Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оптимизированный протокол получения сосудистых органоидов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека

231 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/73561

⸱

3 сентября 2026 г.

 ,  , 
1Center for Stem Cell and Translational Medicine, School of Life Science and Medical Engineering, Anhui University

В этой статье

Краткое содержание

В данном протоколе представлен метод получения сосудистых органоидов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека.

Аннотация

Васкулярные органоиды, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs), стали мощными трехмерными моделями для изучения развития сосудов, механизмов заболеваний и ответов на лекарственные препараты. Современные протоколы создания васкулярных органоидов позволяют генерировать самоорганизующиеся эндотелиально-перицитарные сети; однако вариабельность между партиями, нестабильность формирования органоидов и недостаточное покрытие перицитами могут снижать воспроизводимость и масштабируемость. В данном исследовании представлен оптимизированный протокол получения васкулярных органоидов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPSCs) с улучшенной воспроизводимостью и структурной согласованностью. Ключевые модификации включают уточнение условий формирования эмбриоидных телец, оптимизацию концентраций факторов роста и сроков их применения при индукции мезодермы и васкулярной спецификации, а также улучшение условий трехмерного культивирования, которые способствуют активному привлечению перицитов и взаимодействию между эндотелием и перицитами. Оптимизированные органоиды демонстрируют сильно разветвленные CD31-положительные эндотелиальные сети, которые стабильно оплетаются PDGFR-β-положительными перицитами, при этом вариабельность между партиями значительно снижена по сравнению с исходным протоколом. Приведены подробные пошаговые процедуры генерации органоидов, характеристики методом иммунофлуоресценции целых образцов и оценка контроля качества. Данный оптимизированный метод обеспечивает масштабируемое производство высококачественных васкулярных органоидов, подходящих для изучения взаимодействий сосудистых клеток, моделирования заболеваний и скрининга соединений, тем самым снижая технический порог для лабораторий, стремящихся внедрить эту модельную систему.

Введение

Трехмерные (3D) органоиды стали мощным инструментом для моделирования развития органов и заболеваний человека in vitro, обеспечивая превосходное структурное биомиметическое сходство и патофизиологическую релевантность по сравнению с традиционными двухмерными моделями клеточных культур1,2. В последние годы были успешно созданы органоиды, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC), для множества типов тканей, включая кишечник3, мозг4,5, почки6, печень7,8 и сетчатку9. Однако основной проблемой в исследованиях на основе органоидов является недостаточная васкуляризация при длительном культивировании, что может привести к гипоксии и некрозу, тем самым препятствуя экспансии и дифференцировке органоидов10,11. Для решения этой проблемы были внедрены различные стратегии совместного культивирования, включая добавление эндотелиальных или мезенхимальных стволовых клеток для стимулирования формирования сосудистой сети12,13. Тем не менее, традиционные двухмерные культуры и животные модели не полностью воспроизводят биологию сосудов человека, в то время как методы совместного культивирования вносят дополнительную экспериментальную сложность14. Таким образом, сосудистые органоиды, способные к автономной васкуляризации, представляют собой перспективную релевантную для человека альтернативу15.

Формирование сосудистой сети включает в себя как васкулогенез, так и ангиогенез, которые координируются посредством взаимодействий между эндотелиальными клетками и муральными клетками, такими как перициты и гладкомышечные клетки сосудов, и строго регулируются множеством сигнальных молекул, включая VEGF (фактор роста эндотелия сосудов), TGF-β (трансформирующий ростовой фактор-β), PDGF (тромбоцитарный фактор роста) и ангиопоэтины16. В 2019 году Wimmer и коллеги разработали метод получения самособирающихся 3D-органоидов кровеносных сосудов непосредственно из hPSCs17,18. В этой системе одновременно генерируются эндотелиальные клетки и перициты, что приводит к образованию микрососудистых сетей с формированием просвета и покрытием базальной мембраной. На основе этой платформы сосудистые органоиды использовались для моделирования диабетической васкулопатии при стимуляции высокой концентрацией глюкозы и провоспалительными цитокинами (TNF-α и IL-6); в этих органоидах воспроизводится утолщение базальной мембраны — характерный признак диабетической микрососудистой патологии17. Кроме того, данная модель применялась для изучения наследственных сосудистых заболеваний и в качестве платформы для скрининга сосудистой токсичности19. В последнее время в ряде методических исследований предпринимались попытки оптимизировать создание сосудистых органоидов. Например, достижения в области секвенирования РНК единичных клеток позволили выявить ключевые регуляторные факторы, такие как MECOM и LEF1, создав тем самым молекулярную основу для характеристики и оптимизации формирования сосудистых органоидов человека. Кроме того, Xu и соавт. внедрили микролунки для облегчения гомогенного формирования эмбриоидных телец и использовали коктейль CEPT для повышения жизнеспособности клеток, что позволило эффективно снизить вариабельность между сериями образцов20.

