Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Исследовательская статья

Идентификация биомаркеров и потенциальных терапевтических соединений при легочной гипертензии с помощью биоинформатики и машинного обучения

82 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/73519

⸱

25 августа 2026 г.

 ,  , 
1College of Biological and Food Engineering, Huaihua University

В этой статье

Краткое содержание

В данной статье представлен воспроизводимый биоинформатический рабочий процесс, объединяющий общедоступные транскриптомные наборы данных, машинное обучение, внешнюю валидацию, количественную обратную транскрипцию с ПЦР, скрининг с использованием Connectivity Map и молекулярный докинг для идентификации биомаркеров легочной гипертензии и потенциальных терапевтических соединений.

Аннотация

Данное исследование было направлено на поиск молекулярных биомаркеров, связанных с легочной гипертензией (ЛГ), и потенциальных низкомолекулярных соединений с использованием общедоступных транскриптомных данных и независимых ресурсов для валидации. Три набора данных Gene Expression Omnibus (GSE22356, GSE33463 и GSE48149) были интегрированы после нормализации, аннотации зондов и коррекции пакетного эффекта с помощью ComBat. Для выявления основных генных признаков использовались анализ дифференциальной экспрессии, взвешенный анализ сетей коэкспрессии генов, анализ функционального обогащения, анализ сети белок-белковых взаимодействий и три алгоритма машинного обучения. Диагностическая эффективность оценивалась с помощью кривых рабочих характеристик приемника (ROC-кривых). Внешняя валидация включала независимую когорту образцов легочной ткани (GSE117261), набор данных секвенирования РНК отдельных клеток легочной артерии (GSE210248) и количественную обратную транскрипционную ПЦР в независимых образцах легочной ткани. Для скрининга соединений-кандидатов использовались репозиционирование лекарственных средств на основе Connectivity Map и молекулярный докинг. Было выявлено 78 дифференциально экспрессируемых генов, из которых CXCL10, JUN, IFIH1, MX1 и TLR7 были выбраны в качестве основных генных признаков. В независимой когорте легочной ткани GSE117261 ген JUN продемонстрировал наиболее сильное внешнее подтверждение, в то время как репликация других генов была вариабельной. Количественная обратная транскрипционная ПЦР в 20 биологически независимых образцах при легочной артериальной гипертензии и 20 контрольных образцах подтвердила повышенную экспрессию всех пяти генов. Модель qRT-PCR на основе пяти генов и 100 повторных стратифицированных пятикратных перекрестных проверок дали площадь под кривой (AUC) 1,000, хотя малый размер когорты требует осторожной интерпретации и независимой проспективной валидации. Анализ отдельных клеток GSE210248 подтвердил изменение взаимодействия между иммунными и структурными клетками, а также фенотипическое переключение гладкомышечных клеток. В скрининге Connectivity Map соединение BRD-K91900765/VX-745 заняло первое место. Белок MAPK14/p38α, являющийся его установленной фармакологической мишенью, был включен в качестве положительного эталонного белка для докинга, в то время как докинг с пятью белками, связанными с биомаркерами, рассматривался как исследовательский. Эти результаты позволяют рассматривать данные пять генов как потенциальные биомаркеры ЛГ, а VX-745 — как гипотезу вычислительного репозиционирования лекарств, требующую экспериментальной проверки.

Введение

Легочная гипертензия (ЛГ) представляет собой прогрессирующий сердечно-легочный синдром, характеризующийся стойким повышением давления в легочной артерии, увеличением легочного сосудистого сопротивления и последующей правожелудочковой недостаточностью. Согласно современным гемодинамическим критериям, ЛГ определяется как среднее давление в легочной артерии в состоянии покоя >20 mmHg, измеренное с помощью катетеризации правых отделов сердца1. Среди различных клинических подтипов легочная артериальная гипертензия (ЛАГ) является одной из наиболее тяжелых форм и характеризуется прогрессирующим ремоделированием легочных сосудов. Ее патологические особенности включают эндотелиальную дисфункцию, аномальную пролиферацию и миграцию гладкомышечных клеток легочных артерий, активацию фибробластов адвентиции, отложение внеклеточного матрикса, инфильтрацию воспалительными клетками, а также сужение или облитерацию дистальных легочных артерий2. Эти изменения указывают на то, что ЛГ/ЛАГ является не только нарушением вазоконстрикции, но и комплексным заболеванием с ремоделированием сосудов, обусловленным скоординированными молекулярными, клеточными и иммуновоспалительными механизмами.

