В данном протоколе описывается модель инфаркта миокарда ex vivo на изолированном сердце мыши, перфузируемом кристаллоидным раствором. Этот подход позволяет исключить системные переменные, что дает исследователям возможность напрямую оценивать эффекты в сердце в отсутствие внешних факторов, которые могут повлиять на выживаемость кардиомиоцитов, а также тестировать локальные фармацевтические вмешательства.
Методическая статья
Ex Vivo модель инфаркта миокарда в сердце мыши при кристаллоидной перфузии
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Экспериментальный инфаркт миокарда (ИМ) обычно моделируют на животных путем временной окклюзии передней нисходящей (ПН) коронарной артерии или, на клеточном уровне, с помощью протоколов гипоксии-реоксигенации. В качестве альтернативной модели ишемии на уровне органа сердце с перфузией по Лангендорфу остается основным инструментом для исследования влияния физиологических нарушений и фармакологических воздействий на кардиопротекцию. Здесь мы представляем базовую методологию и основные правила, необходимые для создания модели региональной ишемии/реперфузии миокарда в изолированном сердце мыши. Вкратце: после кардиоплегической остановки ПН артерия была перевязана после короткого промывания ледяным PBS. Затем сердце устанавливали в аппарат Лангендорфа и перфузировали обогащенным питательными веществами оксигенированным буфером при 37°C под постоянным давлением перфузии 110 cmH₂O. Ишемия миокарда индуцировалась на 30, 45, 60, 90 и 120 мин с последующей 90-минутной реперфузией. Жизнеспособность кардиомиоцитов и размер инфаркта оценивали с помощью метода микроскопического окрашивания 2,3,5-трифенилтетразолиум хлоридом (TTC). Мы продемонстрировали, что модель ИМ ex vivo обеспечивает надежное воспроизведение повреждения миокарда, характеризующегося прогрессирующей потерей жизнеспособных кардиомиоцитов в области инфаркта по мере увеличения продолжительности ишемии. Кроме того, для четкого разграничения инфарктированного миокарда с помощью TTC требовалось не менее 30 мин реперфузии. Этот подход позволяет исключить системные переменные, что дает исследователям возможность напрямую оценивать эффекты на сердце в отсутствие внешних регуляторных влияний, таких как циркулирующие гуморальные факторы и инфильтрация иммунных клеток, которые могут искажать течение ИМ, а также тестировать локальные фармацевтические вмешательства. Таким образом, модель ИМ ex vivo представляет собой полезную платформу для изучения кардиопротекторных механизмов, действующих непосредственно на кардиомиоциты.
Введение
Инфаркт миокарда (ИМ) возникает при прекращении коронарного кровотока, что приводит к гибели тканей и тяжелым функциональным нарушениям. Хотя обычно ИМ изучают на целых организмах, этот термин может относиться к региональному ИМ, ограниченному определенными структурами сердца, или к лабораторным моделям изолированного сердца ex vivo (например, перфузии по Лангендорфу), которые используются для изучения инфарктов в отсутствие системного влияния1. Таким образом, сердце с перфузией по Лангендорфу служит надежной и общепринятой экспериментальной моделью для изучения ишемического повреждения миокарда на протяжении более чем 50 лет2.
Модель инфаркта миокарда (ИМ) ex vivo на изолированном сердце обладает рядом преимуществ, включая точный контроль условий эксперимента и возможность оценить прямое воздействие различных вмешательств, например фармакологических агентов, на миокард независимо от системных факторов, таких как циркулирующие гуморальные факторы, компоненты крови и нейрогуморальная регуляция3. За счет минимизации этих искажающих факторов модель ex vivo обеспечивает более предсказуемый и воспроизводимый подход по сравнению с моделями in vivo и, таким образом, способствует детальному изучению патологических процессов и молекулярных путей, вовлеченных в развитие ИМ4.
В изолированных сердцах ишемию миокарда можно индуцировать либо глобально, либо регионарно5. В модели глобального ИМ поток перфузата через весь коронарный кровоток полностью прерывается, тогда как в модели регионального ИМ путем лигирования временно перекрывается только передняя нисходящая ветвь левой коронарной артерии (LAD), в результате чего ишемическое повреждение ограничивается миокардом дистальнее места лигирования. Хотя модель глобального ИМ технически проста в исполнении, она имеет ряд ограничений, которые затрудняют ее применение в исследованиях кардиопротекции6. Одним из основных ограничений является то, что продолжительность ишемии ограничена пределом выживаемости всего сердца, что затрудняет индуцирование длительной ишемии с вероятностью трансмурального инфаркта, сопоставимой с ситуациями in vivo7. Кроме того, хотя модели ex vivo обычно обеспечивают отличную воспроизводимость при тщательном контроле продолжительности ишемии и реперфузии, эти протоколы значительно различаются в разных лабораториях. Такая вариабельность подчеркивает необходимость более строгой стандартизации и характеристики изолированного сердца мыши, особенно с учетом того, что многие важные методологические детали остаются недостаточно описанными в литературе8.
