех пор, пока не будет выполнено второе измерение или кинетический эксперимент не будет прерван.
  12. Запустите сценарий на Python. Не сворачивайте и не закрывайте окно Gen5 во время выполнения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скрипт на Python использует автоматизацию на основе экрана и должен иметь возможность находить окно Gen5 примерно каждые 20 минут для обработки экспорта данных после каждого кинетического цикла. Закрытие или сворачивание окна в течение этого времени может нарушить ход эксперимента.

8. Очистка устройства, удаление PDMS и зарядка аккумулятора

ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения эксперимента очистите и сбросьте устройство LEMOS 2.0. Удалите бактериальные культуры и использованные микролунки из PDMS, продезинфицируйте многоразовые рамку и корпус и зарядите аккумулятор для следующего использования. Избегайте контакта несветодиодных электронных компонентов с этиловым спиртом или чрезмерным механическим воздействием во время очистки.

  1. Аккуратно снимите медицинскую уплотнительную пленку с верхней части устройства LEMOS 2.0 и выбросьте.
  2. Удалите и утилизируйте всю жидкость с клеточной взвесью из каждой микролунки с помощью пипетки в соответствии с процедурами утилизации биологических отходов.
  3. Отделите внешнюю оболочку от рамы LEMOS 2.0, прикладывая равномерное и плавное усилие. Избегайте сильного изгиба или скручивания рамы из ПЛА, чтобы не вызвать растрескивания или необратимой деформации.
  4. Отделите основной слой PDMS от внешней стороны рамки и с помощью пинцета аккуратно удалите микролунки PDMS из рамки LEMOS 2.0.
  5. Обработайте раму и внешнюю оболочку LEMOS 2.0 70 % этанолом, избегая прямого контакта с любыми электрическими компонентами, кроме светодиодов, как описано в шаге 4.1.
  6. Зарядите литий-ионную батарею для следующего эксперимента:
    1. Переведите переключатель в правое положение (положение зарядки).
    2. Подключите USB к модулю зарядки.
    3. Подтвердите зарядку с помощью светодиодного индикатора на устройстве, который будет мигать во время зарядки (Дополнительный рисунок 1E).

9. Анализ динамики флуоресценции и роста

ПРИМЕЧАНИЕ: Обработайте флуоресценцию и оптическую плотность600 данные, полученные в ходе эксперимента LEMOS 2.0. Блокнот анализа импортирует экспортированные данные планшетного ридера, применяет коррекцию на контрольный образец (бланк) и отрицательный контроль, рассчитывает нормализованную флуоресценцию и строит графики зависимости от времени. Перед запуском блокнота убедитесь, что назначение микролунок и обозначения условий соответствуют экспериментальной схеме.

  1. Откройте любой из следующих вариантов FL_OD_Data_Analysis_Duty_Cycle.ipynb или FL_OD_Data_Analysis_PID.ipynb.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В данном случае используются данные флуоресценции (FL) и оптической плотности (OD), которые сохраняются в этих файлах и генерируются в ходе выполнения эксперимента: Datafile/fl.csv и Datafile/od.csvЛист анализа ПИД также использует ошибки выражения, возникающие от заданного значения, которые сохранены в Datafile/errors.csv.
  2. Задайте переменную условий с названиями условий и лунками.
  3. Установить отрицательные_луночки равно списку в квадратных скобках с названиями микролунок отрицательного контроля.
  4. Установить од_бланк и fl_blank к средним значениям по контрольным лункам или к известным значениям, если контрольные пробы не проводились.
  5. Установить цвета_4_фигуры в нужные цвета (полный список именованных цветов доступен по адресу https://matplotlib.org/stable/gallery/color/named_colors.html).
  6. Установите параметр figsize в требуемую ширину и высоту результирующих графиков в дюймах.
  7. Подтвердите имена файлов, перечисленных в Константы.
  8. Запустите ноутбук, фигуры будут сгенерированы в виде файлов .png.

