Быстрый рабочий процесс моделирования дефицита распознавания памяти, вызванного депривацией сна у мышей, с использованием теста распознавания нового объекта и гиппокампальных биомаркеров

Краткое содержание

В данной статье представлен быстрый и воспроизводимый рабочий процесс для моделирования дефицита распознавания памяти, вызванного депривацией сна у мышей, путем сочетания депривации сна с применением щадящего обращения, теста на распознавание нового объекта и анализа биомаркеров гиппокампа у одних и тех же животных в рамках 10-дневного цикла с систематической регистрацией вмешательств и заранее определенными критериями контроля качества.

Аннотация

Недостаточный сон способствует когнитивному снижению и может ускорять нейродегенеративные процессы. В данной статье представлен быстрый и воспроизводимый рабочий процесс для моделирования дефицита распознавательной памяти, вызванного депривацией сна у мышей, с установлением связи между поведенческими результатами и молекулярными изменениями в гиппокампе. Протокол использует парадигму 5-часовой депривации сна методом бережного обращения (gentle-handling), которая применяется непосредственно после стандартизированного 10-минутного сеанса ознакомления в тесте распознавания нового объекта (NOR). Распознавательная память оценивается с помощью 5-минутного теста NOR после точно определенного 5-часового интервала сохранения, после чего из тех же животных немедленно извлекают гиппокамп для количественного определения провоспалительных цитокинов, включая интерлейкин-1 бета (IL-1β), интерлейкин-6 (IL-6) и фактор некроза опухоли-альфа (TNF-α), а также маркеров окислительного стресса, включая супероксиддисмутазу (SOD), глутатионпероксидазу (GPx) и малоновый диальдегид (MDA). Основным методологическим достижением являются не отдельные поведенческие или биохимические методы, которые хорошо известны, а их операционная стандартизация в виде единого взаимосвязанного рабочего процесса. Протокол требует наличия структурированного, количественно измеримого журнала вмешательств методом бережного обращения, привязывает обучение и депривацию к фиксированной точке циркадного ритма, сохраняет связи на уровне отдельного животного между записями NOR и образцами тканей, а также заранее определяет критерии контроля качества и анализа. Процедура разработана таким образом, чтобы свести к минимуму физическое ограничение и принудительную физическую активность, может быть выполнена в короткое экспериментальное окно и предлагается в качестве эталонного рабочего процесса, который отдельные лаборатории могут использовать для сопоставления собственной реализации метода депривации сна путем бережного обращения после независимого воспроизведения.

Введение

Сон является фундаментальным физиологическим процессом, необходимым для функционирования мозга, обучения и консолидации памяти¹. Недостаток сна связан с когнитивной дисфункцией, расстройствами настроения и прогрессированием нейродегенеративных заболеваний². Экспериментальная депривация сна (ДС) у грызунов широко используется для изучения нейробиологических последствий острого дефицита сна. Гиппокамп, область мозга, играющая центральную роль в декларативной и пространственной памяти, особенно уязвим к депривации сна³.

Для индукции дефицита сна у грызунов доступно несколько процедур. Модифицированный метод с использованием нескольких платформ позволяет эффективно сократить продолжительность сна с быстрым движением глаз (REM-сон), но может привести к значительному стрессу и физическому истощению⁴. В отличие от него, метод бережного обращения (GH) поддерживает состояние бодрствования посредством мягкой сенсорной стимуляции, такой как постукивание по клетке, перемешивание подстилки или предложение нового материала для гнездования при появлении признаков сна. Краткий период GH, применяемый сразу после обучения, может препятствовать консолидации памяти, зависящей от гиппокампа, позволяя при этом избежать многих искажающих факторов, связанных с парадигмами длительной депривации⁵. Поскольку вмешательства в данном протоколе инициируются позой и поведенческими признаками бодрствования, а не по данным ЭЭГ-подтвержденного REM-сна, метод GH в представленной здесь реализации является общепринятым методом тотальной депривации сна, а не специфической техникой подавления REM-сна, и используется в таком виде на протяжении нескольких десятилетий⁶.

Тест на распознавание нового объекта (NOR) является широко используемым методом оценки памяти на распознавание. Он основан на естественной склонности грызунов больше исследовать новый объект, чем знакомый, что не требует вознаграждения, наказания или длительного обучения^7,8. Было показано, что острая депривация сна (SD) нарушает способность различать новые объекты, обеспечивая тем самым эффективный поведенческий показатель нарушения консолидации памяти⁹. На молекулярном уровне недостаток сна может вызвать нейровоспаление в гиппокампе и окислительный стресс, включая повышение уровней провоспалительных цитокинов и продуктов перекисного окисления липидов, наряду со снижением антиоксидантной способности^10,11.

Сложность применения данной модели заключается не в доступности её отдельных элементов, а в отсутствии операционной согласованности между исследованиями. О «бережном обращении» часто сообщается без структурированного учета интенсивности вмешательства; поведенческие и молекулярные конечные точки зачастую собираются в разных когортах; а критерии контроля качества исследовательского поведения и планирование размера выборки не всегда четко определены. Общая цель данной статьи — предоставить стандартизированный рабочий процесс для моделирования дефицита распознавания памяти, вызванного депривацией сна, связывая поведенческие результаты с молекулярными показателями гиппокампа у одних и тех же животных. Данный метод устраняет эти пробелы в воспроизводимости путем объединения 5-часового окна GH после обучения, журнала интенсивности вмешательств, сбора поведенческих данных и тканей из одной когорты, а также предопределенных аналитических критериев в едином 10-дневном алгоритме (Рисунок 1). Отсутствие стандартизации в реализации GH ранее отмечалось в литературе по методологии исследований сна⁶.