С другой стороны, региональная модель инфаркта миокарда (ИМ) технически сложнее в реализации. В данной работе мы представляем несколько модификаций и практических стратегий для оптимизации индукции надежного ИМ ex vivo в изолированном сердце мыши, что особенно важно для оценки фармакологических вмешательств, направленных на кардиопротекцию9,10. Таким образом, данный модифицированный протокол ИМ ex vivo с использованием перфузии сердца мыши по Лангендорфу представляет собой эффективную платформу для прямой оценки выживаемости миокарда после терапевтического воздействия.
Протокол
Описанная здесь модель изолированной перфузии сердца представляет собой острый эксперимент без последующего выживания животного и была одобрена местными органами надзора (O1019/25, LANUV земли Северный Рейн-Вестфалия, Германия). Все процедуры проводились в соответствии с рекомендациями ARRIVE и руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных. Оборудование и химические вещества, необходимые для проведения экспериментов, перечислены в Таблице материалов.
1. Настройка системы ретроградной перфузии Лангендорфа для изолированного сердца мыши
ПРИМЕЧАНИЕ: Для подачи оксигенированного кристаллоидного перфузата (буфер Кребса-Хензелея, KHB) к изолированному сердцу мыши при постоянном давлении 110 cmH2O была разработана нерециркуляционная система, работающая за счет гравитации (Рисунок 1A).
- Промойте стеклянные детали аппарата Лангендорфа 0,1 M/L HCl и 100% этанолом, после чего ополосните дистиллированной водой перед сборкой системы.
- Взвесьте все химические реагенты, необходимые для приготовления 2 L модифицированного KHB, в соответствии со следующими конечными концентрациями (mM): 116,02 NaCl, 4,63 KCl, 1,10 MgSO4·7H2O, 1,21 KH2PO4, 2,52 CaCl2·2H2O, 24,88 NaHCO3, 8,30 D-глюкозы, 2,0 пирувата натрия.
- Растворите все реагенты, кроме CaCl₂, в дважды дистиллированной воде в колбе объемом 2 L при непрерывном барботировании Карбогеном (95% O₂/5% CO₂) в течение не менее 10 мин для установления pH на уровне 7,4.
- Последовательно добавьте в раствор CaCl₂, чтобы избежать выпадения осадка.
- Продолжайте барботировать раствор Карбогеном еще в течение 10 мин.
- Отфильтруйте раствор KHB под вакуумом через мембранный фильтр 0,2 µm для удаления мелких частиц, которые могут закупорить микроциркуляторное русло коронарных сосудов.
- Перелейте отфильтрованный раствор KHB в стеклянный резервуар объемом 2 L, помещенный в предварительно нагретую водяную баню с температурой 37 °C.
- Подсоедините резервуар с KHB к стеклянной колонке давления, чтобы оксигенированный KHB непрерывно заполнял колонку за счет давления, создаваемого газом Карбогеном в резервуаре.
- Убедитесь, что в системе выводных трубок нет пузырьков воздуха.
- Продолжайте уравновешивание раствора KHB Карбогеном еще в течение 30 мин до начала эксперимента.
2. Изоляция и каннюляция сердца
ПРИМЕЧАНИЕ: В данных экспериментах использовались самцы мышей линии C57BL/6J массой 20–25 g. Все экспериментальные процедуры должны быть надлежащим образом задокументированы в соответствии с местными правилами, включая обоснование, дату и метод эвтаназии.
- Осторожно поместите мышь в индукционную камеру с 5% изофлураном (v/v) для индукции анестезии.
- Подтвердите глубину анестезии полным отсутствием реакции на сильное сжатие пальца лапы, после чего перенесите животное на операционный стол. Немедленно проведите эвтаназию мыши путем вывиха шейных позвонков, что подтверждается отсутствием дыхания и потерей мышечного тонуса в нижней части тела.
- Произведите двусторонний разрез грудной клетки в направлении к грудине для полного обнажения сердца и восходящей аорты.
- Захватите экстракардиальные ткани пинцетом и вырежьте сердце.
- Поместите сердце в небольшой предварительно охлажденный стакан, содержащий 50 mL ледяного раствора KHB, минимум на 30 s для индукции кардиоплегической остановки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку сердечная деятельность очень чувствительна к температуре, полное прекращение ее работы достигается путем погружения в ледяной раствор KHB. - Перенесите сердце на предварительно охлажденную, увлажненную раствором KHB хлопковую салфетку, помещенную в металлическую чашку, где установлена система канюль, подключенная к трехходовому крану. (Рисунок 1B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Перфузионная система не должна содержать пузырьков воздуха. - Заранее завяжите свободный полуквадратный узел шелковой нитью 5-0 на дистальном конце канюли.
- Осторожно иссеките тимус, соединительную ткань и остатки экстракардиальных тканей (включая легкие и пищевод), чтобы обнажить и подготовить корень аорты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что длина восходящей аорты достаточна для успешной канюляции. - Наденьте сердце на канюлю и зафиксируйте его предварительно наложенным швом.
- Промойте сердце 5 mL ледяного PBS для вымывания остатков крови из коронарного русла.