10. Устранение неполадок

  1. При подключении светодиода, если контактные площадки для пайки светодиода отламываются, примите во внимание следующее:
    1. Загните уголок светодиодной ленты, чтобы легче было протянуть провода через монтажное отверстие.
    2. Если использовался более жесткий (сплошной) провод, перейдите на более гибкий (многожильный) провод.
  2. Если переключатель включен и BLE Nano'Если светодиод питания не загорается, рассмотрите следующее:
    1. Во-первых, проверьте, заряжена ли батарея. Переведите переключатель в режим зарядки и подключите модуль зарядки к источнику питания. Если батарея заряжена, индикаторный светодиод должен перестать мигать и загореться постоянным зелёным светом через несколько минут. Если батарея была разряжена, дайте ей полностью зарядиться перед повторной попыткой.
    2. Если батарея заряжена, но светодиод по-прежнему не загорается, используйте мультиметр для измерения напряжения на BLE Nano'с выводами VIN и GND
      1. 0 В: соединение проводки нарушено. Проверьте каждый паяный контакт вдоль батареи > переключить > повышающий преобразователь > Nano путь и повторно расплавьте любой шов, который выглядит непропаянным или незавершённым.
      2. 5 В: Питание на Nano подается правильно, следовательно, сама плата может быть повреждена. Подключите питание к Nano с помощью кабеля, чтобы подтвердить это. Если светодиод питания по-прежнему не загорается, припаяйте новую плату Nano, заменив неисправную.
      3. Более 5 В: повышающий преобразователь не настроен на выходное напряжение 5 В. Убедитесь, что контактные площадки A и B отключены на повышающем преобразователе, как описано в разделе сборки устройства.
  3. Если сценарий Python не запускается, примите во внимание следующее:
    1. Убедитесь, что скрипт на Python запускается из папки всего проекта, а не как отдельный файл; оба файла control_duty_cycle.py и control_pid.py зависят от других локальных модулей и не будут работать при независимом запуске.
    2. Убедитесь, что Arduino IDE закрыта, поскольку к Arduino может быть установлено только одно активное соединение одновременно. Операционная система предоставляет доступ той программе, которая первой открывает порт.
    3. Убедитесь, что протокол Gen5 настроен правильно, особенно при использовании другого программного обеспечения. Обратитесь к Дополнительный файл 2 (Раздел 2).
    4. Убедитесь, что требуемые пакеты установлены. Создайте виртуальную среду и установите пакеты, перечисленные в файле requirements.txt.
  4. Если эксперимент остановился неожиданно, примите во внимание следующее:
    1. Остановка после первого цикла: путь экспорта данных в Gen5, вероятно, настроен неправильно. Убедитесь, что место назначения экспорта соответствует папке, из которой сценарий Python ожидает чтение данных файл переменная
    2. Остановка после нескольких циклов: PyAutoGUI время от времени не распознаёт элементы на экране, особенно после изменения разрешения экрана, масштабирования отображения или размера окна. Повторно сделайте контрольные снимки экрана, используемые скриптом, и поддерживайте окно Gen5 активным и находящимся на переднем плане на протяжении всего выполнения; окно среды разработки Python можно свернуть.
    3. Если программа Gen5 сообщает, что температура в камере находится вне целевого диапазона, дайте прибору время для стабилизации перед продолжением. Не игнорируйте предупреждение о температуре, поскольку это может вызвать появление окна аудиторского отчета, которое необходимо закрывать вручную и которое может прервать автоматизированный процесс.
  5. Если необычно высокое или нестабильное значение ОП600/если наблюдаются различия в базовых значениях флуоресценции между микролунками, примите во внимание следующее:
    1. Проверьте микролунки из ПДМС на наличие пыли или загрязнений, которые могут рассеивать свет и завышать показания.
    2. Избегайте оставлять ПДМС открытым и подвергнутым воздействию окружающего воздуха в течение длительного времени перед формованием или использованием.
  6. Если клетки не демонстрируют заметной реакции на свет, несмотря на проведение эксперимента, рассмотрите следующее:
    1. Подтвердите светодиод "на" команды выдаются с проверкой выходных данных терминала IDE и журнала связи BLE
    2. Если команды передаются, но свет не наблюдается, проверьте паяные соединения светодиода с помощью мультиметра.

Результаты

LEMOS 2.0 представляет собой совместимую с микропланшетными ридерами платформу на 32 лунки24 для программируемой оптогенетической стимуляции и количественного измерения экспрессии генов (Рисунок 2A,B). Каждая микролунка сопряжена с индивидуально адресуемым светоизлучающим диодом (СИД) WS2812B, управление которым осуществляется через контроллер Arduino Nano 33 BLE Sense Rev2 с помощью библиотеки Adafruit_NeoPixel. Устройство взаимодействует с внешним компьютером по Bluetooth, что позволяет обновлять команды освещения непосредственно в ходе эксперимента. Перед использованием в устройство методом репликационного формования отливаются новые микролунки из ПДМС (Рисунок 2C,D). Культуры E. coli, выращенные в LEMOS 2.0 при 30 °C под постоянным СИД-освещением, демонстрировали воспроизводимый рост во всех микролунках, что указывает на пригодность устройства для культивирования бактерий и проведения измерений на планшетном ридере на протяжении всего хода эксперимента18 (Рисунок 2E). Кроме того, кривые роста были схожи при различных условиях освещения, что свидетельствует о том, что воздействие СИД при данных настройках не оказывало заметного влияния на рост клеток.