Рисунок 1. Схематическое представление хода эксперимента. Протокол рассчитан на 10 дней, включая работу с животными и привыкание, за которыми следует решающий день тестирования, включающий 10 мин фазы ознакомления в тесте NOR, 5 ч депривации сна с помощью GH, 5 мин теста NOR и последующий немедленный забор тканей гиппокампа у тех же животных для анализа биомаркеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Протокол

Все процедуры с животными были рассмотрены и одобрены Комитетом по этике и благополучию лабораторных животных AILIMO (Zhejiang AILIMO Biotechnology Co., Ltd.) по заявке от больницы Нанкинской Барабанной Башни (главный исследователь: Yuan Liu), номер одобрения AP CODE: ALM202605070, одобрено 7 мая 2026 г. (действительно в течение 4 лет) в соответствии с применимыми институциональными и национальными правилами. Для протокола, описанного ниже, используйте взрослых самцов мышей C57BL/6J (возраст 8–12 недель).

1. Подготовка и привыкание животных

1. Содержите домовых мышей в стандартных лабораторных условиях при температуре 22°C ± 1°C и влажности 50%–60% с циклом освещения 12 ч свет/12 ч темнота (включение света в 07:00, определено как ZT0). Обеспечьте свободный доступ к стандартному корму для грызунов и воде.
2. Ежедневно проводите манипуляции с каждой мышью в течение 3–5 мин на протяжении как минимум 7 дней подряд перед началом тестирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Данная процедура сводит к минимуму стресс, вызванный манипуляциями, который может исказить результаты оценки исследовательского поведения.
3. Подготовьте квадратную непрозрачную арену для теста NOR размером 40 cm × 40 cm × 40 cm с небликующими стенками. Выберите цвет арены, контрастирующий с цветом шерсти животных.
4. Подберите объекты для NOR, которые достаточно тяжелы, чтобы исключить их смещение, и изготовлены из непористого материала. Используйте объекты, различающиеся по форме и текстуре, но сопоставимые по общему размеру.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На Рисунке 2 показана конфигурация при обучении и тестировании.
5. На 8-й и 9-й дни перенесите мышей в помещение для тестирования за 1 ч до привыкания. Поместите каждую мышь в пустую арену на 10 мин, после чего верните ее в домашнюю клетку.
6. Протирайте арену и объекты 70% этанолом после каждого животного. Перед тем как поместить следующее животное, дайте этанолу высохнуть на воздухе в течение примерно 3–5 мин при нормальной лабораторной вентиляции.
   ОСТОРОЖНО: Этанол легко воспламеняется. Обеспечьте надлежащую вентиляцию и держите его вдали от источников возгорания.

Рисунок 2. Схема установки для теста распознавания нового объекта и дизайн эксперимента. В фазе привыкания поместите два идентичных объекта (A и A′) в противоположные углы арены. В фазе тестирования после интервала удержания 5 h замените один знакомый объект новым объектом (B). Для минимизации пространственного предпочтения используйте контрбалансировку положения нового объекта между левой и правой сторонами для разных животных, так что примерно половина животных в каждой группе будет получать новый объект в каждой из позиций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Обучение распознаванию новых объектов (привыкание)

1. На 10-й день начните обучение в тесте на распознавание новых объектов (NOR) в ZT1 (08:00 согласно установленному режиму освещения). Соблюдайте это время начала для всех когорт, чтобы минимизировать циркадные вариации.
2. Перенесите мышей в помещение для тестирования за 1 ч до начала сессии обучения. Поместите два идентичных объекта (A и A′) в противоположные углы арены, примерно в 10 cm от стен.
3. При необходимости закрепите объекты на полу.
4. Поместите мышь в центр арены, лицом от объектов. Позвольте мыши свободно исследовать пространство в течение 10 min.
5. Регистрируйте поведение с помощью системы потокового видеомониторинга. Активное исследование определяется как направление носа к объекту на расстоянии ≤2 cm, обнюхивание объекта или прикосновение к нему носом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не считайте сидение на объекте или забирание на него без активного обнюхивания исследованием объекта.
6. Регистрируйте и оценивайте поведение в тесте NOR с помощью EthoVision XT версии 17.5 и навесной камеры Basler acA1300-60gm. Настройте программное обеспечение для трекинга, установив зону обнаружения кончика носа в радиусе ≤2 cm от каждого объекта для оценки активного исследования в соответствии с критериями, определенными на шаге 2.5.
7. По окончании 10-минутной сессии привыкания немедленно удалите мышь из арены.
8. Тщательно очистите арену и объекты 70% ethanol перед помещением следующего животного.