Для повышения гомогенности, воспроизводимости и пропускной способности процесса получения сосудистых органоидов оригинальный протокол, описанный Wimmer et al.17,18, был систематически оптимизирован для устранения нескольких ключевых ограничений. Во-первых, в оригинальном протоколе для формирования эмбриоидных телец используется естественная агрегация в планшетах с низкой адгезией, что может привести к значительной вариабельности размера агрегатов от партии к партии и, как следствие, к неоднородной эффективности дифференцировки. В оптимизированном протоколе поливиниловый спирт (PVA) сочетается с орбитальным встряхиванием во время формирования агрегатов для обеспечения равномерной агрегации клеток и повышения единообразия размера эмбриоидных телец. Во-вторых, в оригинальном протоколе на стадии формирования сосудистой сети используется полная замена среды, что может вызвать существенные колебания концентраций факторов роста и нарушить устойчивое прорастание сосудов и привлечение перицитов. Напротив, в оптимизированном протоколе при каждой смене среды сохраняется одна треть кондиционированной среды для поддержания эндогенных проангиогенных факторов и стабилизации культурной среды. В-третьих, оригинальный протокол требует многократного переноса планшетов во время изоляции и созревания органоидов, что увеличивает трудоемкость манипуляций и риск потери органоидов. Оптимизированный протокол исключает эти этапы за счет индивидуального переноса изолированных органоидов в лунки 96-луночных планшетов с низкой адгезией, что упрощает процедуру и увеличивает пропускную способность. В совокупности данный оптимизированный протокол содержит детальные пошаговые инструкции и критические контрольные точки контроля качества, что снижает технический порог внедрения данной модельной системы и способствует более широкому применению сосудистых органоидов в исследованиях развития сосудов, механизмов заболеваний и высокопроизводительного скрининга лекарственных средств.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Использование hPSCs в данном исследовании было одобрено Комитетом по биомедицинской этике Университета Аньхуэй (BECAHU_2026-010).

1. Поддержание индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека

ПРИМЕЧАНИЕ: Культивируйте индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (hiPSCs) в бесфидерных условиях. Все процедуры следует проводить в шкафу биологической безопасности II класса с соблюдением правил асептики.

  1. Подготовка культуральных планшетов, покрытых матриксом базальной мембраны
    1. Извлеките флакон с матриксом базальной мембраны из −20 °C и разморозьте его при 4 °C в течение ночи (примерно 12–16 ч). Избегайте повторных циклов замораживания-оттаивания.
    2. Тщательно перемешайте размороженный матрикс базальной мембраны в стерильных условиях и разделите его на одноразовые аликвоты (например, по 1 mL на пробирку). Храните аликвоты при −20 °C до 2 лет.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В процессе работы держите матрикс базальной мембраны, пипетки, наконечники и пробирки охлажденными, чтобы предотвратить преждевременное затвердевание. Избегайте образования пузырьков воздуха.
    3. Разморозьте необходимую аликвоту матрикса базальной мембраны на льду. Разведите матрикс базальной мембраны 1:200 в предварительно охлажденном DMEM (5 µL матрикса базальной мембраны на 1 mL DMEM; конечная концентрация — примерно 5 µg/mL).
    4. Осторожно перемешайте раствор путем пипетирования до полного исчезновения видимых частиц.
    5. Добавьте по 0,5 mL разведенного матрикса базальной мембраны в каждую лунку 12-луночного планшета. Осторожно наклоняйте и вращайте планшет, чтобы покрыть всю нижнюю поверхность.
    6. Инкубируйте покрытый планшет при 37 °C в инкубаторе с 5% CO₂ не менее 2 ч или при 4 °C в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните герметично закрытые покрытые планшеты при 4 °C в течение 1–2 недель. Перед использованием доведите планшет до комнатной температуры и аспирируйте раствор для покрытия.
  2. Размораживание хиПСК
    1. Извлеките криопробирку с замороженными хиПСК из жидкого азота и немедленно поместите ее в водяную баню при 37 °C. Осторожно встряхивайте пробирку и извлеките ее в течение 1 мин, когда останется лишь несколько мелких кристаллов льда.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте длительного воздействия диметилсульфоксида (DMSO) при 37 °C и неполного размораживания, так как оба этих фактора могут снизить жизнеспособность клеток.
    2. Продезинфицируйте внешнюю поверхность криопробирки 70% этанолом и откройте ее внутри бокса биологической безопасности.
    3. Медленно перенесите клеточную суспензию по каплям в коническую пробирку объемом 15 mL, содержащую 3 mL предварительно подогретой химически определенной среды для поддержания hPSC или эквивалентной химически определенной среды для поддержания. Аккуратно перемешивайте в процессе переноса, чтобы постепенно разбавить DMSO и минимизировать осмотический стресс.
    4. Центрифугируйте клетки при 300 × g в течение 3 мин при комнатной температуре (22–24 °C), используя ротор с поворотными стаканами.
    5. Осторожно аспирируйте супернатант, не задевая клеточный осадок. Аккуратно ресуспендируйте осадок в 1 mL предварительно подогретой химически определенной среды для поддержания hPSC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пипетку P1000 и осторожно пропипетируйте 2–3 раза, чтобы минимизировать механический сдвиг и образование пузырьков.
  3. Посев и культивирование хиПСК
    1. Извлеките предварительно покрытый 12-луночный планшет из инкубатора и аспирируйте раствор для покрытия. Не промывайте лунки.
    2. Для стандартного восстановления после размораживания посейте примерно 1 × 105–2 × 105 жизнеспособных клеток на лунку. Отрегулируйте плотность посева в зависимости от линии хиПСК и требований эксперимента.
    3. Медленно вносите клеточную суспензию вдоль стенки каждой лунки, не касаясь наконечником пипетки покрытой поверхности.
    4. Добавьте Y-27632 до конечной концентрации 5 µM для повышения выживаемости и прикрепления клеток после размораживания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте Y-27632 только в среде для первичного посева. На следующий день замените ее на химически определенную среду для поддержания hPSC без Y-27632.
    5. Инкубируйте клетки при 37 °C с 5% CO₂ и насыщенной влажностью.
    6. Проверьте прикрепление и морфологию клеток примерно через 16–24 ч. Аспирируйте среду и замените ее свежей, предварительно подогретой химически определенной средой для поддержания hPSC без Y-27632.
    7. Заменяйте среду ежедневно или раз в два дня до тех пор, пока клетки не достигнут примерно 70%–80% конфлюэнтности для пассирования или дифференцировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ежедневно проверяйте культуры. Используйте колонии с компактными, четко очерченными границами, высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением и минимальной спонтанной дифференцировкой.