Современные методы терапии ЛАГ в основном направлены на пути простациклина, эндотелина, оксида азота — растворимой гуанилатциклазы и фосфодиэстеразы 5-го типа3˒4. Хотя эти методы лечения улучшают симптоматику, переносимость физических нагрузок и гемодинамические показатели, их эффект остается преимущественно вазодилатирующим и гемодинамическим. Их способность обращать вспять уже сформированное ремоделирование легочных сосудов ограничена, и многие пациенты продолжают испытывать прогрессирование заболевания, несмотря на комбинированную терапию. Следовательно, выявление новых молекулярных биомаркеров и терапевтических кандидатов, отражающих процесс ремоделирования, представляет собой важную нерешенную задачу. В частности, иммунно-воспалительная активация, интерферон-зависимая сигнализация, пути Toll-подобных рецепторов, опосредованное хемокинами привлечение иммунных клеток и фенотипическое переключение гладких мышечных клеток были признаны потенциальными факторами прогрессирования ЛГ/ЛАГ5˒6.

Высокопроизводительные транскриптомные наборы данных предоставляют ценные ресурсы для идентификации молекулярных сигнатур, связанных с заболеваниями при ЛГ/ЛАГ. Однако исследования, основанные на одном наборе данных, часто ограничены малым размером выборки, эффектами пакетирования, гетерогенностью платформ и недостаточной валидацией. Анализ дифференциальной экспрессии позволяет выявить гены с измененной экспрессией, но может не полностью охватить связанные с заболеванием коэкспрессионные модули или взаимодействия на уровне сетей. Взвешенный анализ сетей коэкспрессии генов (WGCNA) позволяет идентифицировать генные модули, ассоциированные с признаками заболевания, в то время как анализ сетей белок-белковых взаимодействий (PPI) может выявить высокосвязанные гены внутри биологических сетей. Методы машинного обучения также могут помочь в приоритезации генов, имеющих диагностическую ценность или ценность для классификации. Тем не менее, опора на один алгоритм может привести к возникновению специфического для данной модели смещения. Таким образом, интеграция анализа дифференциальной экспрессии, WGCNA, анализа сетей PPI и нескольких алгоритмов машинного обучения может повысить надежность поиска биомаркеров.

Еще одной серьезной проблемой в исследованиях транскриптомных биомаркеров является биологическая интерпретация. Сигналы, полученные из общей ткани (bulk-tissue), могут отражать изменения экспрессии генов в резидентных сосудистых клетках, инфильтрацию иммунных клеток или изменение пропорций нескольких популяций клеток. Секвенирование РНК отдельных клеток предоставляет возможность поместить гены-кандидаты, выявленные при общем анализе, в клеточный контекст. При ЛГ/ЛСА ремоделирование легочных сосудов затрагивает эндотелиальные клетки, гладкомышечные клетки, фибробласты, моноциты/макрофаги, лимфоциты и другие иммунные или структурные клетки. Прогрессирование заболевания также связано с нарушением межклеточного взаимодействия и фенотипическим переключением гладкомышечных клеток. Таким образом, сочетание общего транскриптомного скрининга с валидацией на уровне отдельных клеток может помочь определить, связаны ли биомаркеры-кандидаты с иммунной активацией, структурным ремоделированием сосудов или дисбалансом в многоклеточном взаимодействии.

Помимо поиска биомаркеров, транскриптомные сигнатуры могут быть использованы для компьютерного перепрофилирования лекарственных средств. Карта связей (Connectivity Map, CMap) связывает профили экспрессии генов, ассоциированные с заболеванием, с малыми молекулами, которые могут обратить вспять или модулировать эти сигнатуры7. В сочетании с курированием соединений и молекулярным докингом эта стратегия позволяет формулировать терапевтические гипотезы, которые можно проверить экспериментально. Хотя прогнозы CMap и молекулярный докинг не позволяют установить эффективность препарата, они помогают приоритизировать соединения-кандидаты для последующих анализов связывания с мишенью, экспериментов на клеточных культурах и валидации на моделях животных.