Для демонстрации оптогенетического контроля экспрессии генов была использована система CcaSR v3.022 — двухкомпонентная система, активируемая зеленым светом и подавляемая красным, которая контролирует экспрессию sfGFP (Рисунок 3A). Под воздействием зеленого света CcaS подвергается автофосфорилированию и переносит фосфатную группу на регулятор ответа CcaR, который димеризуется для активации экспрессии sfGFP, зависящей от промотора PcpcG2. Под воздействием красного света CcaS дефосфорилируется, что снижает активность PcpcG2 и подавляет экспрессию sfGFP. Плазмиды CcaSR были трансформированы в E. coli MG1655 и использовались в экспериментах, описанных в данном протоколе (Рисунок 3B). В ходе эксперимента планшетный ридер измерял OD600 и флуоресценцию каждые 10 min. Чтобы освещение светодиодами (LED) не мешало оптическим измерениям, светодиоды были запрограммированы на выключение в окна измерений в начале и конце каждого 10-минутного интервала (Рисунок 3C).

Перекрестные помехи между лунками сначала оценивали, располагая микролунки в темноте вертикально или горизонтально рядом с микролунками, находящимися под постоянным воздействием зеленого света (Рисунок 3D). В темных микролунках, соседствующих с освещенными зеленым светом, не наблюдалось значительного увеличения экспрессии по сравнению с темными микролунками без освещенных соседей, что указывает на минимальную утечку света между микролунками. На основании этих результатов для последующих экспериментов использовали значение широтно-импульсной модуляции (ШИМ), равное 1 из 255, чтобы обеспечить достаточную оптическую стимуляцию при минимизации перекрестных помех между лунками.

Затем использовали стимуляцию с разомкнутым контуром для определения управляющего параметра оптогенетического контроля на основе LEMOS. Управляющим параметром был рабочий цикл зеленого света, определяемый как доля каждого активного окна освещения, отведенная под зеленый свет, при этом оставшееся время освещения отводилось под красный свет. Каждый интервал управления длился 10 min, при этом светодиоды были активны в течение 8 min и выключены в течение оставшихся 2 min, чтобы избежать помех при измерениях на планшетном ридере. Рабочие циклы зеленого света от 5% до 80% привели к градуальному экспрессии sfGFP, что показало, что рабочий цикл может быть использован в качестве настраиваемого входного сигнала для оптогенетической регуляции (Рисунок 3E). Скорость экспрессии увеличивалась по мере роста рабочего цикла от 5% до 40%, при этом значительного дополнительного увеличения при более высоких рабочих циклах не наблюдалось (Рисунок 3F), что говорит о приближении системы к насыщению при более длительной стимуляции зеленым светом.

Наконец, было реализовано управление с обратной связью по замкнутому контуру, чтобы проверить, способен ли LEMOS 2.0 динамически регулировать экспрессию генов относительно заданного задающего значения25 (Рисунок 4A). Компоненты системы управления были определены следующим образом: исполнительный механизм — светодиоды (LEDs), контроллер — внешний компьютер, на котором запущен PID-скрипт, и измеряемый выходной сигнал — флуоресценция sfGFP, нормированная по OD600. Контроллер сравнивал измеренное значение FL/OD600 с заданным уставным значением и обновлял рабочий цикл зеленого света для следующего 10-минутного интервала. Было внедрено пропорционально-интегрально-дифференцирующее (ПИД) регулирование, при котором длительность воздействия зеленого света в каждом цикле, tgreen, рассчитывалась следующим образом:
figure-results-1

Здесь e(t) — это ошибка между измеренным сигналом FL/OD600 и заданным значением в момент времени t. K — коэффициент пропорционального усиления, τI  — постоянная времени интегрирования, а τD — постоянная времени дифференцирования. Параметры управления с обратной связью были выбраны с использованием модели экспрессии генов на разных стадиях роста (GEAGS), которая была описана ранее26. При использовании этих параметров измеренный сигнал приближался к целевому значению FL/OD600 и отслеживал его (Рисунок 4B).

Соответствующие команды рабочего цикла показаны на Рисунке 4C. Высота столбца соответствует доле зеленого света, подаваемого в течение каждого 8-минутного окна освещения. Команда рабочего цикла изменялась дискретными шагами, поскольку контроллер обновлял входные данные один раз в 10 min. По мере приближения экспрессии sfGFP к заданной точке воздействие зеленого света уменьшалось, а воздействие красного света увеличивалось. После достижения измеренным сигналом заданной точки все еще наблюдался низкий уровень подачи зеленого света. Этот остаточный управляющий сигнал, вероятно, отражает работу дифференциальной составляющей, реагирующей на резкое изменение скорости экспрессии вблизи заданной точки. Данные результаты показывают, что LEMOS 2.0 может осуществлять модельно-ориентированное ПИД-регулирование оптогенетической экспрессии генов в периодической культуре.