2. Получение и дифференцировка агрегатов hiPSC

ПРИМЕЧАНИЕ: Содержите hiPSC в бесфидерных условиях в химически определенной среде для поддержания hPSC на планшетах, покрытых матриксом базальной мембраны. Проводите пассирование клеток каждые 4–5 дней с использованием 0,02% EDTA. Для максимальной эффективности васкулярной дифференцировки используйте культуры с соответствующей плотностью посева и размером колоний, а также с минимальной спонтанной дифференцировкой.

  1. Приготовление суспензии одиночных клеток
    1. Отоспирируйте химически определенную среду для поддержания hPSC и промойте hiPSCs 0.5 mL DMEM на каждую лунку 6-луночного планшета.
    2. Отоспирируйте DMEM и добавьте по 0.5 mL 0.02% раствора EDTA в каждую лунку. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 2–4 мин, наблюдая за клетками до тех пор, пока они не начнут округляться.
    3. Отделите клетки с помощью дозатора P1000. Осторожно пропипетируйте 2–3 раза, чтобы диссоциировать агрегаты в суспензию одиночных клеток.
    4. Ресуспендируйте клетки в 5 mL химически определенной среды для поддержания hPSC и перенесите суспензию в коническую пробирку объемом 15 mL.
    5. Смешайте 10 µL клеточной суспензии с 10 µL 0.1% раствора трипанового синего. Нанесите 10 µL смеси в счетную камеру и определите количество жизнеспособных клеток.
    6. Рассчитайте объем клеточной суспензии, необходимый для получения 5 × 105 жизнеспособных клеток на лунку.
    7. Центрифугируйте клетки при 300 × g в течение 5 мин при комнатной температуре (22–23 °C). Отоспирируйте супернатант.
    8. Ресуспендируйте клетки в свежей химически определенной среде для поддержания hPSC, содержащей 50 µM Y-27632, из расчета 3 mL на лунку.
  2. Формирование агрегатов
    1. Добавьте по 3 mL клеточной суспензии в каждую лунку 6-луночного планшета с низкой адгезией. Добавьте PVA до конечной концентрации 0.25%.
    2. Поместите планшет на орбитальный шейкер при 50 об/мин и инкубируйте при 37 °C в течение 1 дня.
    3. Перед продолжением работы убедитесь в формировании агрегатов с гладкими краями и диаметром примерно 50–100 µm или более.
    4. ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизируйте период агрегации для каждой конкретной линии hiPSC. При необходимости продлите инкубацию до 2–3 дней для получения агрегатов желаемого размера.
  3. Индукция мезодермы
    1. В День 0 перенесите агрегаты в коническую пробирку объемом 15 mL с помощью стерильной одноразовой пипетки на 10 mL. Сохраните исходный планшет с низкой адгезией для повторного посева.
    2. Дайте агрегатам осесть под действием силы тяжести в течение примерно 15–20 мин.
    3. ПРИМЕЧАНИЕ: Обращайтесь с агрегатами осторожно и используйте гравитационное осаждение вместо центрифугирования, чтобы минимизировать механические повреждения.
    4. Осторожно отоспирируйте супернатант после оседания агрегатов.
    5. Ресуспендируйте агрегаты в среде N2B27 с добавлением 12 µM CHIR99021 и 30 ng/mL BMP-4 из расчета 3 mL на лунку.
    6. Перенесите агрегаты обратно в планшет с низкой адгезией и инкубируйте при 37 °C.
    7. Осторожно пропипетируйте агрегаты один раз в день с помощью дозатора P1000, чтобы минимизировать избыточное слияние агрегатов. Продолжайте индукцию мезодермы в течение 3 дней.
  4. Индукция васкулярной линии
    1. В День 3 перенесите агрегаты в коническую пробирку объемом 15 mL и дайте им осесть под действием силы тяжести. Сохраните исходный 6-луночный планшет.
    2. Осторожно отоспирируйте супернатант после оседания агрегатов.
    3. Ресуспендируйте агрегаты в среде N2B27 с добавлением 100 ng/mL VEGF-A и 2 µM форсколина из расчета 3 mL на лунку.
    4. Перенесите агрегаты обратно в 6-луночный планшет с низкой адгезией и инкубируйте еще в течение 2 дней.