3. Депривация сна путем осторожного обращения

1. Перед началом тренировочного сеанса на 10-й день присвойте каждому животному уникальный идентификационный код. Сохраняйте этот идентификационный код на протяжении всего периода регистрации поведения и сбора тканей.
2. Распределите животных по группам SD и NSD в соотношении 1:1, используя случайные числа, сгенерированные с помощью функции RAND в Excel.
3. Сразу после обучения NOR верните мышей группы NSD в свои домашние клетки и оставьте их в покое на 5 ч. Содержите животных групп SD и NSD в одинаковых условиях окружающей среды и в одном и том же циркадном временном окне.
4. Сразу после обучения NOR начните процедуру депривации сна методом GH для мышей группы SD. Поддерживайте состояние бодрствования в течение 5 последовательных часов в домашней клетке.
5. Постоянно наблюдайте за животными. Вмешайтесь, если мышь принимает позы, характерные для сна, включая сворачивание калачиком, закрытие глаз или длительную неподвижность.
6. Применяйте стимуляцию постепенно, начиная с осторожного постукивания по клетке. При необходимости слегка потревожьте подстилку, введите новый чистый объект, например бумажную трубку, или осторожно коснитесь животного мягкой кистью.
7. Избегайте физического стеснения, принудительной локомоции, а также аверсивной или болезненной стимуляции.
8. Заполняйте журнал вмешательств в Таблице 1 для каждой клетки на протяжении всего 5-часового периода GH. Записывайте приблизительное количество вмешательств в час, доминирующий тип вмешательства, а также любые отклонения от протокола или проблемы с благополучием животных.
9. Используйте один и тот же шаблон журнала вмешательств для всех когорт.
   ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Не используйте физическое стеснение, принудительные физические упражнения или болезненные стимулы, так как они могут оказывать независимое влияние на память, стресс и воспалительные показатели.

ID клетки/когорты	H1	H2	H3	H4	H5	Доминирующий тип (типы) вмешательства	Отклонение или наблюдение за благополучием
Идентификатор записи	Зафиксируйте количество H1	Зафиксируйте количество H2	Зафиксируйте количество H3	Запишите количество H4	Зафиксируйте количество H5	постукивание / подстилка / новый объект / мягкая кисть	Отметьте при наличии

Таблица 1: Шаблон журнала интервенций по бережному обращению. Записывайте ID клетки или когорты, количество интервенций по бережному обращению в течение каждого часа 5-часового периода депривации сна (H1–H5), доминирующий тип(ы) интервенции, а также любые отклонения от протокола или наблюдения за благополучием животных.

4. Фаза теста NOR

1. Ровно через 5 ч после завершения обучения NOR начните фазу тестирования NOR, чтобы обеспечить фиксированный интервал удержания в 5 ч.
2. Поместите в арену один знакомый объект (A) и один новый объект (B).
3. Сбалансируйте положение нового объекта для разных животных, чередуя его размещение слева и справа, чтобы примерно половина животных в каждой группе получала новый объект слева, а вторая половина — справа.
4. Поместите мышь в центр арены. Позвольте мыши свободно исследовать пространство в течение 5 мин.
5. Запишите сессию с помощью той же системы видеотрекинга, которая использовалась при ознакомлении. Применяйте определение исследования, указанное в шаге 2.5.
6. Очищайте арену и объекты 70% этанолом между тестированием разных животных.

5. Сбор тканей одной когорты и диссекция гиппокампа

1. Сразу после теста NOR идентифицируйте то же животное, прошедшее поведенческое тестирование, для забора тканей.
2. Проведите эвтаназию животного путем декапитации без анестезии в соответствии с утвержденным протоколом работы с животными, чтобы избежать потенциального влияния анестетиков на воспалительные и фосфориकरण-зависимые биомаркеры. Извлеките ткани мозга сразу после эвтаназии.
3. Укажите уникальный идентификатор записи поведения животного на всех пробирках с образцами и в записях, чтобы каждый молекулярный образец оставался напрямую связанным с результатами теста NOR этого животного.
4. Быстро извлеките мозг и поместите его на стерильную, охлажденную до температуры льда поверхность для диссекции.
5. Разделите полушария срезом по срединной сагиттальной плоскости. Выделите гиппокамп из каждого полушария, используя охлажденные микрошпатели.
6. Мгновенно заморозьте выделенные гиппокампы в жидком азоте. Храните образцы при −80°C до проведения анализа.
   ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Жидкий азот может вызвать серьезные холодовые ожоги. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты для работы с криогенными веществами.