Был разработан интегрированный и воспроизводимый рабочий процесс для идентификации биомаркеров PH/PAH и потенциальных терапевтических соединений. Три общедоступных транскриптомных набора данных Gene Expression Omnibus были интегрированы после нормализации и коррекции пакетного эффекта. Для отбора устойчивых генов-признаков использовались анализ дифференциальной экспрессии, WGCNA, анализ функционального обогащения, анализ сети PPI и три алгоритма машинного обучения. Для дальнейшей оценки выбранных генов применялись анализ рабочих характеристик приемника (ROC-анализ), независимая когорта валидации тканей легких, данные секвенирования РНК отдельных клеток легочной артерии и количественная обратная транскрипционная ПЦР-валидация на независимых образцах. Наконец, для поиска потенциальных соединений были применены перепрофилирование лекарственных средств на основе CMap и молекулярный докинг. Новизна исследования заключается в многоуровневой структуре валидации, которая объединяет поиск на основе общего транскриптома, приоритизацию с помощью машинного обучения, независимую валидацию, экспериментальное подтверждение методом количественной обратной транскрипционной ПЦР, механистическую интерпретацию на уровне отдельных клеток и компьютерный скрининг соединений. Гипотеза исследования заключалась в том, что в основе PH/PAH лежит скоординированная программа иммунно-воспалительного ответа и сосудистого ремоделирования, и что устойчивые гены в рамках этой программы могут служить потенциальными биомаркерами и открывать возможности для перепрофилирования лекарственных средств.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Общедоступные наборы данных Gene Expression Omnibus (GEO), проанализированные в данном исследовании, содержали деидентифицированные транскриптомные данные из ранее опубликованных работ и не требовали дополнительного этического одобрения. Комитет по этике Университета Хуайхуа одобрил независимое валидационное исследование количественной обратной транскрипции с последующей ПЦР (qRT-PCR) на образцах тканей легких человека (номер одобрения 2024(A05112)). До сбора образцов от всех участников или их законных представителей было получено письменное информированное согласие. Процедуры одобрения и получения согласия распространялись на все 20 образцов тканей легких с легочной артериальной гипертензией (ЛАГ) и 20 контрольных образцов тканей легких, включенных в валидацию методом qRT-PCR. Инструменты исследования, использованные в данном протоколе, перечислены в Таблице материалов.

1. Сбор и предварительная обработка общедоступных транскриптомных наборов данных

Наборы данных микрочипов GSE22356, GSE33463 и GSE48149, связанные с легочной гипертензией (ЛГ), были получены из базы данных GEO. Образцы с ЛГ/легочной артериальной гипертензией (ЛАГ) и контрольные образцы были извлечены в соответствии с исходными фенотипическими аннотациями. Матрицы экспрессии и файлы аннотаций платформ были загружены с помощью воспроизводимых R-скриптов и пакета GEOquery.

Аннотация зондов и сопоставление с символами генов проводились единообразно для всех наборов данных. В случаях, когда несколько зондов соответствовали одному гену, рассчитывалось среднее значение экспрессии. Была применена квантильная нормализация, а гены с низким уровнем экспрессии или малой вариабельностью были удалены. Наборы данных были объединены, а пакетные эффекты скорректированы с помощью алгоритма ComBat из пакета sva8. Оценка коррекции проводилась с использованием диаграмм размаха («boxplots») и анализа главных компонентов.

2. Идентификация дифференциально экспрессируемых генов

Для сравнения уровней экспрессии между образцами PH и контрольными образцами в матрице экспрессии с поправкой на батч-эффект использовали пакет limma9. Была построена линейная модель и применены методы эмпирического Байесовского анализа. Дифференциально экспрессируемыми генами считались гены с скорректированным значением P <0,05 и абсолютным значением log2 fold change > 0,585. Результаты были визуализированы с помощью графиков «вулкан» (volcano plots) и тепловых карт.

3. Построение взвешенной сети коэкспрессии генов

С использованием пакета WGCNA10 была построена взвешенная сеть коэкспрессии генов. Для выявления выбросов был проведен кластеринг образцов. Параметр мягкого порога (soft-thresholding power) выбирался на основе индекса соответствия безмасштабной топологии. Модули генов были идентифицированы с помощью алгоритма динамического отсечения дерева. Собственные гены модулей коррелировали с фенотипом PH, и был выбран модуль, связанный с заболеванием, который продемонстрировал наиболее сильную корреляцию. Гены в ключевом модуле были пересечены с дифференциально экспрессируемыми генами для получения консенсусных генов.

4. Анализ функционального обогащения

Категории биологических процессов, клеточных компонентов и молекулярных функций Gene Ontology были проанализированы с помощью clusterProfiler11. Для идентификации сигнальных путей был проведен анализ обогащения путей Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes12. В качестве порогов обогащения использовались значения P < 0.05 и q < 0.2, а обогащенные термины были визуализированы с помощью пузырьковых диаграмм11.

5. Построение сети белок-белковых взаимодействий и идентификация хаб-генов

Согласованный список генов был загружен в базу данных STRING с выбором вида Homo sapiens и порогом достоверности взаимодействия > 0.413. Файл взаимодействий был импортирован в Cytoscape, после чего с помощью плагина CytoHubba была проведена ранжировка генов по степени узла. Гены с высокой степенью связности были определены как хабовые гены.