3. Создание сосудистых сетей и органоидов

  1. Приготовление матрицы из коллагена I и базальной мембраны
    1. Соберите агрегаты, полученные в одной 6-луночной планшете, для помещения в один 12-луночный планшет. Используйте примерно 40–60 агрегатов на лунку.
    2. Приготовьте достаточное количество смеси матрицы из коллагена I и базальной мембраны, чтобы добавить два слоя по 0.5 mL в каждую лунку 12-луночного планшета.
    3. Приготовьте 12 mL матрицы для одного 12-луночного планшета. Держите все компоненты на льду, готовьте смесь непосредственно перед использованием и избегайте появления пузырьков воздуха.
    4. Добавьте по 0.5 mL матрицы в каждую лунку 12-луночного планшета. Осторожно перемешайте планшет круговыми движениями для равномерного распределения матрицы.
    5. Инкубируйте планшет при 37 °C в течение 2 ч до затвердевания первого слоя матрицы.
  2. Помещение агрегатов в матрицу
    1. Перенесите агрегаты в коническую пробирку объемом 15 mL с помощью стерильной одноразовой пипетки на 10 mL и дайте им осесть под действием силы тяжести.
    2. Аспирируйте супернатант и дважды промойте агрегаты 1 mL среды N2B27. После окончательной промывки удалите как можно больше остатков среды.
    3. Приготовьте свежую смесь матрицы из коллагена I и базальной мембраны и держите ее на льду.
    4. Осторожно ресуспендируйте промытые агрегаты в свежеприготовленной матрице.
    5. Извлеките 12-луночный планшет с затвердевшим первым слоем из инкубатора.
    6. Добавьте по 0.5 mL матрицы, содержащей агрегаты, в каждую лунку.
    7. Осторожно покачивайте планшет не более 1 мин для равномерного распределения агрегатов.
    8. Немедленно инкубируйте планшет при 37 °C в течение 2 ч до затвердевания второго слоя.
  3. Индукция сосудистого прорастания
    1. Предварительно нагрейте до 37 °C среду N2B27, дополненную 15% FBS, 100 ng/mL VEGF-A и 100 ng/mL FGF-2.
    2. Добавьте предварительно нагретую дополненную среду в каждую лунку для индукции сосудистой дифференцировки.
    3. Наблюдайте за культурами на предмет сосудистого прорастания в течение следующих 1–3 дней.
    4. ПРИМЕЧАНИЕ: Перед добавлением в культуры нагрейте среду до 37 °C, чтобы минимизировать дестабилизацию гелевой матрицы.
  4. Смена среды и поддержание культур
    1. Проведите первую смену среды через 3 дня после помещения агрегатов в матрицу.
    2. После этого заменяйте среду через день, используя свежую среду N2B27, содержащую 15% FBS, 100 ng/mL VEGF-A и 100 ng/mL FGF-2.
    3. При каждой смене среды оставляйте одну треть кондиционированной среды, а остальные две трети заменяйте свежей дополненной средой.
  5. Переходите к выделению сосудистых органоидов на 10-й день.

4. Создание сосудистых органоидов и подготовка к окрашиванию

  1. Изоляция отдельных сосудистых сетей
    1. Введите закругленный конец стерильного шпателя вдоль края лунки и осторожно отделите гелевый матрикс от дна.
    2. Продолжайте перемещать шпатель от края лунки к центру, пока весь гелевый матрикс не окажется свободно плавающим.
    3. С помощью двух стерильных игл вырежьте отдельные сосудистые сети из геля. Удалите как можно больше излишков матрикса, не повреждая сосудистую сеть.
  2. Культивирование изолированных органоидов
    1. Перенесите каждый изолированный органоид непосредственно в отдельную лунку 96-луночного планшета с низкой адгезией с помощью стерильной одноразовой пипетки.
    2. Добавьте в каждую лунку 100 µL среды N2B27, дополненной 15% FBS, 100 ng/mL VEGF-A и 100 ng/mL FGF-2.
    3. Инкубируйте органоиды еще в течение 5 дней, ежедневно заменяя дополненную среду.
    4. К 5-му дню созревания убедитесь, что органоиды имеют округлую и полностью инкапсулированную морфологию.
  3. Фиксация сосудистых органоидов
    1. Перенесите морфологически зрелые органоиды в микроцентрифужные пробирки объемом 2 mL. Обрабатывайте не более примерно 60 органоидов в одной пробирке.
    2. Осторожно аспирируйте среду и добавьте 4% параформальдегид (PFA) в PBS.
    3. Фиксируйте органоиды при комнатной температуре в течение 1 h.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: PFA токсичен и является предполагаемым канцерогеном. Работайте с PFA в вытяжном шкафу, используя соответствующие средства индивидуальной защиты.
    4. Аспирируйте PFA и замените его PBS.
      ТОЧКА ОСТАНОВКИ: Храните фиксированные сосудистые органоиды в PBS при 4 °C до 1 месяца.