figure-results-2
Рисунок 1: Настройка программного обеспечения LEMOS 2.0 во время эксперимента. Пример скриншота, демонстрирующий выполнение управляющего скрипта Python в VS Code (слева), при этом команды для светодиодов появляются в терминале по мере их отправки на микроконтроллер Arduino. В панели проводника файлов видна директория проекта, содержащая основной скрипт и связанные с ним функциональные модули. Справа программное обеспечение ридера планшетов показывает текущий цикл кинетического измерения; в конце каждого цикла скрипт Python автоматически запускает следующий цикл через интерфейс Gen5 и соответствующим образом обновляет команды рабочего цикла светодиодов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот рисунок в большем размере.

figure-results-3
Рисунок 2: Конструкция устройства LEMOS и характеристика роста клеток. (A) Взрыв-схема устройства LEMOS, демонстрирующая микролунки из PDMS, стимулирующие светодиоды, аккумулятор, переключатель, микроконтроллер, модуль зарядки, раму устройства и внешний корпус. (B) Собранное устройство с микролунками из PDMS, заполненными деионизированной водой. (C) Микролунка из PDMS, отлитая в устройстве LEMOS. Перепечатано из Namboothiri et al. (2026)18, лицензия CC BY 4.0. (D) 3D-печатная форма для отливки микролунок (E) Кривые роста E. coli в LEMOS при 30 °C (N = 3 технических повторности для лунок с непрерывным освещением зеленым или красным светом, а также при содержании в темноте). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 3: Характеристика оптогенетической системы в LEMOS и динамика управления в разомкнутом контуре. (A) Карта плазмиды двухкомпонентной оптогенетической системы CcaSR: зеленый свет (522 nm) активирует CcaS/CcaR для усиления экспрессии sfGFP, а красный свет (620 nm) подавляет экспрессию. (B) Протокол проведения оптогенетических экспериментов с использованием оптогенетической системы CcaSR. (C) Схема работы LEMOS. В течение 12-часового временного интервала устройство находится в микропланшетном ридере. Ридер измеряет флуоресценцию sfGFP и OD600, затем передает данные на компьютер, который отвечает за отсчет времени и запуск скетчей Arduino. Скетчи Arduino отдают команду бортовому микроконтроллеру временно отключать светодиодное освещение во время каждого измерения. Адаптировано из Namboothiri et al. (2026)18, лицензия CC BY 4.0. (D) Эффект влияния зеленого света на нестимулированные клетки в темновых условиях. На схеме расположения лунок зеленые квадраты обозначают микролунки с зеленым светом (N = 9), серые квадраты — микролунки в темновых условиях без влияния света из соседних микролунок (N = 6), фиолетовые квадраты — темные микролунки (N = 3), расположенные вертикально рядом с микролунками с зеленым светом, желтые квадраты — темные микролунки (N = 3), расположенные горизонтально рядом с микролунками с зеленым светом, и синие квадраты — микролунки с зеленым светом (N = 2) с контрольным штаммом для измерения автофлуоресценции. (E) Ответы в разомкнутом контуре в LEMOS при различных рабочих циклах зеленого света (5–80%, N = 3) в качестве управляющего параметра. Сплошные линии обозначают средние значения; заштрихованные области — стандартные отклонения. (F) Средняя скорость экспрессии в экспоненциальной фазе роста при различных рабочих циклах. N обозначает количество технических повторов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-5
Рисунок 4: Управление с обратной связью по замкнутому контуру в LEMOS 2.0. (A) Схема работы замкнутого контура: планшетный ридер выполняет функцию датчика, измеряющего FL/OD600, компьютер выполняет функцию контроллера, а устройство LEMOS 2.0 активирует светодиоды для регулирования экспрессии генов. Процессом является экспрессия генов в живых бактериальных клетках. Адаптировано из Namboothiri et al. (2026)18, лицензия CC BY 4.0. (B>) Пропорционально-интегрально-дифференцирующий (ПИД) контроль отслеживания заданного значения FL/OD600 (SP = 18.5 × 105 а.е.). Контроли при постоянном освещении отмечены зеленым и красным цветом (N = 3). Прогоны отслеживания заданного значения обозначены оранжевыми линиями (N = 3). Сплошные линии указывают среднее значение FL/OD600; закрашенные области указывают стандартные отклонения. Пунктирная линия отмечает заданное значение. (C>) Репрезентативные команды рабочего цикла, сгенерированные ПИД-контроллером во время отслеживания заданного значения в замкнутом контуре. Высота столбца указывает долю зеленого света, подаваемого в течение каждого интервала освещения. N обозначает количество технических повторов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