6. Отбор диагностических genes-признаков с использованием машинного обучения

Были применены три независимых алгоритма отбора признаков. Во-первых, была выполнена логистическая регрессия с использованием метода наименьшего абсолютного сжатия и отбора (LASSO) с помощью пакета glmnet и 10-кратной перекрестной проверки для выявления генов с ненулевыми коэффициентами14. Во-вторых, был применен метод рекурсивного исключения признаков с использованием метода опорных векторов для удаления избыточных признаков и выбора подмножества признаков, обеспечивающего максимальную точность перекрестной проверки15. В-третьих, была построена модель случайного леса, и признаки были ранжированы по среднему снижению индекса примеси Джини16. Пересечение наборов генов, полученных с помощью трех алгоритмов, было использовано для определения окончательного набора основных генов-признаков. Пакет pROC использовался для построения рабочих характеристик приемника (ROC-кривых) и расчета значений площади под кривой (AUC)17.

7. Валидация ключевых генов с использованием независимых наборов данных объемного и одноклеточного секвенирования

GSE117261 использовался в качестве независимой внешней валидационной когорты образцов легочной ткани, содержащей 58 образцов при ЛА и 25 контрольных образцов от доноров, не прошедших отбор18. Этот набор данных не использовался при анализе дифференциальной экспрессии для поиска генов, построении взвешенной сети коэкспрессии генов или отборе признаков с помощью машинного обучения. Матрица экспрессии была нормализована и аннотирована, а анализ дифференциальной экспрессии проводился с использованием limma v3.68.0. По всему аннотированному транскриптому была применена коррекция ложноположительных результатов по методу Бенджамини-Хохберга. ROC-кривые (рабочие характеристики приемника) для отдельных генов рассчитывались с использованием pROC v1.19.0.1, 95% доверительных интервалов по методу Делонга и пороговых значений индекса Юдена. В рамках GSE117261 была построена исследовательская модель логистической регрессии на основе пяти генов, и ее внутренняя эффективность была дополнительно оценена с помощью повторной вложенной перекрестной проверки.

GSE210248 (Таблица 1) использовался в качестве валидационного набора данных одноклеточного секвенирования легочной артерии, содержащего образцы от трех пациентов с ЛАГ и трех здоровых доноров19. Обработка данных осуществлялась с помощью Seurat v5.5.1 для контроля качества, нормализации, снижения размерности, кластеризации и аннотации клеток20. Были идентифицированы основные популяции клеток, включая эндотелиальные клетки, гладкомышечные клетки, фибробласты, моноциты/макрофаги, а также Т-клетки и натуральные киллеры. Анализ межклеточного взаимодействия проводился с использованием CellChat v2.1.2 и базы данных лигандов и рецепторов CellChatDB.human21. Объект CellChat был создан на основе нормализованной матрицы экспрессии Seurat и метаданных о типах клеток. Были определены сверхэкспрессируемые гены и взаимодействия лиганд-рецептор; рассчитаны вероятности взаимодействия; удалены взаимодействия с участием групп клеток, содержащих менее 10 клеток; а также выведены и агрегированы сети взаимодействия на уровне сигнальных путей. Данный набор данных использовался только для внешней механистической валидации и не применялся для обучения модели.

ЭлементОписание
Набор данныхGSE210248
Тип данныхСеквенирование РНК единичных клеток на основе капель 10x Genomics; высокопроизводильное транскриптомное профилирование
Образцы человеческого происхожденияТри образца легочной артерии пациентов с ЛАГ и три образца легочной артерии здоровых доноров
Источник тканиТкань легочной артерии ex vivo, преимущественно отражающая клеточную экологию стенки легочных сосудов и процесс сосудистого ремоделирования
Основная аналитическая цельЛокализация по типам клеток, фенотипическое переключение гладкомышечных клеток, взаимодействие между иммунными и структурными клетками и валидация механистической согласованности генов-кандидатов

Таблица 1: Основная информация о наборе данных для одноклеточной валидации GSE210248. В таблице представлены номер доступа к набору данных, платформа секвенирования, источник ткани, состав образцов и цель анализа при валидации одноклеточного анализа легочной артерии.

8. Валидация экспрессии генов с помощью qRT-PCR

Валидация методом qRT-PCR включала 20 биологически независимых образцов ткани легких при ПАГ от пациентов с ЛГ/ПАГ и 20 биологически независимых контрольных образцов ткани легких. Экстракцию общей РНК проводили с использованием Total RNA Extraction Kit. Концентрацию и чистоту РНК оценивали с помощью спектрофотометра, а целостность РНК — методом электрофореза в агарозном геле. В анализ включали только образцы РНК со значениями A260/280 от 1,8 до 2,1 и отсутствием видимой деградации.