5. Окрашивание и конфокальная визуализация сосудистых органоидов

  1. Блокировка и пермеабилизация
    1. Добавьте 2 mL блокирующего буфера в каждую пробирку с фиксированными сосудистыми органоидами.
    2. Расположите пробирки вертикально на орбитальном шейкере и инкубируйте при перемешивании при комнатной температуре в течение 2 ч для блокировки и пермеабилизации органоидов.
  2. Инкубация с первичными антителами
    1. Аспирируйте блокирующий буфер и добавьте 50–100 µL первичных антител, разведенных 1:100 в блокирующем буфере.
    2. Расположите пробирки вертикально на шейкере и инкубируйте при перемешивании при 4 °C в течение ночи.
  3. Промывка и инкубация со вторичными антителами
    1. Промойте образцы трижды с использованием PBST по 10–15 мин на каждую промывку. В ходе каждой промывки перемешивайте пробирки, расположенные вертикально.
    2. Добавьте флуоресцентные вторичные антитела, разведенные 1:300 в блокирующем буфере.
    3. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 2 ч.
  4. Контрастирование ядер и финальная промывка
    1. Промойте образцы дважды с использованием PBST по 10–15 мин на каждую промывку.
    2. Добавьте раствор Hoechst, разведенный 1:5,000 в PBS, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10–15 мин.
    3. Промойте образцы в PBS в течение 10–15 мин.
  5. Конфокальная микроскопия
    1. Перенесите окрашенные органоиды в чашки для конфокальной микроскопии.
    2. Получите конфокальные изображения, используя одинаковые параметры съемки для всех экспериментальных групп.
  6. Количественный анализ изображений сосудистых органоидов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните количественный анализ изображений с помощью Fiji/ImageJ и AngioTool. Поддерживайте идентичные настройки микроскопа при сборе данных для всех экспериментальных групп.
    1. Измерение диаметра агрегатов
      1. Получите изображения агрегатов hiPSC 0-го дня в светлом поле с помощью инвертированного микроскопа с калиброванной шкалой. Снимайте хорошо разделенные агрегаты и включайте масштабный отрезок.
      2. Импортируйте каждое изображение в Fiji/ImageJ. Проведите линию вдоль масштабного отрезка с помощью инструмента Straight Line и выберите Analyze > Set Scale.
      3. Введите известное расстояние и единицу измерения (например, 100 µm) и выберите Global, чтобы применить калибровку ко всем изображениям в сессии.
      4. Проведите линию через самый широкий диаметр каждого агрегата с помощью инструмента Straight Line. Выберите Analyze > Measure или нажмите Ctrl+M и запишите диаметр в µm.
      5. Измерьте не менее 30 агрегатов в каждой партии.
      6. Для несферических агрегатов обведите каждый агрегат с помощью инструмента Oval или Polygon Selection. Выберите Analyze > Set Measurements > Feret's diameter и запишите результат измерения.
      7. Экспортируйте измерения из таблицы Results и скомпилируйте данные в электронной таблице.
      8. Для каждой партии рассчитайте среднее значение, стандартное отклонение (SD) и коэффициент вариации (CV) по формуле CV = SD/среднее × 100%.
    2. Измерение диаметра органоидов
      1. Получите изображения зрелых сосудистых органоидов 15-го дня в светлом поле с помощью инвертированного микроскопа с калиброванной шкалой. Включите масштабный отрезок на каждом изображении.
      2. Импортируйте каждое изображение в Fiji/ImageJ и откалибруйте шкалу, как описано в предыдущем шаге
      3. Проведите линию через самый широкий диаметр каждого органоида с помощью инструмента Straight Line. Выберите Analyze > Measure или нажмите Ctrl+M и запишите диаметр в µm.
      4. Измерьте не менее 30 органоидов в каждой партии.
      5. Для органоидов неправильной формы измерьте самый длинный и самый короткий диаметры и вычислите их среднее значение или определите диаметр по Фере (Feret's diameter), как описано в пункте 5.6.1.6.
      6. Экспортируйте измерения и рассчитайте среднее значение, SD и CV для каждой партии.
    3. Количественное определение CD31-положительной сосудистой области
      1. Получите конфокальные z-стек изображения целых органоидов 15-го дня, окрашенных на CD31. Используйте одинаковую мощность лазера, усиление (gain), смещение (offset) и настройки диафрагмы (pinhole) для всех образцов.
      2. Создайте проекции максимальной интенсивности (MIP) из z-стеков с помощью программного обеспечения микроскопа или Fiji/ImageJ.
      3. Примените порог интенсивности для сегментации CD31-положительной сосудистой сети, исключив фоновый сигнал.
      4. Выберите Process > Noise > Remove Outliers и используйте радиус 2–5 пикселей для удаления мелких артефактов. Выберите Process > Binary > Fill Holes для заполнения небольших пробелов внутри сосудистой сети.
      5. Выберите Analyze > Set Measurements и активируйте параметры Area и Area fraction. Выберите Analyze > Measure для определения площади сосудов.
      6. Рассчитайте CD31-положительную сосудистую область как процент от общей площади органоида.
      7. Проанализируйте не менее трех органоидов на партию из трех независимых партий. Экспортируйте измерения для статистического анализа.
    4. Количественное определение покрытия PDGFR-β-положительными перицитами
      1. Получите конфокальные z-стек изображения целых органоидов 15-го дня, окрашенных на CD31 и PDGFR-β. Создайте MIP из z-стеков.
      2. Импортируйте MIP для CD31 и PDGFR-β в Fiji/ImageJ и проверьте совмещение изображений.
      3. Установите порог для канала CD31, чтобы создать бинарную маску, определяющую сосудистую сеть.
      4. Установите порог для канала PDGFR-β, используя тот же подход к сегментации, чтобы создать бинарную маску сигнала перицитов.
      5. Выберите Process > Image Calculator и примените операцию AND к маскам CD31 и PDGFR-β для выявления перекрывающихся пикселей.
      6. Измерьте площадь перекрывающегося сигнала.
      7. Рассчитайте покрытие перицитами как (PDGFR-β-положительная область внутри CD31-положительных сосудов/общая CD31-положительная сосудистая область) × 100%.
      8. Проанализируйте не менее трех органоидов на партию из трех независимых партий. Экспортируйте измерения для статистического анализа.
    5. Анализ индекса ветвления с помощью AngioTool
      1. Получите конфокальные z-стек изображения целых органоидов 15-го дня, окрашенных на CD31. Создайте MIP из z-стеков.
      2. Запустите AngioTool и загрузите MIP-изображение.
      3. Установите диаметр сосуда в соответствии с типичным диаметром сосудов, наблюдаемым на изображениях.
      4. Отрегулируйте порог интенсивности для сегментации сосудистой сети, исключая фоновый сигнал. Установите минимальный размер сосуда для удаления мелких артефактов.
      5. Запустите анализ и запишите площадь сосудов, плотность сосудов, общую длину сосудов, количество разветвлений и индекс ветвления.
      6. Проверьте результирующее изображение, убедившись, что сосуды обведены желтым, сосудистый скелет отображен красным, а точки ветвления отмечены синими точками.
      7. Экспортируйте количественные результаты из AngioTool.
      8. Проанализируйте не менее трех полей зрения на партию из трех независимых партий и скомпилируйте данные для статистического анализа.