6. Количественное определение биомаркеров гиппокампа

1. Добавьте в ледяной лизирующий буфер RIPA комбинированный коктейль ингибиторов протеаз и фосфатаз до рабочей концентрации 1× (10 µL на 1 mL лизирующего буфера из 100× стокового раствора).
2. Гомогенизируйте ткань гиппокампа в соотношении ткань:буфер 1:10 (масса/объем) в дополненном ледяном лизирующем буфере RIPA (10 µL лизирующего буфера на mg ткани). Для типичной массы ткани гиппокампа примерно 25–30 mg на полушарие используйте примерно 250–300 µL лизирующего буфера на полушарие или примерно 500–600 µL для примерно 50–60 mg двусторонней ткани гиппокампа.
3. Центрифугируйте гомогенат RIPA при 14,000 × g в течение 15 мин при 4°C и соберите супернатант. Используйте супернатант для количественного определения общего белка и проведения трех видов ИФА на цитокины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа SOD, GPx и MDA используйте специфические буферы для гомогенизации из соответствующих наборов в соответствии с рекомендациями производителя для сохранения ферментативной активности.
4. Приготовьте отдельный 10% (масса/объем) гомогенат гиппокампа для измерения SOD, GPx и MDA в соотношении ткань:буфер 1:9, используя соответствующий специфический буфер для гомогенизации из набора вместо лизирующего буфера RIPA.
5. Определите общую концентрацию белка с помощью BCA-теста на белок.
6. Определите количество IL-1β, IL-6, TNF-α, SOD, GPx и MDA, используя специфические наборы для ИФА или биохимического анализа, перечисленные в Таблице материалов. Следуйте инструкциям производителя для каждого анализа.
7. Приготовьте стандарты в соответствующем аналитическом буфере. Разведите образцы так, чтобы значения оптической плотности попадали в линейный участок стандартной кривой.
8. Разведите образцы гиппокампа для ИФА на цитокины примерно 1:5 соответствующим разбавителем для анализа. Отрегулируйте разведение в диапазоне 1:2–1:10 по мере необходимости, чтобы получить значения оптической плотности в линейном участке стандартной кривой.
9. Используйте супернатанты 10% (масса/объем) гомогенатов гиппокампа, описанных в шаге 6.4, непосредственно для анализа SOD, GPx и MDA. Не применяйте схему разведения для ИФА на цитокины, описанную в шаге 6.8, к этим трем анализам.
10. Для ИФА на IL-1β, IL-6 и TNF-α добавьте 100 µL стандарта или соответствующим образом разведенного образца гиппокампа в каждую лунку в двух повторах и инкубируйте при 37°C в течение 90 мин. Добавьте 100 µL биотинилированного детектирующего антитела и инкубируйте при 37°C в течение 60 мин.
11. Добавьте 100 µL конъюгата HRP в каждую лунку ИФА на цитокины и инкубируйте при 37°C в течение 30 мин. Проявите с помощью ТМБ-субстрата при 37°C в темноте в течение примерно 15 мин.
12. Для анализа SOD смешайте 20 µL супернатанта гомогената гиппокампа с 20 µL рабочего раствора фермента и 200 µL раствора субстрата. Инкубируйте при 37°C в течение 20 мин и измерьте абсорбцию при 450 nm.
13. Для анализа GPx смешайте 200 µL супернатанта гомогената гиппокампа с реакционной смесью, содержащей GSH, и инкубируйте при 37°C в течение 5 мин. Остановите реакцию и центрифугируйте смесь при 3500 × g в течение 10 мин при 4°C. Проведите развитие окраски супернатанта в течение примерно 15 мин и измерьте абсорбцию при 412 nm, используя 200 µL супернатанта реакции.
14. Для анализа MDA смешайте 100 µL супернатанта гомогената гиппокампа с 1.0 mL рабочего реагента MDA и инкубируйте на водяной бане при 95°C в течение 40 мин. Охладите и центрифугируйте смесь. Перенесите примерно 250 µL супернатанта в микропланшет и измерьте абсорбцию при 532 nm.
15. Для ИФА на цитокины измерьте абсорбцию на длине волны, указанной в наборе (обычно 450 nm), используя коррекцию по референсной длине волны, если такая возможность имеется.
16. Постройте стандартную кривую, используя подходящую модель, например, четырехпараметрическую логистическую регрессию. Нормализуйте каждое измерение биомаркера по общему содержанию белка.
17. Выражайте концентрации цитокинов в pg/mg белка, активность антиоксидантных ферментов в U/mg белка, а MDA в nmol/mg белка, если это совместимо с выбранным набором.

7. Анализ данных и контроль качества

1. Определите время изучения знакомого объекта (T_familiar) и нового объекта (T_novel) во время фазы тестирования в тесте NOR.
2. Рассчитайте индекс дискриминации (DI) следующим образом:
   .
   ПРИМЕЧАНИЕ: Значение DI выше 0,5 указывает на предпочтение нового объекта.
3. Исключите животное из анализа NOR, если общее время изучения объектов (T_novel + T_familiar) составляет менее 10 s. Применяйте этот критерий перед проведением анализа на уровне групп и фиксируйте все случаи исключения.
4. Оцените нормальность распределения для каждой группы с помощью критерия Шапиро–Уилка и однородность дисперсии с помощью критерия Ливена. Для каждой группы оцените DI относительно случайного уровня 0,5 с помощью двухстороннего одновыборочного t-критерия; если допущение о нормальности не соблюдено, используйте вместо него одновыборочный критерий знаковых рангов Уилкоксона относительно 0,5.
5. Установите уровень значимости альфа равным 0,05 для всех статистических тестов, если не указано иное.
6. Сравните DI между независимыми группами NSD и SD с помощью двухстороннего независимого t-критерия при соблюдении допущений о нормальности и однородности дисперсии. В противном случае используйте U-критерий Манна–Уитни.
7. Проанализируйте время изучения знакомого и нового объектов с помощью двухфакторного дисперсионного анализа с повторными измерениями, где факторами являются Группа и Тип объекта. Выполните попарные апостериорные сравнения с поправкой Сидака и приведите 95% доверительные интервалы вместе со всеми оценками межгрупповых различий.
8. Сравните каждый биомаркер гиппокампа между независимыми группами NSD и SD с помощью двухстороннего независимого t-критерия при соблюдении допущений о нормальности и однородности дисперсии. В противном случае используйте U-критерий Манна–Уитни.
9. При оценке нескольких биомаркеров из одной когорты контролируйте частоту ложноположительных результатов (FDR) для всей панели биомаркеров с помощью процедуры Бенджамини–Хохберга. Приведите как номинальные, так и скорректированные по FDR значения p.
10. Проведите априорный анализ мощности с использованием G*Power версии 3.1 для двухстороннего сравнения независимых выборок, приняв индекс дискриминации NOR в качестве основного показателя исхода. Ожидаемый эффект основан на ранее опубликованных исследованиях, демонстрирующих выраженное нарушение предпочтения нового объекта после депривации сна после обучения.
11. Проведите априорный анализ мощности, используя стандартизированный размер эффекта d> Коэна = 1,35, двухсторонний уровень альфа 0,05, мощность 80% и соотношение распределения 1:1. Эти параметры дают расчетный минимальный размер выборки 10 животных на группу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер эффекта был оценен на основе ранее опубликованных данных по распознаванию объектов⁹. Palchykova et al. сообщили о значимом групповом эффекте в отношении продолжительности изучения нового объекта во время фазы тестирования (F(1,16) = 8,26, p < 0,007) для мышей с депривацией сна сразу после обучения по сравнению с контрольной группой с соответствующим временным интервалом (n = 9 на группу), что соответствует d> Коэна ≈ 1,36. Таким образом, для априорного анализа мощности был принят стандартизированный размер эффекта d = 1,35.
12. Увеличьте запланированный размер выборки на 20% до 12 животных на группу (всего 24 животных), чтобы предусмотреть заранее определенные поведенческие или технические исключения. В качестве критериев исключения заранее определите общее время изучения объектов <10 s во время теста NOR, исключения, связанные с благополучием животных, непригодные видеозаписи и технические сбои при анализе тканей/образцов.
13. Не исключайте животных на основании направления или величины наблюдаемого эффекта воздействия.
14. Выполните статистический анализ с использованием Python версии 3.12, SciPy версии 1.17 для проверки гипотез и расчета размера эффекта, и statsmodels версии 0.14 для коррекции частоты ложноположительных результатов по методу Бенджамини–Хохберга.
15. При использовании данного протокола для создания официального набора данных приводите размеры эффекта (например, d> Коэна для межгрупповых сравнений) вместе со значениями p для всех статистических тестов, указанных в пунктах 7.4–7.9.