3 Ишемия и реперфузия миокарда ex vivo
ПРИМЕЧАНИЕ: Глобальную ишемию миокарда индуцировали путем простого прекращения перфузии сердца, тогда как региональную ишемию миокарда создавали путем временного лигирования LAD под стереомикроскопом.
- Расположите ПМЖВ (LAD) в центре поля зрения, осторожно поворачивая сердце путем регулировки подстилающей хлопковой подушечки. При перфузии PBS ПМЖВ становится прозрачной и четко отличимой от окружающего миокарда.
- Проведите коническую иглу с полипропиленовой нитью 8–0 под ПМЖВ, на 1 mm ниже нижнего края левого предсердия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ПМЖВ находится посередине между двумя точками прокола, чтобы избежать повреждения сосудов при лигировании. - Поместите кусочек мягкого пледжета поверх ПМЖВ.
- Плотно затяните нить, чтобы прекратить перфузию дистальнее места лигирования.
- Перенесите канюлированное сердце в аппарат Лангендорфа и начните ретроградную перфузию.
- Поместите сердце в органный бань с водяной рубашкой для поддержания постоянной температуры (37 °C) на протяжении всего периода эксперимента.
- Контролируйте пиковый и стационарный коронарный кровоток (Таблица 1).
- В установленные моменты ишемии миокарда (см. раздел «Результаты») прекратите перфузию и извлеките канюлированное сердце из аппарата для перфузии.
- Немедленно погрузите сердце в ледяной раствор KHB (4 °C) для полного прекращения сокращений сердца.
- Положите сердце обратно на хлопковую подушечку в предварительно охлажденную металлическую чашку и снимите лигатуру с ПМЖВ.
- Для исследований фармакологического вмешательства на данном этапе введите 5 µL интерлейкина-6 (IL-6, 0.1 mg/mL) в инфарктную переднюю стенку с помощью инсулинового шприца 30 G.
- Снова установите канюлированное сердце в аппарат для перфузии и возобновите перфузию сердца (реперфузию).
4. Оценка повреждения миокарда и выживаемости
ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание 2,3,5-трифенилтетразолий хлоридом (TTC) окрашивает жизнеспособный миокард в темно-красный цвет, тогда как инфарктная/некротическая ткань после фиксации раствором Zamboni выглядит бежевой.
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: ТТФ обычно считается опасным веществом и требует осторожного обращения, так как может вызвать легкое раздражение кожи, серьезное раздражение глаз и вредно при вдыхании. Утилизируйте отходы и остатки в соответствии с требованиями местных органов власти.
- Прекратите перфузию через 90 мин после реперфузии и немедленно погрузите сердце в ледяной буфер KHB для остановки сердечных сокращений.
- Подсоедините канюлю к шприцу объемом 3 мл, предварительно заполненному окрашивающим раствором ТТФ (1% ТТФ, растворенный в PBS). посредством трехходовой кран.
- Введите 1 мл раствора ТТФ в сердце; повторите процедуру трижды, чтобы ввести общий объем 3 мл в течение 15 мин.
- Накройте сердце влажной салфеткой, чтобы предотвратить высыхание поверхности.
- Поместите сердце в центрифужную пробирку, содержащую 3 мл раствора ТТФ при 4 °C в течение ночи
- Приготовление тканевого блока с использованием состава для оптимального понижения температуры (OCT).
ПРИМЕЧАНИЕ: Блок ткани можно хранить при температуре −80 °C в течение нескольких месяцев до проведения дальнейшего анализа. - Закрепите блок ткани на предметном столике криостата с помощью среды OCT.
- Выполните последовательное криосечение сердца с толщиной среза 50 µm и собирайте каждые 10th срез; обычно получают около 8 срезов ткани на одно сердце.
- Разместите все 8 срезов на одном предметном стекле и высушите их с помощью фена в течение 2–3 минут.
- Поместите срезы в камеру для окрашивания с раствором Zamboni (фиксатором, содержащим 2% параформальдегида и 0,4% пикриновой кислоты, масс./об.) на ночь при 4 °C.
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Фиксатор Zamboni может вызвать аллергическую кожную реакцию; предполагается, что он может вызывать генетические дефекты и канцерогенез. Утилизируйте отходы и остатки в соответствии с правилами местных органов власти. - Промойте срезы 3 раза в PBS и нанесите на них среду для заключения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы сердца, окрашенные ТТФ, могут храниться при комнатной температуре в течение нескольких месяцев. - Получите изображения сердца с помощью светового микроскопа с объективом 1,25x, используя программное обеспечение CellSens.
- Для количественного определения размера инфаркта импортируйте файлы изображений в программу ImageJ.
- В меню ImageJ выберите Изображение -> Отрегулируйте -> Цветовой порог для открытия окна Color Threshold (Рисунок 2B).
- Выберите небольшой исследуемый участок (ROI) в срезе сердца, используя темно-красный жизнеспособный миокард и бежевую инфарктную/некротическую ткань в качестве цветовых эталонов.
- Нажмите на Образец в Цветовой порог отрегулируйте окно и точно настройте диапазон насыщенности до тех пор, пока выбранная область точно не совпадет с целевой цветовой зоной.