6. Количественный анализ сосудистых органоидов методом ПЦР в реальном времени

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры по выделению РНК и последующие этапы следует проводить в условиях отсутствия РНказ.

  1. Экстракция РНК
    1. Соберите 5–10 зрелых сосудистых органоидов 15-го дня в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 mL, свободную от РНказ. Полностью удалите остатки среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: при необходимости объедините несколько органоидов для получения достаточного количества РНК.
    2. Добавьте 350 µL лизирующего буфера, содержащего 1% β-меркаптоэтанола.
    3. Пропипетируйте образцы 10–15 раз до полного лизиса органоидов.
    4. Перенесите лизат в спин-колонку для удаления геномной ДНК, помещенную в коллекционную пробирку. Центрифугируйте при 11,000 × g в течение 30 s при комнатной температуре.
    5. Удалите колонку, сохранив фильтрат.
    6. Добавьте к фильтрату равный объем 70% этанола (примерно 350 µL) и тщательно перемешайте путем пипетирования.
    7. Перенесите до 700 µL смеси в спин-колонку для РНК, помещенную в коллекционную пробирку. Центрифугируйте при 11,000 × g в течение 30 s и удалите фильтрат.
    8. Добавьте в колонку 350 µL промывочного буфера 1. Центрифугируйте при 11,000 × g в течение 30 s и удалите фильтрат.
    9. Приготовьте смесь DNase I, смешав 10 µL DNase I с 70 µL буфера для переваривания ДНКазы на один образец.
    10. Добавьте 80 µL смеси DNase I непосредственно на мембрану колонки и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 min.
    11. Добавьте в колонку 350 µL промывочного буфера 1. Центрифугируйте при 11,000 × g в течение 30 s и удалите фильтрат.
    12. Добавьте в колонку 500 µL промывочного буфера 2. Центрифугируйте при 11,000 × g в течение 30 s и удалите фильтрат.
    13. Повторите промывку с использованием 500 µL промывочного буфера 2.
    14. Центрифугируйте пустую колонку при 11,000 × g в течение 2 min для высушивания мембраны.
    15. Перенесите колонку в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 mL, свободную от РНказ. Добавьте 30–50 µL воды, свободной от РНказ, непосредственно на мембрану и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 min.
    16. Центрифугируйте при 11,000 × g в течение 1 min для элюции РНК. Храните РНК при −80 °C до использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените концентрацию и чистоту РНК с помощью спектрофотометрии. Приемлемым диапазоном считается соотношение A260/A280 от 1,8 до 2,1.
  2. Синтез кДНК
    1. Приготовьте реакционную смесь для обратной транскрипции на льду.
    2. Смешайте 600 ng общей РНК с 4 µL мастер-микса для обратной транскрипции, содержащего обратную транскриптазу, буфер, dNTP и случайные праймеры. Добавьте воду, свободную от РНказ, до конечного объема 20 µL.
    3. Инкубируйте реакционную смесь при 37 °C в течение 15 min, затем при 85 °C в течение 5 s.
    4. Храните полученную кДНК при −20 °C до использования.
  3. Количественная ПЦР в реальном времени
    1. Приготовьте 9 µL мастер-микса для qPCR на одну реакцию, смешав 5 µL 2× SYBR Green мастер-микса, 3 µL воды, свободной от РНказ, и 1 µL предварительно смешанных прямого и обратного праймеров в концентрации 10 µM каждый.
    2. Раздайте по 9 µL мастер-микса в каждую лунку 96-луночного планшета для qPCR.
    3. Добавьте в каждую лунку 1 µL кДНК, чтобы получить конечный объем реакции 10 µL.
    4. Закройте планшет оптической адгезивной пленкой и центрифугируйте при 1,000 × g в течение 1 min.
    5. Проведите начальную денатурацию при 95 °C в течение 30 s.
    6. Проведите 40 циклов амплификации: 95 °C в течение 5 s, затем 60 °C в течение 30 s.
    7. Проведите анализ кривых плавления для подтверждения специфичности ампликона.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый образец анализируют в двух или трех повторностях.
    8. Рассчитайте относительную экспрессию целевого гена методом 2−ΔΔCt. Нормализуйте значения Ct по гену домашнего хозяйства (например, GAPDH) и откалибруйте экспрессию относительно образцов недифференцированных hiPSC.

7. Статистический анализ

  1. Представляйте количественные данные в виде среднего значения ± стандартное отклонение (SD) как минимум трех независимых биологических повторностей (n ≥ 3) для каждого условия.
  2. При измерении диаметра агрегатов и органоидов принимайте каждую независимую партию за одну биологическую повторность; для получения среднего значения на уровне одной партии вычислите среднее арифметическое показателей 30 отдельных структур, измеренных внутри этой партии.
  3. Для получения единого значения на уровне каждой партии измеряют среднюю площадь сосудов, степень покрытия перицитами и индекс ветвления в нескольких органоидах или полях зрения внутри каждой партии, после чего эти значения уровня партии используют для статистического сравнения.
  4. Сравните оптимизированный протокол с оригинальным протоколом Виммера, используя двухвыборочный двухсторонний t-критерий Стьюдента t—тест.
  5. Определите статистическую значимость как p < 0,05. Укажите уровни значимости как p < 0.05, p < 0,01, и p < 0,001, в зависимости от ситуации.
  6. Выполните все статистические анализы с использованием программного обеспечения для статистического анализа версии 10.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Оптимизированный протокол, описанный здесь, позволяет получать зрелые сосудистые органоиды из хиПСК (hiPSCs) примерно за 15 дней, используя стратегию пошаговой дифференцировки (Рисунок 1A). Кратко: агрегаты хиПСК формировали в планшетах с низкой адгезией, дополненных 0.25% PVA, на орбитальном шейкере (день −1). Индукцию мезодермы начинали в день 0 с помощью CHIR99021 (12 µM) и BMP-4 (30 ng/mL) в течение 3 дней, после чего проводили спецификацию сосудистой линии с использованием VEGF-A (100 n...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Оптимизированный протокол, описанный здесь, вносит несколько ключевых улучшений в систему дифференцировки сосудистых органоидов, первоначально разработанную Wimmer et al.18, с целью повышения гомогенности, воспроизводимости и структурной целостности генерируемых сосудистых органоидов. По сравнению с исходным протоколом, оптимизированный метод обеспечивает значительные улучшения по следующим аспектам. Во-первых, оптимизация условий формирования агрегатов существенно повышает гомогенность эмбриоидны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта финансовых интересов.