Равные количества РНК были подвергнуты обратной транскрипции в комплементарную ДНК с использованием набора Solarbio Universal RT-PCR Kit (AMV; кат. № RP1200). Количественная ПЦР для CXCL10, JUN, IFIH1, MX1 и TLR7 проводилась с использованием SYBR Green PCR Master Mix на системе ПЦР в реальном времени. Каждый биологический образец анализировали в трех технических повторностях вместе с контролями без матрицы и без обратной транскрипции. Среднее значение Ct трех технических повторностей использовали для последующего анализа; технические повторности не рассматривались как независимые наблюдения. Использовали праймеры, перекрывающие экзон-экзонные стыки и дающие ампликоны размером 80–200 bp (Таблица 2). Специфичность праймеров проверяли с помощью NCBI Primer-BLAST и анализа кривых плавления22.

β-actin (ACTB) использовался в качестве внутреннего референсного гена для нормализации уровней экспрессии целевых генов. Относительная экспрессия рассчитывалась с использованием метода 2-ΔΔCt23. Для межгрупповых сравнений, исходя из распределения данных, применялись двухсторонние U-критерии Манна-Уитни, а для пяти генов была проведена коррекция ложноположительных результатов по методу Бенджамини-Хохберга. ROC-кривые для отдельных генов были построены с 95% доверительными интервалами по методу ДеЛонга, а оптимальные пороговые значения выбирались с помощью индекса Юдена. Модель логистической регрессии для пяти генов изначально подбиралась и оценивалась на тех же 40 биологических образцах; эта оценка была определена как кажущаяся эффективность внутри выборки. Для оценки возможного переобучения было выполнено 100 повторений стратифицированной пятикратной перекрестной проверки с использованием модели логистической регрессии с L2-регуляризацией, после чего была рассчитана совокупная эффективность ROC вне выборки.

Генномер доступа RefSeqПрямой праймер (5′–3′)Обратный праймер (5′–3′)Размер продукта (п. н.)Tm (°C)перекрывающие экзоны
CXCL10NM_001565.4GTCAAGCCAT
AATTGTTC		ATAGTGCCAG
GGTAGAGT		14146.1Да
JUNNM_002228.4ACAAGTGGCA
GAGTCCCG		CGCCCAAGTT
CAACAACC		15254.5Да
IFIH1NM_022168GCACAGAGCG
GTAGACCCT		GCCCTGAAGC
ACGAGATG		18254.7Да
MX1NM_002462.5TTAGCCGTGG
TGATTTAGC		CAAGGTGGAG
CGATTCTG		15652.3Да
TLR7NM_016562.4ATTGCCCTCGT
TGTTATA		TTCCTGGAGTT
TGTTGAT		17948.1Да
ACTBNM_001101.3CTCACCATGGAT
GATGATATCGC		AGGAATCCTTCT
GACCCATGC		19456.2Да

Таблица 2: Последовательности праймеров, использованных для количественной обратной транскрипции и ПЦР. В таблице приведены целевые гены, номера доступа RefSeq, последовательности прямых и обратных праймеров, размеры продуктов, температуры плавления и статус охвата экзонов для праймеров, использованных в qRT-PCR.

9. Скрининг соединений-кандидатов и молекулярный докинг

Сигнатуры основных генов с повышенной и пониженной экспрессией были загружены в базу данных Connectivity Map для поиска малых молекул, которые, согласно прогнозам, могут обратить экспрессионный профиль, связанный с ЛС7. Кандидаты были ранжированы по показателю Logit и вероятности прогноза.

Трехмерная структура BRD-K91900765/VX-745 была получена из базы данных PubChem под идентификатором CID 303852524. Фармакологическая информация о соединении была собрана из открытых баз данных лекарственных средств, а структурные дескрипторы были рассчитаны с помощью DrugBank и SwissADME25,26. Структуры белков были получены из RCSB Protein Data Bank с использованием следующих PDB-идентификаторов: CXCL10, 1LV9; JUN, 1JUN; IFIH1, 3B6E; MX1, 5GTM; TLR7, 7CYN; и MAPK14/p38α, 1OUK27. Поиск слепых полостей и молекулярный докинг проводились с использованием CB-Dock2 v2.0 с оценочным движком AutoDock Vina v1.2.028,29. Файлы белков и лигандов были загружены в CB-Dock2, кандидатные полости определялись автоматически, и докинг выполнялся в рамках специфических для каждой полости боксов, созданных сервером. Для каждого белка регистрировались идентификатор полости, оценка Vina (Vina score), объем полости, центр бокса докинга, размеры бокса докинга и файл комплекса белок-лиганд. Поза с наиболее отрицательным значением Vina score была выбрана в качестве наиболее приоритетной предсказанной конформации. MAPK14/p38α был включен как установленная фармакологическая мишень и положительный контрольный белок для докинга VX-745. Докинг в отношении CXCL10, JUN, IFIH1, MX1 и TLR7 носил исследовательский характер и не интерпретировался как доказательство прямого фармакологического воздействия, связывания, ингибирования или эффективности.