- Нажмите на Отбор для определения области, соответствующей выбранному цвету.
- В меню ImageJ выберите Анализ -> ИзмеритьПлощадь выбранной области в пикселях будет отображена в окне результатов.
- Экспортируйте данные измерений в таблицу Excel для расчета планиметрического размера инфаркта.
- Для количественной оценки жизнеспособного миокарда в области инфаркта определите область интереса (ROI), преимущественно на пораженной передней стенке желудочка, в которую вводили IL-6.
- Откройте Менеджер областей интереса (ROI Manager) в меню ImageJ и нажмите на Добавьте для сохранения выбранной области интереса (ROI) в список областей интереса (Рисунок 2C).
- Используйте функции «Sample» и «Selection», как описано выше, чтобы выделить жизнеспособный миокард (темно-красный цвет).
- Добавьте выбранную жизнеспособную область в список «ROI Manager», затем выберите И для получения области перекрытия между ROI (областью интереса) и жизнеспособным миокардом.
- Измерьте площадь жизнеспособного миокарда и рассчитайте уровень выживаемости кардиомиоцитов в пределах выбранной области интереса (ROI).
ПРИМЕЧАНИЕ: Методические подробности окрашивания ТТХ и количественного определения размера инфаркта были описаны ранее11.
Результаты
На платформе для моделирования инфаркта миокарда (ИМ) ex vivo были оценены два протокола ишемии в изолированном сердце мыши. Глобальная ишемия, широко используемая в исследованиях ИМ ex vivo, привела к гетерогенному ишемическому повреждению по всему сердцу. С помощью надежного метода микроскопического детектирования на основе TTC с высоким разрешением12 было показано, что миокард предсердий и апикальная область были относительно устойчивы к ишемии и оставались жизнеспособными после 45 мин глобальной ишемии с полным прекращением кровотока (Рисунок 2A, верхняя панель). Напротив, региональный ИМ вызвал локализованное ишемическое повреждение миокарда дистальнее места лигирования передней нисходящей артерии (LAD). В этих условиях участки субэпикардиального миокарда оставались TTC-положительными, что указывало на сохранение жизнеспособной ткани (Рисунок 2A, нижняя панель). Эти результаты демонстрируют различные паттерны выживаемости миокарда при использовании двух разных протоколов ишемии.
Минимальная продолжительность ишемии и реперфузии, необходимая для надежного и воспроизводимого индуцирования инфаркта миокарда, была дополнительно изучена на изолированном сердце мыши. Повреждение миокарда прогрессивно увеличивалось по мере увеличения продолжительности ишемии с 30 мин до 120 мин (Рисунок 3A). Примечательно, что размер инфаркта более чем в два раза увеличился в интервале между 30 мин (n = 3) и 45 мин (n = 5) ишемии и, по всей видимости, достиг плато при увеличении продолжительности ишемии до 60 мин (n = 5), 90 мин (n = 4) и 120 мин (n = 3) (Рисунок 3B). Эти результаты указывают на то, что жизнеспособность миокарда крайне чувствительна к продолжительности ишемии свыше 30 мин. По сравнению с моделью ИМ in vivo (ivMI, n = 5), модель ИМ ex vivo (evMI, n = 8) продемонстрировала почти идентичные размеры инфаркта при сопоставимой продолжительности ишемии и реперфузии (36.88% ± 3.91% vs. 37.8% ± 2.17%, p = 0.27), что позволяет предположить, что повреждение миокарда не подвергалось существенному влиянию кристаллоидной перфузии. Тем не менее, сердца evMI имели более толстые стенки желудочков и суженный просвет желудочков, что, вероятно, было связано с отеком миокарда, вызванным кристаллоидной перфузией (Рисунок 3C).
Используя преимущества относительно контролируемой среды, свободной от внесердечных влияний, были оценены кардиопротекторные эффекты внутримиокардиального введения IL-6. В контрольных сердцах, обработанных PBS, разрозненные, но измеримые жизнеспособные кардиомиоциты (жизнеспособные CM; темно-красные) оставались обнаруживаемыми в области инфаркта/некроза (бежевый цвет) даже после 45 мин ишемии (Рисунок 4; 1,05% ± 0,44%, SEM, n = 4). Примечательно, что внутримиокардиальное введение IL-6 (i.m.; стрелки) значительно увеличило количество жизнеспособных CM, которые преимущественно локализовались вокруг места инъекции в исследуемой области (ROI; 4,08% ± 0,99%, SEM, n = 6; p = 0,005, t-критерий Стьюдента). Эти результаты позволяют предположить, что IL-6 может повышать выживаемость кардиомиоцитов после ишемического повреждения.
Наконец, текущая модель инфаркта миокарда ex vivo имеет несколько потенциальных недостатков, которые могут повлиять на воспроизводимость результатов экспериментов. Как показано на рисунке 5, соскальзывание лигатуры может привести к неадекватной окклюзии LAD и обширному выживанию миокарда (4/168), в то время как при повреждении ветвей LAD может возникнуть неполная реперфузия (12/168). Кроме того, воздушная эмболия во время канюлирования аорты также может вызвать повреждение миокарда (стрелки, 7/168), что затрудняет разграничение ишемического и эмболический повреждений при количественном анализе. Наконец, при избыточной перфузии сердца может произойти недостаточное окрашивание TTC (11/168), что существенно затрудняет определение зоны инфаркта.