Результаты

Успешная реализация данного протокола должна привести к согласованному поведенческо-молекулярному результату, не требующему интерпретации любого отдельного показателя в изоляции. Полная последовательность эксперимента проиллюстрирована на рисунке 1, а установка для теста NOR и дизайн эксперимента показаны на рисунке 2. В группе NSD мыши должны демонстрировать явное предпочтение новому объекту, что отражается в значении DI выше уровня случайного выбора 0.5. Мыши, подвергнутые протоколу GH через 5 ч после обучения, должны показать ослабленное предпочтение нового объекта и более низкий DI по сравнению с контролем NSD. Общее время исследования объектов должно оставаться сопоставимым между группами; глобальное снижение исследовательской активности указывало бы на моторные нарушения, тревожность или процедурные ошибки, а не на селективный дефицит памяти на узнавание. В данной когорте (NSD, n = 12; SD, n = 12, из которых одно животное было исключено в соответствии с заранее определенным порогом общего времени исследования в шаге 7.3, в результате чего для анализа NOR осталось n = 11; это исключение последовательно применялось как к анализу индекса дискриминации, так и к анализу общего времени исследования, приведенным ниже) мыши NSD показали средний DI 0.70 ± 0.05 (среднее ± SD), что значительно выше уровня случайного выбора 0.5 (одновыборочный t-критерий, t(11) = 15.21, p < 0.0001), в то время как мыши SD показали средний DI 0.51 ± 0.05, что статистически не отличается от случайного уровня (t(10) = 0.49, p = 0.638). DI значимо различался между группами (t-критерий для независимых выборок, t(21) = 9.28, p < 0.0001; d Коэна = 3.87; средняя разница = 0.19, 95% CI [0.15, 0.23]) (рисунок 3A). Общее время исследования значимо не различалось между группами (NSD: 33.5 ± 8.7 s; SD: 29.9 ± 6.2 s; t(21) = 1.13, p = 0.272) (рисунок 3B), что согласуется с селективным эффектом на память на узнавание, а не с общим снижением исследовательского поведения.

Рисунок 3. Результаты теста распознавания нового объекта. (A) Индекс дискриминации (DI) для групп NSD (n = 12) и SD (n = 11; одно животное было исключено в соответствии с заранее определенным порогом общего времени исследования). Пунктирная линия указывает на уровень случайного выбора 0,5. (B) Общее время исследования объектов во время тестовой фазы для групп NSD (n = 12) и SD (n = 11; исключение то же, что и на панели A). Столбцы показывают среднее значение ± SEM; открытые кружки показывают отдельных животных. ****p < 0,0001; ns — статистически не значимо (двусторонний непарный t-критерий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Журнал вмешательств (Таблица 1) должен подтверждать, что состояние общего наркоза (GH) поддерживалось с помощью мягких, постепенно усиливающихся сенсорных стимулов, а не путем фиксации или принудительного перемещения. Значительные различия в почасовом количестве вмешательств между когортами должны стать поводом для анализа условий содержания в клетках, согласованности действий наблюдателей и практики обращения с животными перед интерпретацией поведенческих различий. В 12 когортах, зарегистрированных в данном исследовании, количество почасовых вмешательств в течение 5-часового окна GH варьировалось от 1 до 6 за час и преимущественно состояло из постукивания по клетке и перемешивания подстилки; вмешательства с использованием мягкой щетки и новых объектов применялись реже; ни в одной клетке не потребовалось физической фиксации или принудительного перемещения, отклонений в благополучии животных отмечено не было.