10. Статистический анализ и контроль воспроизводимости

Все статистические анализы проводились в R, если не указано иное. Двусторонние значения P < 0.05 считались статистически значимыми. Поправка на множественное тестирование применялась к анализам дифференциальной экспрессии, обогащения, внешней валидации и qRT-PCR, как указано выше. Для оценки стабильности моделей машинного обучения и комбинированных моделей qRT-PCR использовалась кросс-валидация.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Предварительная обработка общедоступных транскриптомных данных и идентификация дифференциально экспрессируемых генов

Интеграция и коррекция методом ComBat наборов данных GSE22356, GSE33463 и GSE48149 позволили уменьшить систематические различия между ними. Диаграммы размаха (boxplots) показали, что распределения экспрессии образцов стали более согласованными после коррекции. Анализ главных компонент показал, что до коррекции образцы кластеризовались в основном в соответствии с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Был разработан интегрированный и воспроизводимый рабочий процесс для идентификации молекулярных биомаркеров, связанных с ЛГ/ЛАГ, и потенциальных терапевтических соединений путем объединения данных общедоступной транскриптомики, анализа weighted gene co-expression network, функционального обогащения, анализа сетей белок-белкового взаимодействия, трех алгоритмов машинного обучения, внешней валидации, интерпретации транскриптомики отдельных клеток, подтверждения методом количественной обратной транскрипции с ПЦР, скрининга ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Данное исследование было поддержано Проектом по строительству инновационной провинции Хунань (№ 2022JJ30465).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2× Мастер-микс SYBR Green для ПЦРBeijing Solarbio Science & ООО «Технология»Кат. № SR1110Количественная ПЦР в реальном времени с использованием красителей для амплификации и флуоресцентной детекции
AI21.msvmRFE.R и e1071Пользовательский R-скрипт с использованием пакета e1071 из CRANAI21.msvmRFE.R; e1071 v1.7-17Метод рекурсивного исключения признаков на основе метода опорных векторов
АгарозаBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.Кат. № A8201; CAS 9012-36-6Оценка целостности тотальной РНК с помощью электрофореза в агарозном геле
Аппарат для электрофореза в агарозном гелеBeijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.Модель DYCZ-24DNЭлектрофоретическая оценка целостности РНК
Скоринговая функция AutoDock VinaЦентр вычислительной структурной биологии, Scripps Researchv1.2.0; RRID: SCR_011958Оценка позирования белка и лиганда в рамках рабочего процесса CB-Dock2
CB-Dock2Лаборатория Cao, веб-сервер CB-Dock2v2.0; доступ по состоянию на июль 2026 г.Слепое определение полостей и молекулярный докинг VX-745 с выбранными структурами белков
CellChatПакет R CellChatv2.1.2Вывод и визуализация межклеточного взаимодействия на основе матрицы экспрессии отдельных клеток
CellChatDB.humanРаспространяется вместе с R-пакетом CellChatCellChatDB.human; подмножество секретируемых сигналов; минимальный порог количества клеток = 10База данных взаимодействий лиганд-рецептор человека для CellChat
clusterProfilerR-пакет Bioconductorv4.20.0; выпуск Bioconductor 3.23Анализ обогащения по Gene Ontology и Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG)
Карта связей (Connectivity Map (CMap/CLUE))Институт Бродресурс L1000/CLUE; RRID: SCR_016204; доступ получен в июле 2026 г.Вычислительный анализ перепрофилирования лекарственных средств
Синтетические олигонуклеотидные праймерыBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.Синтезированы на заказ; последовательности праймеров приведены в таблице 2Амплификация ACTB, CXCL10, JUN, IFIH1, MX1 и TLR7