Рисунок 1Схема экспериментальной установки. Система Лангендорфа с постоянным давлением, работающая по принципу гравитационного потока без рециркуляции, была разработана для подачи обогащенного питательными веществами оксигенированного буфера Кребса–Гензелейта (KHB) при постоянном гидростатическом давлении 110 см вод. ст.₂O. KHB предварительно нагревали до 37 °C в резервуаре и подается в колонку под давлением с водяной рубашкой, где поддерживается постоянное гидростатическое давление 110 см вод. ст.2Значение O поддерживалось посредством регулятор давления. Перфузируемое сердце помещали в ванну для органов с водяной рубашкой и регулируемой высотой для поддержания постоянной температуры 37 °C на протяжении всего периода эксперимента (A). Инфаркт миокарда индуцировали путем временного лигирования передней нисходящей (ПНС) коронарной артерии после кардиоплегической остановки сердца на ватном тампоне в предварительно охлажденном металлическом лотке (B). Процедуру проводили под стереомикроскопом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Сравнение регионального и глобального инфаркта миокарда (ИМ) и определение размера инфаркта. Глобальный ИМ вызывает ишемическое повреждение во всем сердце, о чем свидетельствует желтое окрашивание на микроскопических изображениях с TTC. Миокард предсердий и апикальная область оказались более устойчивыми к ишемии и оставались жизнеспособными после 45 min глобальной ишемии с отсутствием кровотока (верхняя панель на A). Региональный ИМ вызывает ишемическое повреждение миокарда дистальнее места лигирования ПМЖА (LAD). В этом случае участки субэпикардиального миокарда окрашены в красный цвет, что указывает на сохранение жизнеспособной ткани (нижняя панель на A). Размер инфаркта количественно оценивали с помощью ImageJ, при этом область инфаркта/некроза и жизнеспособный миокард разграничивали по их различному цвету окрашивания (B). Выживаемость кардиомиоцитов в пределах области интереса (ROI) рассчитывали путем определения процента темно-красного окрашивания в выбранной ROI (C). Масштабная линейка: 1 mm. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3Влияние протяженности ишемии на размер инфаркта. Повреждение миокарда прогрессивно усугублялось по мере увеличения продолжительности ишемии с 30 до 120 мин (A). Размер инфаркта увеличился более чем в два раза при увеличении длительности ишемии с 30 мин (n = 3) до 45 мин (n = 5) и, по всей видимости, достиг плато при дальнейшем продлении ишемии до 60 мин (n = 5), 90 мин (n = 4) и 120 мин (n = 3) (B). По сравнению с in vivo модель ИМ (ivMI, n = 5), ex vivo MI (evMI, n = 8) приводил к почти идентичным размерам инфаркта при сопоставимой продолжительности ишемии (36,88% ± 3.91% против. 37.8% ± 2.17%, p = 0,27, t-критерий Стьюдента t-Тест). Сердца группы evMI характеризовались более толстой стенкой желудочка и суженным просветом желудочка, что, вероятно, было обусловлено отеком миокарда, связанным с кристаллоидной перфузией (С). Планки погрешностей соответствуют стандартному отклонению среднего (SDM). Масштабные отрезки: 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4ИЛ-6 повышал выживаемость кардиомиоцитов после ишемического повреждения. Внутримиокардиальное (в.м.) введение IL-6 в модели evMI привело к появлению измеримого количества жизнеспособных кардиомиоцитов (жизнеспособные КМ; темно-красный цвет) в области инфаркта/некроза (бежевый цвет), преимущественно локализованных вокруг места инъекции IL-6 (стрелки, левая панель). Количественный анализ жизнеспособных КМ в области интереса (ROI, обозначена пунктирными линиями) показал, что инъекция PBS привела к сохранению лишь небольшой доли жизнеспособного миокарда (1,05% ± 0,44%, SEM, n = 4), тогда как инъекция IL-6 значительно увеличила количество жизнеспособных кардиомиоцитов в пределах ROI (4,08% ± 0,99%, SEM, n = 6; p = 0,005, критерий Стьюдента т-тест). Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение среднего (SDM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Неудовлетворительные или неудачные результаты, вызванные техническими ошибками. Как показано на примере повреждения миокарда в модели ИМ ex vivo (слева), при типичном окрашивании TTC жизнеспособный и некротизированный миокард обычно четко различаются. Однако ряд технических ошибок может привести к неудовлетворительным или неинтерпретируемым результатам. Недостаточное лигирование LAD из-за соскальзывания шва может привести к обширному выживанию миокарда, несмотря на длительную ишемию. Неполная реперфузия может возникнуть, если ветви LAD будут повреждены во время лигирования и впоследствии будут плохо перфузироваться, что создает картину, напоминающую клинически наблюдаемый феномен «no-reflow» (отсутствие восстановления кровотока). Такие области могут иметь розоватый оттенок (стрелки). Микрососудистая эмболия пузырьками воздуха, попавшими в коронарный кровоток во время процедуры канюляции, также может вызвать повреждение миокарда (стрелки), что затрудняет разграничение ишемического и эмболического повреждений для количественной оценки. Наконец, недостаточное окрашивание TTC может произойти при чрезмерной перфузии сердца, что может вызвать повреждение миокарда, не связанное с ишемией. Масштабные отрезки: 1 mm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| F-пик (n = 19) | F-steady (n = 19) | пик РЧ (n = 19) | RF-stable (n = 19) | |
| Средние значения (мл/мин) | 2.54 | 0.78 | 2 | 0.99 |
| стандартное отклонение | 0.59 | 0.29 | 0.56 | 0.53 |
Таблица 1: Коронарный кровоток при максимальном (F-peak) и стационарном (F-steady) уровнях во время ишемии и реперфузии (RF-peak и RF-steady).