ПлатформаФормат культивированияСчитывание данныхДемонстрация управления с обратной связьюФормат культивированияОграничение, устраненное в LEMOS 2.0
LEMOS 2.032 микролунки из ПДМС в планшетном ридереКоммерческий планшетный ридерОтслеживание заданного значения ПИД-регулятором с использованием моделиВстряхиваемый периодический культивированиеДанное исследованиеДанное исследование
LEMOS 1.016 микролунок из ПДМС в планшетном ридереКоммерческий планшетный ридерОтслеживание заданного значения с помощью ПИ- и ПИД-регуляторов на основе моделиПеремешиваемая периодическая культураНизкая пропускная способность; ограниченная совместимость с условиями темноты18
Автоматизированный турбидостат + роботизированный отбор пробТурбидостатПроточная цитометрия + датчик оптической плотности (OD)Отслеживание уставки ПИ-, ПИД- и MPC-регуляторамиНепрерывное культивированиеТребуется роботизированный отбор проб; задержка между измерением и срабатыванием привода2, 3
Микроскопия на «материнских машинах»Микрофлюидика отдельных клетокМикроскопия живых клетокОбратная связь на уровне отдельной клетки / MPCНепрерывная перфузияТребуются специализированные микрофлюидные устройства и методы микроскопии4, 6, 7
Chi.BioМиниатюрный турбидостатВстроенные датчики OD/FLОтслеживание уставки ПИ-регулятораНепрерывное культивированиеДинамический диапазон встроенного сенсора ограничивает эффективность флуоресцентной обратной связи5
Массив световых трубокПробирки для культивированияВнешняя ОД/проточная цитометрияТолько с разомкнутым контуромВстряхиваемое периодическое культивированиеРучной отбор проб; ограниченный мониторинг роста в режиме реального времени10
LAVA / LITOS / RainbowCap / DiyaУстройства для освещения многолуночных планшетовКоммерческий планшетный ридерТолько с разомкнутым контуромПериодическое культивированиеРаздельные стимуляция и считывание; ограниченная автоматизация12, 13, 14, 15
ЛустроОсвещение планшета на 96 лунокКоммерческий планшетный ридерТолько разомкнутый контурПериодическое культивированиеТребуется роботизированный перенос между этапами стимуляции и считывания8
RT-OGENEПредметный столик, совместимый с многолуночными планшетами и микрофлюидными устройствамиОпределение OD/FL с помощью камерыПопытка создания замкнутого контура; ограничено считыванием данныхСтатическая периодическая культураСчитывание данных с помощью камеры и статический метод культивирования ограничивают эффективность управления16
оптопланшетный ридерСпециализированный ридер/стимулятор на 96 лунокВстроенные фотодиодыРелейное регулирование по заданному значениюПериодическое культивирование встряхиваемом способомЗависимость от репортера/фильтра и более низкая чувствительность флуоресценции ограничивают гибкость считывания данных11,17

Таблица 1: Сравнение LEMOS 2.0 с существующими оптогенетическими платформами2,3,4,5,6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,17,18.

Дополнительный рисунок 1: Изображения сборки. (A) Изогнутая светодиодная лента и формованная лента внутри устройства. (B) Nano BLE Sense Rev 2, припаянный к повышающему преобразователю, который, в свою очередь, припаян к модулю зарядки аккумулятора. (C) Оригинальная и модифицированная версии кабеля «JST PH 2-Pin Cable – Female Connector 100mm». (D) Оригинальный переключатель, модифицированный переключатель, припаянный красный кабель JST PH и короткая перемычка, припаянная между двумя контактами по обе стороны нижнего ряда. (E) Включение переключателя в схему сборки и подача питания на схему. (F) Вид сбоку светодиодов и светодиодных лент, закрепленных с помощью горячего клея. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Снимки экрана настройки Arduino IDE. (A) Снимок экрана Менеджера плат, демонстрирующий поиск одной из необходимых плат. (B) Снимок экрана Менеджера библиотек, демонстрирующий две из необходимых библиотек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 1. Схема соединений LEMOS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 2: Протокол настройки пользовательского макета планшета для LEMOS 2.0 в Gen5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 3: Скриншоты этапов работы с программным обеспечением, описанных в Дополнительном файле 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительное видео 1: Видео сборки со следующими этапами. Размещение светодиодной ленты в раме, закрепление светодиодной ленты горячим клеем, разводка проводов к светодиодным лентам и между ними, а также окончательная сборка с электронными схемами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

В данном протоколе описывается изготовление и эксплуатация LEMOS 2.0 — 32-луночного микропланшета со встроенными светодиодами (LED) для экспериментов по оптогенетической стимуляции и управлению с обратной связью внутри стандартного планшетного ридера. Репрезентативные эксперименты демонстрируют, что LEMOS 2.0 поддерживает рост микроорганизмов (Рисунок 2E>), при этом значимой фототоксичности при освещении не наблюдалось. Кроме того, LEMOS 2.0 снижает утечку света в соседние микролунки, находящиеся в темноте (Рисунок 3D>), что повышает достоверность темновых контролей и экспериментов с пространственно-паттернированной стимуляцией. Более того, LEMOS 2.0 позволяет осуществлять оптогенетическую активацию на основе рабочего цикла (Рисунок 3E>) и реализует ПИД-регулирование экспрессии генов в замкнутом цикле в культурах периодического действия (Рисунок 4B).