Благодарности

Данная работа была поддержана Национальным природным научным фондом Китая (NSFC) в рамках Фонда молодых ученых (C) (№ 32200655) и Общей программы (№ 32270847). Авторы также выражают благодарность Платформе государственных услуг Университета Аньхой за оказанную поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Бутылочный фильтр 0,22 μmNalgeneFPE204030Для стерильной фильтрации сред и буферов
Коническая пробирка 15 млSparkJadeGD0001Стерильная
Микроцентрифужная пробирка 2 млEppendorf22363204Стерильная
2-меркаптоэтанол (1000×)Gibco21985023Использовать в вытяжном шкафу
Alexa Fluor 488 AffiniPure F2 фрагмент, антитела осла против IgG кролика (H+L)LableadY1104Вторичные антитела; разведение 1:300
Alexa Fluor 594 AffiniPure F(ab′)2 фрагмент, антитела осла против IgG козы (H+L)LableadY1007Вторичные антитела; разведение 1:300
Антитела к CD31Cell Signaling3528sПервичные антитела; разведение 1:100 в блокирующем буфере
Антитела к PDGFR βZenbio347269Первичные антитела; разведение 1:100 в блокирующем буфере
Автоматический счетчик клетокLife TechnologiesCountess™ IIВключает предметные стекла с счетной камерой
Добавка B27 (50×)Gibco17504044Для среды N2B27; разморозить при 4ºC, разлить по аликвотам и хранить при −20ºC, избегать циклов замораживания-оттаивания
Настольная центрифугаZonkiaSC-3610С ротором с качающимися стаканами
Шкаф биологической безопасности (Класс II)Thermo FisherNAН/Д
BMP4ProteintechHZ-1045Растворить в стерильной ddH2O до 100 ng/μL, разлить по аликвотам и хранить при −20 °C
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Biosharp9048-46-8Для блокирующего буфера
CHIR99021MCEHY-10182Приготовить стоковый раствор 10 mM в DMSO, хранить при −20ºC до 1 года
Инкубатор CO2Fisher ScientificLS-CO15037 ºC, 5% CO2, увлажненный
Диш для конфокальной визуализацииBiosharpBS-20-GJMДля визуализации после окрашивания
Конфокальный микроскопLEICANAОснащен объективами 10×, 20×, 63× и программным обеспечением ZEN
DMEMVivacellC3113-0500Для разведения Matrigel и приготовления раствора коллагена I
DMEM/F-12, добавка GlutaMAXGibco10565018Для разведения Matrigel и приготовления среды N2B27
EDTA (0,5 M, pH 8,0)InvitrogenAM9260GРазвести PBS до 0,02% для пассирования
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Gibco10270-106Для полной дифференцировочной среды N2B27 (финальная концентрация 15%)
FGF-2NovoproteinC046Приготовить стоковый раствор 1 mg/mL в стерильном PBS, разлить по аликвотам и хранить при −20ºC
ФорсколинR&D Systems1099Приготовить стоковый раствор 10 mM в DMSO, хранить при −20ºC
HEPES (1M)Gibco15630080Для раствора коллагена I
HoechstBeyotimeC1071S-4Приготовить стоковый раствор 1 mg/mL в деионизированной воде, разлить по аликвотам и хранить при −20ºC
Инвертированный микроскопLEICADMIL LEDРутинное наблюдение за клетками
Matrigel (с пониженным содержанием факторов роста)STEEMABM05Хранить при −20ºC после разделения на аликвоты, избегать циклов замораживания-оттаивания; работать на льду
Раствор незаменимых аминокислот MEM (NEAA, 100×)Gibco11140035Для среды N2B27
Добавка N2 (100×)Gibco17502048Для среды N2B27; хранить при −20ºC в защищенном от света месте
Среда NeurobasalGibco21103049Для среды N2B27
Вода, свободная от нуклеаз (без DNase/Rnase)LableadDoo55WJДля подготовки РНК/кДНК и qPCR
Орбитальный шейкерJoan LabNAДля этапов промывки
Параформальдегид (4% раствор)ServicebioG1101Развести PBS до 4% для фиксации; использовать в вытяжном шкафу
Пенициллин-стрептомицин (100×)Gibco15140122Для среды N2B27
Среда PGM1CellapyA1517001Среда для экспансии hiPSC; хранить при 4ºC в защищенном от света месте, стабильна в течение 2 недель
Добавка PGM1 (25×)CellapyA1517101Для использования с базовой средой PGM1
Поливиниловый спирт (PVA)Sigma-AldrichP8136Растворить в PGM1 до 0,25% (w/v) для стимуляции агрегации
PureCol (бычий коллаген I типа, 3 mg/mL)Advanced BioMatrix5005Для смеси коллагена I и Matrigel; проверить партию на способность к полимеризации
Термоциклер для qPCRThermo FisherStepOnePlus™С функцией анализа кривых плавления; для детекции методом ПЦР в реальном времени
Набор для обратной транскрипцииAccurate BiologyAG11706Для синтеза кДНК из тотальной РНК; содержит мастер-микс для ОТ с обратной транскриптазой, буфером, dNTP и случайными праймерами
Набор для экстракции РНКYeasen19221ES50Для изоляции тотальной РНК из сосудистых органоидов; включает колонки для удаления гДНК и DNase I, свободную от РНказ
Бикарбонат натрия (7,5%)Gibco25080094Для раствора коллагена I
Дезоксихолат натрияSigma-AldrichD6750Приготовить 1% (w/v) раствор в деионизированной воде для блокирующего буфера
Гидроксид натрия (1,0 N)Sigma-AldrichS2770Для корректировки pH раствора коллагена I
Стерильные одноразовые пипетки (10 мл)Bkmamlab110205007Стерильные, в индивидуальной упаковке
Стерильные наконечники с фильтром (1000, 200, 20 μL)BiozymVT0270/VT0250/VT0220Стерильные, с фильтром
Стерильная игла (30 G)NANAДля препарирования сосудистых сетей
Стерильный шпатель (с круглым концом)Fisher Scientific21-401-5Нержавеющая сталь
SYBR Green Master MixAccurate BiologyAG11733Концентрация 2× для qPCR; содержит ДНК-полимеразу с «горячим стартом», буфер, dNTP и краситель SYBR Green
12-луночный планшет, обработанный для культивирования тканейBD Falcon353043Для встраивания в гель и культивирования сосудистых сетей
6-луночный планшет, обработанный для культивирования тканейEppendorf30720113Стандартный TC-обработанный
Triton X-100Sigma-AldrichT9084Для блокирующего буфера
Трипан синий (0,4%)Thermo Fisher15250061Для подсчета клеток
Tween 20Sigma-AldrichP7949Для 0,05% промывочного раствора PBS-T
6-луночный планшет с ультранизкой адгезиейCorning3471Для формирования агрегатов и дифференцировки
96-луночный планшет с круглым дном и ультранизкой адгезиейBeyotimeFULA962-6pcsДля суспензионного культивирования сосудистых органоидов
VEGF-AProteintechHZ-1038Приготовить стоковый раствор 1 mg/mL в стерильном PBS, разлить по аликвотам и хранить при −20ºC
Водяная баняBlue pardHWS-2437ºC
Y-27632MCEHY-10071Приготовить стоковый раствор 10 mM в стерильном PBS или DMSO, хранить при −20ºC; рабочие концентрации: 5 μM (при размораживании), 50 μM (при формировании агрегатов)