Обсуждение
Современная модель инфаркта миокарда ex vivo основана преимущественно на сложных системах перфузии сердца по Лангендорфу2. Распространенной ошибкой при подготовке является попадание пузырьков воздуха в коронарный кровоток, что может вызвать эмболические повреждения и исказить оценку ишемического поражения. Чтобы предотвратить эту проблему, необходимо тщательно проверять систему перфузии непосредственно перед каждым экспериментом. Если в системе трубок оказываются мелкие пузырьки воздуха, для их вытеснения обратно в колонку давления может помочь ретроградное промывание раствором KHB.
Ключевым этапом данного протокола является лигирование передней нисходящей артерии (ПНА). Поэтому первоочередное значение имеет точная визуальная идентификация ПНА. В большинстве случаев коронарные сосуды становятся полупрозрачными после промывания сердца ледяным раствором PBS, что позволяет четко отличить ПНА от окружающего миокарда. Кроме того, не менее важной является правильная и искусная техника лигирования, так как чрезмерное натяжение полипропиленовой нити 8-0 может привести к прорезыванию стенки ПНА, что сделает последующую реперфузию невозможной. Чтобы минимизировать этот риск, между нитью и сосудом следует поместить мягкую прокладку (пледжет) подходящего размера для распределения силы затягивания и защиты коронарной артерии от механического повреждения. Тем не менее, незначительное повреждение миокарда, вызванное лигированием, неизбежно, но обычно оно не нарушает коронарную перфузию и не влияет на результат эксперимента. Наконец, поскольку повреждение миокарда крайне чувствительно к температуре13, критически важно поддерживать постоянную температуру на протяжении всего эксперимента. В частности, в условиях перфузии при постоянном давлении теплопотери могут происходить между перфузионной колонкой и сердцем и динамически меняться в зависимости от скорости коронарного кровотока14. Таким образом, колебания температуры могут привести к изменениям температуры миокарда. В этих условиях крайне желательно использовать органный бань с водяной рубашкой для поддержания стабильных тепловых условий (Рисунок 1A).
После преодоления этих технических трудностей модель ИМ ex vivo представляет собой надежную и воспроизводимую платформу для индуцирования повреждения миокарда в изолированном сердце мыши (Рисунок 3A). Таким образом, она является ценной экспериментальной системой для исследования выживаемости миокарда после ИМ, оценки эффективности локально вводимых терапевтических средств и проведения визуализации высокого разрешения без помех, вызванных дыхательными или сердечными сокращениями. Хотя протокол глобального ИМ технически прост и широко использовался в предыдущих исследованиях4, его основным ограничением является то, что длительность глобальной ишемии обычно ограничена 45 мин3. Следовательно, в отличие от модели регионального ИМ, он редко приводит к трансмуральному инфаркту (Рисунок 2).
Одной из уникальных особенностей модели ИМ ex vivo является отсутствие системных влияний, включая нейрорегуляцию и циркулирующие компоненты крови, что позволяет исследователям оценивать прямые локальные эффекты терапевтических воздействий на миокард8. Это особенно актуально для таких цитокинов, как IL-6, и нижележащего сигнального пути PI3K/AKT, которые проявляют кардиопротекторные свойства в изолированных кардиомиоцитах15. Однако in vivo эффекты IL-6 на сердце часто оказываются противоречивыми или даже взаимоисключающими, поскольку IL-6 одновременно активирует иммунные клетки и стимулирует воспалительные реакции, которые могут нивелировать его прямое кардиопротекторное действие16. В соответствии с этой концепцией, наша модель ex vivo убедительно продемонстрировала, что локальное интрамиокардиальное введение IL-6 значительно сохраняет жизнеспособность миокарда после ишемического повреждения17,18, что подтверждает прямой кардиопротекторный эффект IL-6 на кардиомиоциты (Рисунок 4).