cytoHubbaМагазин приложений Cytoscapev0.1Ранжирование хабовых генов на основе степени связности в сети белок-белковых взаимодействий
CytoscapeКонсорциум Cytoscapev3.10.4; RRID: SCR_003032Визуализация и анализ сетей белок-белковых взаимодействий
DrugBankБаза знаний DrugBankv6.0; RRID: SCR_002700Идентификация соединений и курирование фармакологической информации
Система гель-документацииBeijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.Модель WO-9413BВизуализация и регистрация результатов проверки целостности РНК с помощью агарозного геля
Архив экспрессии генов (Gene Expression Omnibus, GEO)Национальный центр биотехнологической информацииGSE22356, GSE33463, GSE48149, GSE117261 и GSE210248; RRID: SCR_005012Получение наборов данных транскриптомики единичных клеток и объёмных образцов
GEOqueryR-пакет Bioconductorv2.80.0; релиз Bioconductor 3.23Программное скачивание и импорт данных об экспрессии и фенотипах из GEO
glmnetпакет R из репозитория CRANv5.0Логистическая регрессия с применением метода наименьших абсолютных отклонений (LASSO) и регуляризованное логистическое моделирование
limmaR-пакет Bioconductorv3.68.0; Bioconductor выпуск 3.23; RRID: SCR_010943Анализ дифференциальной экспрессии и эмпирическая статистика Байеса
спектрофотометр NanoDropThermo Fisher ScientificNanoDrop ND-1000; программное обеспечение v3.8Измерение концентрации РНК и коэффициентов чистоты A260/280 и A260/230
NCBI Primer-BLASTНациональный центр биотехнологической информацииВеб-инструмент; RRID: SCR_003095; доступ в июле 2026 г.Проверка специфичности праймеров
pROCпакет R из репозитория CRANv1.19.0.1; RRID: SCR_024286Анализ рабочих характеристик приемника (ROC-анализ), доверительные интервалы Делонга и точки отсечения по индексу Юдена
Банк данных белков (Protein Data Bank, PDB)Банк данных белков RCSB (RCSB Protein Data Bank)CXCL10: 1LV9; JUN: 1JUN; IFIH1: 3B6E; MX1: 5GTM; TLR7: 7CYN; MAPK14/p38α: 1OUK; RRID: SCR_012820Поиск экспериментально определенных структур белков для молекулярного докинга
PubChemНациональный центр биотехнологической информацииPubChem CID 3038525; RRID: SCR_004284Восстановление трехмерной структуры и химических идентификаторов BRD-K91900765/VX-745
RR Foundation for Statistical Computingv4.6.1; RRID: SCR_001905Статистические вычисления, обработка данных, машинное обучение и визуализация
случайный леспакет R из CRANv4.7-1.2Отбор признаков и ранжирование переменных по степени важности методом случайного леса
Система ПЦР в реальном времениStratagene, ныне Agilent TechnologiesСистема ПЦР в реальном времени Mx3000Pамплификация методом кРТ-ПЦР, регистрация флуоресценции, анализ кривых плавления и экспорт значений Ct
SeuratR-пакет CRAN; лаборатория Satijav5.5.1; RRID: SCR_016341Контроль качества, нормализация, снижение размерности, кластеризация и аннотация при секвенировании РНК единичных клеток
Пожалуйста, предоставьте текст (STRING), который необходимо перевести.Консорциум STRINGv12.0; RRID: SCR_005223Построение сети белок-белковых взаимодействий
sva (ComBat)R-пакет Bioconductorv3.60.0; релиз Bioconductor 3.23Коррекция пакетных эффектов между наборами данных
SwissADMEШвейцарский институт биоинформатикиВеб-сервер; доступ получен в июле 2026 г.Предварительный скрининг лекарственно-подобных свойств, физико-химических свойств и параметров ADME
Набор для экстракции тотальной РНКBeijing Solarbio Science & ООО «Технолоджи Ко., Лтд.»Каталожный номер R1200Экстракция и очистка общей РНК из образцов тканей легкого
Универсальный набор для ОТ-ПЦР (AMV)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.Кат. № RP1200Обратная транскрипция тотальной РНК в комплементарную ДНК
WGCNA (взвешенный анализ сетей ко-экспрессии генов)пакет R из репозитория CRANv1.74Построение взвешенной сети коэкспрессии генов и анализ связи модулей с признаками