Фотообесцвечивание является важным фактором в оптогенетических экспериментах, поскольку одна и та же оптическая схема используется как для активации, так и для считывания флуоресценции27. В LEMOS 2.0 используются коммерческие RGB-светодиоды, содержащие три диода с пиками излучения на 620–630 nm (красный), 515–525 nm (зеленый) и 465–475 nm (синий)19. Следовательно, выбор репортера и рабочей интенсивности светодиодов должен быть таким, чтобы минимизировать спектральное перекрытие между длинами волн активации и спектром возбуждения флуоресцентного репортера, сохраняя при этом достаточный световой поток для оптогенетической регуляции. В данном протоколе использовалась система CcaSR, чьи ответы на зеленый и красный свет попадают в широкие диапазоны активации и деактивации, описанные для этой системы22, а флуоресценция sfGFP измерялась при возбуждении на 485 nm. Поскольку зеленый и красный рабочие диапазоны длин волн, используемые для управления CcaSR, отделены от длины волны возбуждения sfGFP, а выход светодиодов был минимизирован до интенсивности ШИМ 1 из 255 при сохранении надежной оптогенетической регуляции, ожидается, что фотообесцвечивание при активации светодиодами будет ограниченным. В ходе длительных экспериментов может наблюдаться некоторое фотообесцвечивание; однако в данных условиях оно было недостаточно значительным, чтобы исказить измеренную оптогенетическую индукцию, ответ на рабочий цикл или динамику управления с обратной связью20.

Для обеспечения надежной работы критически важны несколько этапов. При изготовлении каждый светодиод должен быть совмещен с соответствующей микролункой для поддержания однородности стимуляции и снижения оптических перекрестных помех. При сборке схемы повышающий преобразователь должен быть настроен на 5 V перед подключением микроконтроллера и светодиодных лент. Отливка PDMS также требует особого внимания, так как пузырьки воздуха, пыль, частицы мусора или неполное отверждение могут изменить оптическое пропускание через дно микролунок и привести к нестабильным базовым линиям OD600 или флуоресценции28. Поэтому перед началом биологических экспериментов следует провести измерение базовой линии со стерильной средой. Если в некоторых лунках наблюдаются значительные расхождения в показаниях OD600 относительно остальной части планшета, необходимо проверить эти лунки на наличие вышеупомянутых дефектов изготовления. В зависимости от степени серьезности такие микролунки следует либо исключить из анализа, либо полностью перелить заново.

Конфигурация программного обеспечения является еще одним распространенным источником неудач в экспериментах. Текущий рабочий процесс зависит от скоординированной работы метода считывания планшетов, экспорта данных Gen5, управляющего скрипта Python и Bluetooth-связи между центральной и периферийными платами Arduino. Путь экспорта и формат файла должны соответствовать структуре, ожидаемой скриптом Python, а окно Gen5 должно оставаться видимым во время запуска, так как автоматизация использует взаимодействие с экраном. Перед началом эксперимента устройство LEMOS следует подключить к центральной плате Arduino и запустить тестовую процедуру, чтобы убедиться, что все светодиоды работают правильно; любые неисправные светодиоды должны быть выявлены и заменены до загрузки бактериальных культур, так как незамеченные сбои приведут к неконтролируемым условиям освещения во время эксперимента. Пользователям, адаптирующим данный рабочий процесс для другой модели планшетного ридера или программного пакета, следует сохранить ту же логику тайминга, измерений, экспорта и парсинга, модифицируя уровень автоматизации по мере необходимости.