Мы признаем наличие нескольких ограничений данной модели инфаркта миокарда (ИМ) ex vivo. В рамках данной экспериментальной установки сократительная функция сердца в настоящем протоколе не оценивалась.3Это было обусловлено тем, что основной целью являлась характеристика выживаемости миокарда в модели регионального инфаркта миокарда, а также тем, что сократительная дисфункция отражает функциональное нарушение после ишемического повреждения, но не обязательно указывает на гибель кардиомиоцитов.8Кроме того, ex vivo Модель инфаркта миокарда (ИМ) по определению исключает циркулирующие компоненты крови, иммунные клетки и нейрогуморальные влияния, которые могут вносить существенный вклад в прогрессирование ИМ и ремоделирование сердца. in vivoХотя такое снижение системной сложности является основным преимуществом данной ex vivo модель ИМ, что также ограничивает ее широкое применение для имитации воспалительных, сосудистых, нейрогенных и эндокринных реакций, которые могут возникать in vivoНаконец, было обнаружено, что кристаллоидная перфузия связана с отеком миокарда, о чем свидетельствуют увеличение толщины стенок желудочков и уменьшение просвета желудочков по сравнению с in vivo Сердца с инфарктом миокарда (ИМ). Известно, что возникновение отека может привести к изменению архитектуры миокарда, диффузии в тканях и, потенциально, жизнеспособности клеток. Следовательно, данную модель следует рассматривать как контролируемую платформу для исследования повреждения миокарда и специфических механизмов кардиомиоцитов.
Тем не менее, описанная здесь модель инфаркта миокарда (ИМ) ex vivo представляет собой простую и экономически эффективную платформу для оценки выживаемости миокарда в отсутствие внешних регуляторных воздействий. Учитывая расширение использования генетически модифицированных моделей мышей, данный подход может быть особенно ценным для изучения кардиопротекторных механизмов с применением передовых методов визуализации, электрофизиологической регистрации и молекулярного анализа. Кроме того, модель может быть адаптирована для систематического тестирования локальных фармакологических или генно-терапевтических вмешательств, а также для детального изучения механизмов, специфичных для кардиомиоцитов, без влияния системных побочных факторов. Таким образом, модель ИМ ex vivo служит дополнительной экспериментальной платформой, облегчающей идентификацию и механистическое исследование путей кардиопротекции.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Авторы заявляют, что при подготовке рукописи, анализе данных, создании рисунков или валидации данной работы не использовались инструменты искусственного интеллекта (ИИ) или технологии с применением генеративного ИИ.
Благодарности
Данная работа была поддержана общим проектом Общества гериатрии Цзянсу (JGS2026MS019 для WO), Фондом социального развития Департамента науки и технологий города Чжэньцзян (гранты № SH2023023 для H.Z. и SH2023057 для X.L.), программой FoKo (грант № 23/2013 для ZD) и Институтом сердечно-сосудистых исследований Дюссельдорфа (CARID).
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Хлорид 2,3,5-трифенилтетразолия | Milipore | 1.08380.0100 | Химические вещества |
| Аортальная канюля | BD | 305895 (20 G) | Ретроградная перфузия |
| Aquamount | BDH | 362262H | Криосекционирование |
| Весы | Ohaus | - | Взвешивание химических веществ |
| Большой пинцет | AESCULAP | - | Хирургические инструменты |
| Анализаторы газов крови | Radiometer | ABL90 FLEX PLUS | Газоанализатор |
| Дигидрат хлорида кальция | Fluka | 21097 | Химические вещества |
| Карбоген | Linde | 4040152 | Аппарат Лангендорфа |
| CellSens | Olympus | Version 3.1.1 | Программное обеспечение для визуализации |
| Ватные диски | BEESana | PZN-1330900 | Хирургические инструменты |
| Покровные стекла | Epredia | BB02400500A113MN20 | Криосекционирование |
| Криостат | Leica | M850 | Криосекционирование |
| D(+)-Глюкоза безводная | Merck | 8337.1000 | Химические вещества |
| Двойная дистиллированная вода | Milipore | - | Растворение химических веществ |
| Этанол (100%) | Merck | 64-17-5 | Очистка трубок |
| Этанол (70%) | VWR | UN1170 | Очистка трубок |
| Фильтрующая мембрана (0.2 µm) | Thermo Scientific | 8-000-230511 | Аппарат Лангендорфа |
| Расходомер | Transonic | T4S410 | Аппарат Лангендорфа |
| Стеклянные предметные стекла | Engelbrecht | 11102 | Криосекционирование |
| Стеклянная водяная колонка | Самодельная | - | Аппарат Лангендорфа |
| Соляная кислота | Roth | P074.1 | Химические вещества |
| ImageJ | NIH | version 1.54g | Программное обеспечение |
| Интерлейкин-6 | Biolegend | 570804 | Химические вещества |
| Изофлуран | Piramal | 14150097146754 | Химические вещества |
| Световой микроскоп | Olympus | BX61 | Визуализация |
| Гептагидрат сульфата магния | Merck | 5886.1000 | Химические вещества |