Ссылки

  1. Simonneau G, et al. Haemodynamic definitions and updated clinical classification of pulmonary hypertension. Eur Respir J. 2019;53(1):1801913. doi: 10.1183/13993003.01913-2018.
  2. Rabinovitch M, Guignabert C, Humbert M, Nicolls MR. Inflammation and immunity in the pathogenesis of pulmonary arterial hypertension. Circ Res. 2014;115(1):165–175.
  3. Humbert M, et al. 2022 ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension. Eur Heart J. 2022;43(38):3618–3731.
  4. Galiè N, et al. 2015 ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension. Eur Respir J. 2015;46(4):903–975.
  5. Soon E, et al. Elevated levels of inflammatory cytokines predict survival in idiopathic and familial pulmonary arterial hypertension. Circulation. 2010;122(9):920–927.
  6. George PM, et al. Evidence for the involvement of type I interferon in pulmonary arterial hypertension. Circ Res. 2014;114(4):677–688.
  7. Subramanian A, et al. A next-generation Connectivity Map: L1000 platform and the first 1,000,000 profiles. Cell. 2017;171(6):1437–1452.e17.
  8. Leek JT, et al. The sva package for removing batch effects and other unwanted variation in high-throughput experiments. Bioinformatics. 2012;28(6):882–883.
  9. Ritchie ME, et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 2015;43(7):e47. doi: 10.1093/nar/gkv007.
  10. Langfelder P, Horvath S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 2008;9:559. doi: 10.1186/1471-2105-9-559.
  11. Yu G, Wang LG, Han Y, He QY. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS. 2012;16(5):284–287.
  12. Kanehisa M, Goto S. KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Nucleic Acids Res. 2000;28(1):27–30.
  13. Szklarczyk D, et al. The STRING database in protein–protein association networks and functional enrichment analyses for any sequenced genome of interest. Nucleic Acids Res. 2023;51(D1):D638–D646.
  14. Friedman J, Hastie T, Tibshirani R. Regularization paths for generalized linear models via coordinate descent. J Stat Softw. 2010;33(1):1–22.
  15. Guyon I, Weston J, Barnhill S, Vapnik V. Gene selection for cancer classification using support vector machines. Mach Learn. 2002;46:389–422.
  16. Breiman L. Random forests. Mach Learn. 2001;45(1):5–32.
  17. Robin X, et al. pROC: an open-source package for R and S+ to analyze and compare ROC curves. BMC Bioinformatics. 2011;12:77. doi: 10.1186/s12859-011-0077-8.
  18. Stearman RS, et al. Systems analysis of the human pulmonary arterial hypertension lung transcriptome. Am J Respir Cell Mol Biol. 2019;60(6):637–649.
  19. Crnkovic S, et al. Single-cell transcriptomics reveals skewed cellular communication and phenotypic shift in pulmonary artery remodeling. JCI Insight. 2022;7(20):e153471. doi: 10.1172/jci.insight.153471.
  20. Hao Y, et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 2021;184(13):3573–3587.e29.
  21. Jin S, et al. Inference and analysis of cell–cell communication using CellChat. Nat Commun. 2021;12(1):1088. doi: 10.1038/s41467-021-21246-9.
  22. Bustin SA, et al. MIQE 2.0: revision of the Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments guidelines. Clin Chem. 2025;71(6):634–651.
  23. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCt method. Methods. 2001;25(4):402–408.
  24. Kim S, et al. PubChem 2023 update. Nucleic Acids Res. 2023;51(D1):D1373–D1380.
  25. Knox C, et al. DrugBank 6.0: the DrugBank Knowledgebase for 2024. Nucleic Acids Res. 2024;52(D1):D1265–D1275.
  26. Daina A, Michielin O, Zoete V. SwissADME: a free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness, and medicinal chemistry friendliness of small molecules. Sci Rep. 2017;7:42717. doi: 10.1038/srep42717.
  27. Burley SK, et al. RCSB Protein Data Bank: powerful new tools for exploring 3D structures of biological macromolecules for basic and applied research and education. Nucleic Acids Res. 2021;49(D1):D437–D451. doi: 10.1093/nar/gkaa1038.
  28. Eberhardt J, Santos-Martins D, Tillack AF, Forli S. AutoDock Vina 1.2.0: new docking methods, expanded force field, and Python bindings. J Chem Inf Model. 2021;61(8):3891–3898. doi: 10.1021/acs.jcim.1c00203.
  29. Liu Y, et al. CB-Dock2: improved protein-ligand blind docking by integrating cavity detection, docking, and homologous template fitting. Nucleic Acids Res. 2022;50(W1):W159–W164. doi: 10.1093/nar/gkac394.
  30. Duffy JP, et al. The discovery of VX-745: a novel and selective p38α kinase inhibitor. ACS Med Chem Lett. 2011;2(10):758–763.
  31. Sheng Y, et al. Crocin inhibits neutrophil migration and activation to treat hypoxic pulmonary hypertension through targeting HCK. Phytomedicine. 2025;148:157334. doi: 10.1016/j.phymed.2025.157334.
  32. Cui H, et al. Leonurine ameliorates hypoxic pulmonary hypertension by inhibiting cross-talk between neutrophils and endothelial cells via SERPINB3 targeting. Int Immunopharmacol. 2026;176:116467. doi: 10.1016/j.intimp.2026.116467.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Идентификация биомаркеровтранскриптомные данныедифференциальная экспрессиякоэкспрессия геновсеть белок-белковых взаимодействийсеквенирование РНК единичных клетокрепозиционирование лекарственных средствколичественная ПЦР
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.