Биохимические показатели, полученные от одних и тех же животных, должны обеспечить молекулярный контекст для поведенческого фенотипа. Ожидается, что успешная модель SD продемонстрирует согласованную картину более высокой нагрузки провоспалительных цитокинов в гиппокампе, сниженную активность антиоксидантных ферментов и повышенный уровень маркеров перекисного окисления липидов по сравнению с соответствующими контрольными группами NSD. Связывание каждого образца ткани с соответствующей записью NOR позволяет провести оценку соответствия поведенческих и молекулярных признаков на уровне отдельного животного, избегая вариативности партий, которая возникла бы при разделении когорт для поведенческого и биохимического анализов. В данной когорте (NSD, n = 12; SD, n = 12) все шесть биомаркеров гиппокампа значимо различались между группами в ожидаемом направлении и оставались значимыми после коррекции FDR по Бенджамини–Хохбергу для панели из шести маркеров: IL-1β (NSD 43.4 ± 7.5 против SD 58.6 ± 5.3 pg/mg белка; t(22) = −5.73, номинальное p < 0.0001, p с поправкой на FDR < 0.0001, d = −2.34), IL-6 (57.8 ± 8.1 против 71.8 ± 7.4 pg/mg; t(22) = −4.42, номинальное p = 0.0002, p с поправкой на FDR = 0.0002, d = −1.81), TNF-α (40.5 ± 7.8 против 55.1 ± 7.8 pg/mg; t(22) = −4.60, номинальное p = 0.0001, p с поправкой на FDR = 0.0002, d = −1.88), SOD (18.0 ± 2.0 против 14.0 ± 1.8 U/mg; t(22) = 5.16, номинальное p < 0.0001, p с поправкой на FDR < 0.0001, d = 2.11), GPx (13.2 ± 0.9 против 10.8 ± 1.4 U/mg; t(22) = 4.92, номинальное p < 0.0001, p с поправкой на FDR < 0.0001, d = 2.01) и MDA (3.5 ± 0.3 против 4.9 ± 0.8 nmol/mg; t(22) = −5.59, номинальное p < 0.0001, p с поправкой на FDR < 0.0001, d = −2.28). Эти данные представлены на Рисунке 4. Индивидуальные точки данных, показанные на Рисунке 3 и Рисунке 4, являются фактическими экспериментальными измерениями, полученными в этой когорте; все представленные средние значения, размеры эффекта, значения p и доверительные интервалы были рассчитаны непосредственно на основе этих исходных данных.

Рисунок 4. Гиппокампальные биомаркеры у мышей групп NSD и SD. Уровни IL-1β, IL-6 и TNF-α (провоспалительные цитокины), SOD и GPx (антиоксидантные ферменты), а также MDA (маркер перекисного окисления липидов) в гиппокампе мышей групп NSD (n = 12) и SD (n = 12). Столбцы отображают среднее значение ± SEM; пустые кружки обозначают отдельных животных. Маркеры значимости отражают p-значения, скорректированные по методу Бенджамини-Хохберга (FDR) для панели из шести маркеров. ***p < 0.001 и ****p < 0.0001 после FDR-коррекции (двусторонние t-критерии для независимых выборок). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Если мыши NSD не проявляют предпочтения к новому объекту, если общее время исследования опускается ниже заданного порога или если дисперсия биомаркеров оказывается неожиданно высокой, следует провести поиск и устранение неисправностей в процессах габитуации, подбора объектов, согласованности вмешательств, идентификации образцов и времени обработки тканей перед повторным исследованием когорты, как обобщено в таблице 2. Такие результаты считаются субоптимальными и требуют корректировки перед интерпретацией. В данной когорте одно животное SD (M19) было исключено из анализа NOR в соответствии с заранее определенным порогом общего исследования (8.7 s; шаг 7.3), что иллюстрирует тип субоптимального результата, учитываемого данным критерием; ни одно животное NSD не продемонстрировало отсутствие предпочтения к новому объекту, и ни в одной когорте данного набора данных не наблюдалось неожиданно высокой дисперсии биомаркеров, требующей повторного исследования когорты.

Проблема	Возможная причина	Раствор
Низкий общий уровень исследования в тесте на распознавание новых объектов (NOR)	Недостаточная привыкание, высокий уровень тревожности или чрезмерное воздействие факторов окружающей среды	Увеличьте продолжительность ежедневного обращения с животными; убедитесь, что в помещении для тестирования тихо и приглушен свет; перед началом обучения проверьте степень привыкания животных к арене.
Отсутствие предпочтения нового объекта у контрольных животных группы NSD	Объекты различаются по врожденному предпочтению или недостаточно различимы	Проведите предварительный отбор объектов на наивных животных; используйте объекты с явно различающимися текстурами/формами, но одинаковыми размерами и доступностью.
Значительная вариабельность количества вмешательств с применением гормона роста	Непостоянные пороговые значения обсервера или условия в клетках	Проведите обучение наблюдателей с использованием одних и тех же критериев бодрствования; используйте единый журнал регистрации вмешательств; стандартизируйте подстилку, обогащение клетки и условия окружающей среды.
Высокая вариабельность измерений биомаркеров	Запоздалое препарирование, несоответствие идентификационных данных образца или деградация образца	Сохраняйте соответствие идентификаторов поведения и образцов; стандартизируйте время проведения диссекции; незамедлительно подвергайте образцы шоковой заморозке; держите образцы на льду во время гомогенизации.
У мышей линии SD наблюдается выраженный дистресс	Чрезмерно интенсивное воздействие	Используйте только мягкие сенсорные воздействия; при обнаружении признаков стресса прекратите процедуру и следуйте утвержденным протоколам по обеспечению благополучия животных.

Таблица 2: Поиск и устранение неисправностей. Распространенные проблемы, возникающие в ходе рабочего процесса NOR, депривации сна с бережным обращением и анализа биомаркеров гиппокампа, вместе с возможными причинами и рекомендуемыми корректирующими действиями.