| Медицинский датчик потока | Transonic | 3PXN | Аппарат Лангендорфа |
| Металлическая чаша | Самодельная | - | Хирургические инструменты |
| Шприц Micro-Fine | BD | 30G / 0.3 mL | Аппарат Лангендорфа |
| Мышь | Janvier | C57BL/6J | Животные |
| Объектив (x 1.25) | Olympus | PlanApo 1.25X/0.04 | Визуализация |
| Соединение OCT | Sakura | 4583 | Химические вещества |
| Чашка Петри | Thermo Scientific | 172931 | Аппарат Лангендорфа |
| Фосфатно-солевой буфер | Roth | 9143.1 | Химические вещества |
| Хлорид калия | Merck | 4936.1000 | Химические вещества |
| Дигидрофосфат калия | Merck | 4873.1000 | Химические вещества |
| Шелковая нить для швов | F.S.T | 18020-60 | Хирургические инструменты |
| Хлорид натрия | Sigmaaldrich | SZBD0810V | Химические вещества |
| Гидрокарбонат натрия | Roth | 6885.2 | Химические вещества |
| Пируват натрия | Sigmaaldrich | 113-24-6 | Химические вещества |
| Мягкий тампон | Deknatel | L-705 | Хирургические инструменты |
| Стальной пинцет (8m/m) | F.S.T | 11052-10 | Хирургические инструменты |
| Стальные ножницы | AESCULAP | BC702R | Хирургические инструменты |
| Стальные ножницы | AESCULAP | BC257R | Хирургические инструменты |
| Стереомикроскоп | Leica | MZ6 | Хирургические инструменты |
| Шовный материал (8-0) | Ethicon | TG-108 | Хирургические инструменты |
| Шприц (3 mL) | B. Braun | 4617100V | Ретроградная перфузия |
| Трехходовой кран | B. Braun | 16494C | Ретроградная перфузия |
| Трубки | Tygon | T3304-23 | Аппарат Лангендорфа |
| Водяная баня | HAAKE | DC1/B3 | Аппарат Лангендорфа |
| Раствор Замбони | Morphisto | 12773.0050 | Химические вещества |
Ссылки
- Pendexter CA, et al. Modified Langendorff perfusion method for extended perfusion times of rodent cardiac grafts. J Vis Exp. 2024;(208):66815.
- Bell RM, Mocanu MM, Yellon DM. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. J Mol Cell Cardiol. 2011;50(6):940-950.
- Rossello X, Hall AR, Bell RM, Yellon DM. Characterization of the Langendorff perfused isolated mouse heart model of global ischemia-reperfusion injury: impact of ischemia and reperfusion length on infarct size and LDH release. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2016;21(3):286-295.
- Yang T, et al. Isolated perfused hearts for cardiovascular research: an old dog with new tricks. J Cardiovasc Transl Res. 2024;17(5):1207-1217.
- Martin TP, et al. Preclinical models of myocardial infarction: from mechanism to translation. Br J Pharmacol. 2022;179(5):770-791.
- Hurt CM, et al. Transient receptor potential vanilloid 1 regulates mitochondrial membrane potential and myocardial reperfusion injury. J Am Heart Assoc. 2016;5(9):3774.
- Herr DJ, Aune SE, Menick DR. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in Langendorff-perfused rat hearts. J Vis Exp. 2015;(101):52908.
- Lindsey ML, et al. Guidelines for experimental models of myocardial ischemia and infarction. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2018;314(4):H812-H838.
- Zhu H, et al. Sfrp1 as a pivotal paracrine factor in the trained pericardial stem cells that foster reparative activity. Stem Cells Transl Med. 2023;12(12):137-150.
- Ouyang W, et al. An immunostaining-based approach for assessing myocardial viability in the infarcted mouse hearts. Front Cardiovasc Med. 2025;12:1598314.
- Ding Z, Zhang H, Bouvain P, Ding Z, Flögel U. A microscopic 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride assay for accurate and reliable analysis of myocardial injury. J Vis Exp. 2025;(225):68596.
- Ding Z, et al. A refined TTC assay precisely detects cardiac injury and cellular viability in the infarcted mouse heart. Sci Rep. 2024;14(1):25214.
- El Farissi M, et al. Hypothermia for reduction of myocardial reperfusion injury in acute myocardial infarction: closing the translational gap. Circ Cardiovasc Interv. 2021;14(8):010326.
- Ding Z, Gödecke A, Schrader J. Contribution of cytochrome P450 metabolites to bradykinin-induced vasodilation in endothelial NO synthase deficient mouse hearts. Br J Pharmacol. 2002;135(3):631-638.
- Smart N, et al. IL-6 induces PI 3-kinase and nitric oxide-dependent protection and preserves mitochondrial function in cardiomyocytes. Cardiovasc Res. 2006;69(1):164-177.
- Broch K, et al. Randomized trial of interleukin-6 receptor inhibition in patients with acute ST-segment elevation myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 2021;77(15):1845-1855.
- Fontes JA, Rose NR, Čiháková D. The varying faces of IL-6: from cardiac protection to cardiac failure. Cytokine. 2015;74(1):62-68.
- Preda A, et al. IL-6 in the spotlight: from cardiovascular pathophysiology to therapy. Eur J Clin Invest. 2026;56(1):e70161.
Перепечатки и разрешения
Эта статья была опубликована
Видео скоро будет доступно