Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

MODS метод диагностики туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью и туберкулеза

18.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/845

⸱

11 августа 2008 г.

 ,  ,  , 
1The Warren Alpert Medical School of Brown University, 2Laboratorio de Investigacion de Enfermedades Infecciosas, Universidad Peruana Cayetano Heredia, 3Department of International Health, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, 4Wellcome Trust Centre for Clinical Tropical Medicine, Imperial College London

В этой статье

Краткое содержание

Микроскопического наблюдения восприимчивости к лекарствам (MODS) анализа является низкая стоимость, высокие технологии инструмент для высокопроизводительных выявления туберкулеза (ТБ) и множественной лекарственной устойчивостью туберкулеза (MDRTB). Это видео описывает MODS жидких питательных сред методом.

Аннотация

Пациенты с активным туберкулезом легких (ТБ) заразить 10-15 других лиц в год, что делает диагностики активного туберкулеза важны как для лечения пациента и предотвращение новых случаев инфицирования. Кроме того, появление множественной лекарственной устойчивостью (MDRTB) означает, что для обнаружения лекарственной устойчивости является необходимым для предотвращения распространения лекарственно-устойчивых штаммов. Микроскопического наблюдения восприимчивости к лекарствам (MODS) анализа является низкая стоимость, высокие технологии инструмент для высокопроизводительных выявление туберкулеза и MDRTB. Анализ MODS основана на трех принципах: 1) микобактерии туберкулеза (МТБ) растет быстрее, в жидких средах, чем на твердой среде 2) микроскопического роста MTB могут быть обнаружены ранее в жидких средах, не дожидаясь появления макроскопических колоний на твердых средах, а также что рост характерно MTB, что позволяет ему следует отличать от атипичных микобактерий или грибкового или бактериального загрязнения 3) препараты изониазид и рифампицин могут быть включены в анализ MODS, чтобы обеспечить одновременное прямое обнаружение MDRTB, что исключает необходимость в субкультуру для выполнения косвенный тест восприимчивость препарата. Конкурирующие текущей диагностики сдерживается низкой чувствительности посредством исследования мокроты, длительные задержки, пока диагноз с твердой питательной среды, непомерно высокой стоимостью с существующими жидких питательных средах методами и нужно сделать субкультуру для косвенного исследования чувствительности для обнаружения наркотиков MDRTB. В отличие от неимущественных MODS метод обладает высокой чувствительностью к туберкулезу и MDRTB, является относительно быстрое культуры метод обеспечивает одновременное тестирование на чувствительность препарат для MDRTB, и доступна с ограниченными ресурсами чуть менее $ 3 для проверки на туберкулез и MDRTB.

Протокол

  1. Подготовка исходных растворов
    1. Фосфат буферный запас
      1. Mix 950ml раствора натрия двузамещенный (9.47g натрия фосфат двузамещенный растворяется в 1000 мл дистиллированной воды) с 950ml калия фосфат однозамещенный решение (9.07g калия фосфат однозамещенный растворяется в 1000 мл дистиллированной воды) и перемешать; удержать 50мл каждого решения для настройки рН при необходимости
      2. Отрегулируйте рН до 6,8 ± 0,2: добавить натрия фосфат двузамещенный решение повысить рН, добавить фосфат калия однозамещенный решение снизить рН
      3. Автоклаве при температуре 121-124 ° С в течение 15 минут для стерилизации
      4. Пластина 100 мкл аликвоту решение фосфатного буфера на питательной среде агара в чашке Петри и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 48 часов для подтверждения стерильности
      5. Хранить в холодильнике при температуре 2-8 ° С на срок до одного месяца

        Примечание: Каждый мокроты требуется 10 мл фосфатного буферного раствора
    2. Обеззараживание акции
      1. Комбинат равные объемы раствора гидроксида натрия (8,0 г гидроксида натрия, растворенного в 200 мл стерильной дистиллированной воды) и раствор цитрата натрия (5.8g цитрата натрия в 200 мл дистиллированной стерильной дистиллированной воды)
      2. Смешайте и автоклаве при температуре 121-124 ° С в течение 15 минут
      3. Хранить в холодильнике при температуре 2-8 ° С на срок до одного месяца