LEMOS замыкает цикл, обеспечивая автоматизированное воздействие, синхронизированное с интервалами измерений18. В данной работе исходное устройство LEMOS было обновлено путем удвоения количества лунок для увеличения пропускной способности. Кроме того, пересмотренная геометрия микролунок минимизирует утечку света между лунками, что позволяет тестировать оптогенетические цепи в темных условиях наряду с освещенными в рамках одного эксперимента. В настоящее время LEMOS 2.0 поддерживает эксперименты с периодическим культивированием. Поскольку скорость роста, доступность ресурсов и динамика экспрессии генов меняются в процессе периодического культивирования, такие параметры, как интенсивность светодиодов, диапазон рабочего цикла, интервал отбора проб и параметры контроллера, могут потребовать повторной калибровки для других штаммов, репортеров, оптогенетических систем или условий роста20. Подробное сравнение LEMOS 2.0 с платформами, разработанными ранее для проведения оптогенетических исследований, приведено в Таблице 1. Будущие версии могут включать встроенные в планшет каналы или резервуары для контролируемого обмена и разбавления среды, что позволит проводить более длительные эксперименты при сохранении более стабильных условий роста. Дополнительные модификации также могут поддерживать альтернативные длины волн светодиодов или снижать зависимость от программного обеспечения для автоматизации на базе экрана.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Авторы Б.Дж., Т.С.Б. и Х.Р.Н. получили поддержку от Инженерной опытной станции Техасского университета A&M.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
многожильный монтажный провод 22 AWG AmazonASIN: B089CQ2N69Недорогой провод для подключения электрической цепи. Допустимо использование одножильного или многожильного провода.
8-контактный 3-позиционный переключатель-слайдер 2P3T DP3T с боковым регуляторомAmazonASIN: B007Q9Y8YCПереключатель и контакты должны располагаться на соседних, а не на противоположных сторонах, как это чаще всего бывает.
Arduino Nano 33 BLE Rev 2ArduinoABX00071Микроконтроллер – Плоский профиль и поддержка BLE соответствуют требованиям к периферийным устройствам.
Arduino Nano 33 IoTArduinoABX00027Микроконтроллер – Используется в качестве основного устройства.
микропланшетный ридер BioTek Synergy H1Agilent (BioTek)—Или совместимый планшетный ридер с режимом кинетики
Герметизирующая пленка Breathe-EasyUSA Scientific9123-6100Герметизирующая пленка медицинского назначения; Газопроницаемая запечатывающая пленка для микропланшетов
Хлорамфеникол (стоковый раствор 25 мг/мл в этаноле)Разное—Рабочая конц. 25 µg/mL
E. coli MG1655
Ease Release 200Технологии высвобождения МаннаРазделительный агент
Каптоновая лентаАмазонкаASIN: B07F8TZZ4N
Чашки с LB-агаром и соответствующие антибиотикиСобственной разработки—Предполагается, что они уже имеются в наличии.
Литий-ионный аккумулятор 3,7 В, 3000 мАч (11,1 Вт·ч), размер 104060UfineUFX0391-03 Должен быть укомплектован двухконтактным кабелем JST PH с разъемом «папа». Производитель Liter Energy, реализуется через различных ритейлеров.
Модуль заряда и разряда литий-ионных аккумуляторов с интерфейсом USB Type-C (5В 1А)AmazonASIN: B0CTMJMRKZПоиск "Заменяет TP4056" на Amazon. Пролистайте стандартные модули TP4056. Остановитесь на любом объявлении, где представлены более компактные черные модули с надписью "Заменяет TP4056" в названии.
Литий-ионный кабель JST PH с 2 контактами – Разъем «мама», 100 ммРазличныеASIN: B07NWNPB77Должно быть совместимо с аккумулятором’разъем JST.
Миниатюрный повышающий модуль (Mini Boost Module), плата преобразования напряжения с 3,7 В до 5 В/8 В/9 В/12 В со светодиодным индикаторомAmazon (робот Teyleten)ASIN: B0B4TB9QNYК сожалению, предоставленная вами ссылка ведет на страницу товара в интернет-магазине Amazon, а не на текст научной статьи или протокола JoVE. Пожалуйста, предоставьте исходный английский текст, который необходимо перевести, и я с радостью подготовлю для вас профессиональный академический перевод на русский язык.
однолуночный планшет Nunc OmniTrayThermo Scientific242811Внешняя оболочка
pNO286-3AddgeneПлазмида #107746Кодирует конститутивную экспрессию CcaS
pSR58.6AddgeneПлазмида #63176Кодирует конститутивную экспрессию CcaR и sfGFP под промотором PcpcG2
Паяльник и припойРазное—Рекомендации: тонкий наконечник, припой с флюсом или канифольным сердечником.
Спектиномицин (сток 50 мг/мл)Разное—Рабочая конц. 50 µg/mL
Стерильные культуральные пробирки (14 мл, с круглым дном)Разное—
силиконовый эластомер SYLGARD 184 (основа + отвердитель)SYLGARD 184отвердитель:основа в соотношении 1:10 по массе
кабель USB-A — Micro USBРазное—Для подключения плат Arduino к ПК. Должен использоваться кабель с возможностью передачи данных, а не только для зарядки.
Зарядный кабель USB-A — USB-CРазличные—Подключается к модулю зарядки аккумулятора
Вакуумный эксикатор и насосРазное—Для дегазации ПДМС
Светодиодная лента RGB Pixel на базе ИС WS2812B с интерфейсом SPI, 100 светодиодов/м, 5 В постоянного тока, IP30, чернаяAmazon (BTF-LIGHTING)ASIN: B088B8G8LD; артикул BTF-LIGHTING: WS2812B1M100LB30Светодиодная лента с индивидуальным управлением. 100 светодиодов/м. Напряжение: 5 В. IP30 означает степень водонепроницаемости. Черный цвет предпочтительнее белого, так как он меньше отражает свет.