Ссылки

  1. Lancaster MA, Knoblich JA. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 2014;345:1247125.
  2. Clevers H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 2016;165:1586-1597.
  3. Spence JR, et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 2011;470:105-109.
  4. Lancaster MA, et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 2013;501:373-379.
  5. Quadrato G, et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 2017;545:48-53.
  6. Takasato M, et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 2015;526:564-568.
  7. Takebe T, et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 2013;499:481-484.
  8. Huch M, et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 2015;160:299-312.
  9. Nakano T, et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 2012;10:771-785.
  10. Mansour AA, et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 2018;36:432-441.
  11. Ham O, et al. Blood vessel formation in cerebral organoids formed from human embryonic stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2020;521:84-90.
  12. Sun XY, et al. Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. eLife. 2022;11:e76707.
  13. Grebenyuk S, Ranga A. Engineering organoid vascularization. Front Bioeng Biotechnol. 2019;7:39.
  14. Parikh M, Pierce GN. Considerations for choosing an optimal animal model of cardiovascular disease. Can J Physiol Pharmacol. 2024;102:75-85.
  15. Krug A, et al. Three-dimensional spheroid models for cardiovascular biology and pathology. Mechanobiol Med. 2025;3:100144.
  16. Carmeliet P. Angiogenesis in health and disease. Nat Med. 2003;9:653-660.
  17. Wimmer RA, et al. Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature. 2019;565:505-510.
  18. Wimmer RA, et al. Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 2019;14:3082-3100.
  19. Naderi-Meshkin H, et al. Vascular organoids: unveiling advantages, applications, challenges, and disease modelling strategies. Stem Cell Res Ther. 2023;14:292.
  20. Xu C, et al. Vascular organoid generation from human-induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. 2024;214:e67125.
  21. Frenz-Wiessner S, et al. Generation of complex bone marrow organoids from human induced pluripotent stem cells. Nat Methods. 2024;21:868-881.
  22. Sun D, et al. Matrix viscoelasticity controls differentiation of human blood vessel organoids into arterioles and promotes neovascularization in myocardial infarction. Adv Mater. 2025;37:e2410802.
  23. Hoffmann A, et al. Animal-origin-free method for generating blood vessel organoids. Sci Rep. 2026;16:12096.
  24. Nikolova MT, et al. Fate and state transitions during human blood vessel organoid development. Cell. 2025;188:3329-3348.e31.
  25. Quintard C, et al. A microfluidic platform integrating functional vascularized organoids-on-chip. Nat Commun. 2024;15:1452.
  26. Sun L, Wang P, Lin X, Qiu Y. Microfluidic vascular organoids-on-chips: a promising platform for advancing plastic and reconstructive surgery. Chinese Journal of Plastic and Reconstructive Surgery. 2025.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Плюрипотентные стволовые клетки человекагенерация органоидовформирование эмбриональных телециндукция мезодермываскулярная спецификацияпривлечение перицитовэндотелиальные сетииммунофлуоресцентная характеристика
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.