Обсуждение

В данной статье представлена быстрая и воспроизводимая методика изучения дефицита распознавательной памяти и молекулярных изменений в гиппокампе, индуцированных острым дефицитом сна. За счет применения 5 ч бережного обращения сразу после стандартизированной 10-минутной фазы обучения, данная процедура воздействует на определенное окно консолидации после обучения и направлена на снижение физической нагрузки, связанной с моделями длительного лишения сна или процедурами, основанными на принудительном перемещении^4,5. Однако в данной работе не приводятся прямые измерения гормонов стресса для подтверждения более низкого физиологического стрессового ответа, что обсуждается ниже в разделе ограничений метода.

Наиболее критическими техническими факторами являются габитуация, последовательный выбор объектов, фиксированная продолжительность интервала удержания 5 h и непрерывный, но неаверсивный мониторинг во время GH. Поскольку NOR основан на спонтанном исследовании, остаточная тревожность или недостаточная габитуация к арене могут подавить исследование объектов и скрыть эффекты, связанные с памятью⁸. Предварительно определенный критерий исключения по времени исследования и журнал вмешательств обеспечивают практический контроль качества, который помогает отличить неудачный поведенческий анализ от истинного фенотипа памяти. Если общий уровень исследования низок, предпочтение нового объекта отсутствует в контрольной группе NSD, количество вмешательств GH существенно варьируется, измерения биомаркеров демонстрируют высокую вариабельность или мыши SD проявляют выраженный стресс, исследователям следует ознакомиться с соответствующими процедурами устранения неполадок в Таблице 2 перед повторением или интерпретацией эксперимента.

Данный протокол не является простым объединением ранее разработанных методов; его основной вклад заключается в четырех конкретных операционных элементах, направленных на обеспечение воспроизводимости, а не на доступность техник. Во-первых, обязательный журнал вмешательств (Протокол, шаг 3 и Таблица 1) вводит количественную, сопоставимую запись для стандартизации интенсивности GH в разных когортах и исследованиях. Сама техника имеет устоявшуюся историю, в то время как настоящий протокол делает акцент на операционной стандартизации ее применения. Это согласуется с признанной ролью GH как метода полной депривации сна и ранее отмеченным отсутствием стандартизации при ее реализации в различных исследованиях⁶. Во-вторых, протокол предусматривает дизайн с использованием одной когорты, при котором поведенческие и молекулярные конечные точки собираются у идентичных, индивидуально отслеживаемых животных в рамках одного 10-дневного цикла; такой дизайн призван снизить вариативность, связанную со сбором поведенческих и биохимических показателей в разных когортах. В-третьих, протокол привязывает окно обучения и депривации к определенному циркадному якорю (ZT1, Протокол, шаг 2) и требует, чтобы когорты NSD и SD содержались в идентичных условиях световой фазы (Протокол, шаг 3), тем самым контролируя циркадную синхронность в рамках рабочего процесса. В-четвертых, протокол определяет априорные критерии контроля качества и анализа, включая минимальный порог времени исследования (Протокол, шаг 7), прозрачную отчетность об исключении данных, проспективное планирование мощности, проверку DI относительно уровня случайности 0,5, проверку допущений, поправку на множественные сравнения биомаркеров и отчетность по размеру эффекта. В совокупности эти элементы превращают отдельные установленные методы в четкий, переносимый рабочий процесс, который предлагается в качестве эталонной структуры, с которой отдельные лаборатории могут сопоставлять собственную реализацию (при условии независимого принятия и репликации), а не в качестве отчета о конкретном биологическом открытии.

Данный рабочий процесс имеет несколько ограничений. Метод GH трудозатратен и требует постоянного внимания экспериментатора, что ограничивает пропускную способность. Кроме того, GH поддерживает состояние бодрствования, но сам по себе не позволяет количественно оценить архитектуру сна. В будущих исследованиях может быть применена предварительная валидация с помощью ЭЭГ/ЭМГ для документирования состояний бдительности и проверки степени дефицита сна, вызванного процедурой GH, перед применением данного процесса к полной экспериментальной когорте. Также в будущем могут быть включены измерения уровня кортикостерона для оценки стресс-эффектов вмешательства. Эти измерения не входят в настоящий протокол и, следовательно, не должны интерпретироваться как валидация, проведенная в данном исследовании. Тест NOR чувствителен к памяти на узнавание, но не дает комплексной оценки пространственной навигации или рабочей памяти; при необходимости получения более широкого когнитивного профиля могут быть добавлены дополнительные тесты, такие как Y-образный лабиринт, лабиринт Барнса или другие однопробные задачи. Модифицированный метод с несколькими платформами представляет собой альтернативный подход для экспериментального индуцирования дефицита сна и использовался для количественной оценки потери сна и его восстановления⁴; в отличие от него, настоящий процесс GH делает акцент на мягком сенсорном воздействии без принудительной локомоции. Однако, поскольку маркеры физиологического стресса в данном протоколе не измерялись напрямую, нельзя сделать вывод о том, что GH вызывает меньший физиологический стрессовый ответ.