Ссылки

  1. Kumar S, Khammash M. Platforms for optogenetic stimulation and feedback control. Front Bioeng Biotechnol. 2022;10:918917.
  2. Milias-Argeitis A, et al. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nat Commun. 2016;7:12546.
  3. Gutierrez Mena J, Kumar S, Khammash M. Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback. Nat Commun. 2022;13(1):4808.
  4. Lugagne JB, Blassick CM, Dunlop MJ. Deep model predictive control of gene expression in thousands of single cells. Nat Commun. 2024;15(1):2148.
  5. Steel H, Habgood R, Kelly CL, Papachristodoulou A. In situ characterisation and manipulation of biological systems with Chi.Bio. PLoS Biol. 2020;18(7):e3000794.
  6. Lugagne JB, et al. Balancing a genetic toggle switch by real-time feedback control and periodic forcing. Nat Commun. 2017;8(1):1671.
  7. Chait R, et al. Shaping bacterial population behavior through computer-interfaced control of individual cells. Nat Commun. 2017;8(1):1535.
  8. Harmer ZP, McClean MN. Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit (vol 12, pg 1943, 2023). ACS Synth Biol. 2023;12(11):3505.
  9. Abkar L, et al. Enhanced reproducibility and precision of high-throughput quantification of bacterial growth data using a microplate reader. J Vis Exp. 2022;185:63849.
  10. Olson EJ, et al. Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals. Nat Methods. 2014;11(4):449-456.
  11. Bugaj LJ, Lim WA. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nat Protoc. 2019;14(7):2205-2228.
  12. Repina NA, et al. Engineered illumination devices for optogenetic control of cellular signaling dynamics. Cell Rep. 2020;31(10):107737.
  13. Höhener TC, et al. LITOS: A versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation. Sci Rep. 2022;12(1):13139.
  14. Vogt A, et al. Simultaneous spectral illumination of microplates for high-throughput optogenetics and photobiology. Biol Chem. 2024;405(11-12):751-763.
  15. Kumar S, et al. Diya: A universal light illumination platform for multiwell plate cultures. iScience. 2023;26(10):107862.
  16. Soffer G, Perry JM, Shih SCC. Real-time optogenetics system for controlling gene expression using a model-based design. Anal Chem. 2021;93(6):3181-3188.
  17. Benman W, et al. High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates. Commun Biol. 2023;6(1):1192.
  18. Namboothiri HR, et al. Closed-loop optogenetic control in a microplate reader. ACS Synth Biol. 2026;15(6):2356-2365.
  19. Worldsemi. WS2812B intelligent control LED integrated light source. 2026: https://cdn-shop.adafruit.com/datasheets/WS2812B.pdf
  20. Lambert TJ. FPbase: A community-editable fluorescent protein database. Nat Methods. 2019;16(4):277-278.
  21. Xia YN, et al. Replica molding using polymeric materials: A practical step toward nanomanufacturing. Adv Mater. 1997;9(2):147-149.
  22. Ong NT, Tabor JJ. A miniaturized Escherichia coli green light sensor with high dynamic range. ChemBioChem. 2018;19(12):1255-1258.
  23. Hanahan D, Jessee J, Bloom FR. Plasmid transformation of Escherichia coli and other bacteria. Methods Enzymol. 1991;204:63-113.
  24. ANSI SLAS 1-2004 (R2012). Footprint dimensions. At https://www.slas.org/SLAS/assets/File/public/standards/ANSI_SLAS_1-2004_FootprintDimensions.pdf.
  25. Åström KJ, Murray RM. Feedback systems: An introduction for scientists and engineers. Princeton University Press; Princeton, NJ; 2008.
  26. Namboothiri HR, Pandey A, Hu CY. Resolving emergent transient oscillations in gene circuits with a growth-coupled model. Sci Adv. 2026;12(6):eadz2310.
  27. Song LL, Hennink EJ, Young IT, Tanke HJ. Photobleaching kinetics of fluorescein in quantitative fluorescence microscopy. Biophys J. 1995;68(6):2588-2600.
  28. Campbell DJ, et al. Replication and compression of bulk and surface structures with polydimethylsiloxane elastomer. J Chem Educ. 1999;76(4):537-541.

Перепечатки и разрешения

Теги

Оптогенетический контрольсветодиодный микропланшетэкспрессия геновдинамическая световая стимуляцияридер для микропланшетовмикролунки из ПДМСсборка схемыпрограммирование Arduinoизмерение флуоресценциибактериальные культуры

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.