Таким образом, данный метод лучше рассматривать как стандартизированную платформу для входа, а не как исчерпывающую модель всех когнитивных последствий дефицита сна. Его ценность заключается в четкой связи между контролируемым вмешательством с использованием GH после обучения, поведенческим анализом, разработанным для минимизации физического воздействия по сравнению с парадигмами принудительного перемещения, забором образцов гиппокампа у тех же животных и прозрачным контролем качества. Тест NOR представляет собой общепризнанный однопробный подход к оценке распознавания памяти^7,8, а депривация сна ранее ассоциировалась с нарушением распознавания объектов⁹, нейровоспалительными изменениями в гиппокампе¹⁰, а также окислительным стрессом в гиппокампе и дефицитом памяти¹¹. Соответственно, эта структура может облегчить сравнение между когортами и обеспечить практическую основу для механистических исследований и скрининга методов вмешательства, направленных на смягчение когнитивных нарушений, связанных с депривацией сна; в предыдущих работах также изучались вмешательства, нацеленные на когнитивные нарушения и нейровоспаление, ассоциированные с депривацией сна¹². В соответствии с этими целями, данная работа сосредоточена на создании и стандартизации воспроизводимого рабочего процесса с представлением репрезентативных данных, демонстрирующих эффективность протокола; более полный набор данных и более широкая биологическая интерпретация могут быть представлены отдельно в будущих работах.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
70% этанол	Любой поставщик	Нет данных	Очистка арены и объектов для теста на распознавание новых объектов (NOR)
Взрослые самцы мышей линии C57BL/6J (8–12 недель)	Zhejiang AILIMO Biotechnology Co., Ltd.	Поскольку исходный текст не был предоставлен, я не могу выполнить перевод. Пожалуйста, введите текст, который необходимо перевести на русский язык.	Экспериментальные животные
Набор для определения концентрации белка методом БКА	Thermo Fisher Scientific (Pierce)	23225	Определение и нормализация общего содержания белка
Программное обеспечение для анализа поведения	Noldus Information Technology B.V.	EthoVision XT версия 17.5	Оценка и анализ исследовательского поведения в тесте на распознавание новых объектов (NOR)
Центрифуга, способная развивать скорость до 14 000 об/мин × г при 4 °C	Eppendorf	Центрифуга 5424 R; кат. № 5404000610	Осветление гомогенатов гиппокампа
Очистка бумажных трубок	Любой поставщик	Нет данных	Вмешательство с применением методов бережного обращения
Средства индивидуальной защиты для работы с криогенными жидкостями	Любой поставщик	Поскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, отправьте контент, который необходимо перевести. Я готов приступить к профессиональному переводу ваших научных и образовательных материалов JoVE на русский язык, соблюдая все указанные требования к академическому стилю, терминологической точности и естественности научной речи.	Безопасное обращение с жидким азотом
Набор для определения активности глутатионпероксидазы	Abcam	ab102530	Количественное определение GPx
Гомогенизатор тканей гиппокампа	IKA-Werke GmbH & Co. KG	T 10 basic ULTRA-TURRAX; кат. № 0003737000	Гомогенизация ткани гиппокампа в лизирующем буфере
Жидкий азот	Любой поставщик	Поскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, введите текст, который необходимо перевести.	Мгновенная заморозка препарированных гиппокампов
Набор для анализа МДА	Sigma-Aldrich	MAK085	Количественное определение МДА
Микропланшетный ридер	Agilent Technologies / BioTek	Микропланшетный спектрофотометр BioTek Epoch 2	Измерение оптической плотности на длинах волн, указанных в инструкции к набору
Микрошпатели	Любой поставщик	Поскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, введите текст для перевода.	Диссекция гиппокампа; использование в охлажденном состоянии
Мышиный ИЛ-1β Набор для ИФА	R&D Systems	MLB00C	ИЛ-1β количественное определение
Набор для ИФА IL-6 мыши	R&D Systems	M6000B	Количественное определение ИЛ-6
TNF-мышиα Набор для ИФА	R&D Systems	MTA00B	ФНО-α Количественное определение
Наборы объектов A/A′ и B	Любой поставщик	Данные отсутствуют	Этапы ознакомления и тестирования NOR
Непрозрачная арена для теста на распознавание новых объектов (40 см × 40 см × 40 см)	Любой поставщик	Поскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, введите текст, который необходимо перевести.	Поведенческое тестирование
Система видеонаблюдения с верхним ракурсом	Basler AG	acA1300-60gm	Видеозапись сеансов ознакомления и тестирования в тесте на распознавание новых объектов (NOR)
Коктейль ингибиторов протеаз и фосфатаз	Thermo Fisher Scientific (Thermo Scientific)	78440	Добавлено в лизирующий буфер при 1× рабочая концентрация (10 µL/mL из 100× стоковый раствор)
Буфер для лизиса RIPA	Thermo Fisher Scientific	89900	Гомогенизация ткани гиппокампа
Пробирки для образцов, подходящие для криоконсервации	Thermo Fisher Scientific (Nunc)	Nunc CryoTube, 1,8 мл; кат. № 375418	Сохранение уникальных идентификаторов образцов животных и хранение препарированной ткани гиппокампа
Мягкая кисть	Любой поставщик	Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода.	Методика бережного обращения
Набор для определения активности СОД	Sigma-Aldrich	19160	Количественное определение СОД
Программное обеспечение для статистического анализа и анализа мощности	G*Power; Python Software Foundation	G*Power версия 3.1; Python версия 3.12 (SciPy 1.17; statsmodels 0.14)	Априорный анализ мощности и статистический анализ, описанные в разделе 7 «Протокол»
Стандартный корм для грызунов	Jiangsu Xietong Pharmaceutical Bio-engineering Co., Ltd.	Диета для содержания облученных крыс/мышей; XTI01WC-010	Кормление животных по желанию (ad libitum)
−80 °C морозильник	Haier Biomedical	DW-86L626	Длительное хранение мгновенно замороженной ткани гиппокампа