        Примечание: Каждый мокроты требуется 2 мл обеззараживания акции
    3. Культура СМИ фондового
      1. Into 900 мл стерильной дистиллированной воды добавить 3.1ml глицерина и 1.25 из casitone и 5.9g из 7H9 порошковой среды; смешать с постоянном перемешивании до полного растворения
      2. Автоклаве при температуре 121-124 ° С в течение 15 минут
      3. Охладить и разделить стерильной среды в 4,5 мл аликвоты в стерильные 16x 100 мм стеклянных трубок для подготовки проб и 10.8ml аликвоты для приготовления растворов и антибиотиков внутреннего контроля
      4. Инкубировать при 37 ° С в течение 48 часов, чтобы проверить стерильность (отсутствие мутности)
      5. Хранить при температуре 2-8 ° С с плотно закрытой крышкой на срок до одного месяца

        Примечание: Каждый мокроты требует одного пробирку, содержащую 4,5 мл из 7H9 среда
    4. Антибиотик растворы
      1. А. Изониазид акции (8 мг / мл)
        1. Растворите 20 мг изониазида полностью в 2,5 мл стерильной дистиллированной воды
        2. Фильтр с фильтром 0,2 мкм шприц для водного растворителя
        3. Хранить в 20 мкл аликвоты в стерильные микропробирок центрифугирования при -20 ° C до 6 месяцев

          Примечание: Каждый хранится 20 мкл аликвоту достаточно для 100 образцов (в том числе отходы)
      2. Б. Рифампицин акции (8 мг / мл)
      1. Растворите 20 мг рифампицина полностью в 1.25ml ДМСО
      2. Добавить 1.25ml стерильной дистиллированной воды и перемешать
      3. Фильтр с фильтром 0,2 мкм шприц для органического растворителя
      4. Хранить в 20 мкл аликвоты в стерильные пробирки микроцентрифужных при температуре -20 ° С до 6 месяцев

        Примечание: Каждый хранится 20 мкл аликвоту достаточно для 100 образцов (в том числе отходы)
  2. Подготовка рабочих растворов
    1. Обеззараживание рабочего раствора
      1. Растворите 0,1 г из NALC кристаллов в каждой 20 мл обеззараживания решение требует

        Примечание: Каждый образец потребности 2мл обеззараживания решение

        Примечание: Не использовать NaOH-NALC обеззараживания решение, которое остается неиспользованной после 24 часов, как NALC теряет муколитическое деятельности с течением времени
    2. Культура СМИ рабочего раствора
      1. Изложить:
        1. 1 тюбик с 7H9 среды для каждого образца мокроты, подлежащих обработке, плюс 1 дополнительная трубка для каждой пластины (для отрицательных колонки управления)
        2. 2 трубы 7H9 средой для положительного контроля (3 monoresistant если штаммов используются)
        3. 1-2 труб с 10.8ml 7H9 для приготовления раствора антибиотика
      2. Добавить 0,5 мл OADC к 4,5 мл из 7H9 в каждой пробирки
      3. Добавить 1.2ml OADC для труб с 10.8ml 7H9
      4. Отложите 2 пробирки с 5 мл 7H9-OADC для положительного контроля, а также трубки (ы) с 12 мл 7H9-OADC которые будут использоваться для приготовления раствора антибиотиков (они не требуют PANTA)
      5. PANTA Развести и добавить 0,1 мл на каждый образец трубы и к отрицательному труб контроля (7H9-OADC-PANTA: общий объем = 5.1ml)

        Примечание: Полное среде с PANTA (7H9-OADC-PANTA) используется для мокроты и отрицательный контроль, использование 7H9-OADC без PANTA для положительного контроля и для приготовления раствора антибиотика
    3. Антибиотик рабочих растворов
      1. 1. См. рисунок 1 для шагов, чтобы сделать рабочий раствор антибиотика в неиспользованных 24-луночного планшета

        Примечание: Для получения точных результатов восприимчивость, окончательные концентрации антибиотиков являются критическими. Следующая процедура подходит для лaboratories оснащен микропипетки. Если микропипетки отсутствуют, туберкулиновые шприцы могут быть использованы с различными серии разведений описано в руководстве пользователя Приложение 3 на modsperu.org

        Примечание: Не повторно замораживать или повторное использование антибиотика работает или растворы, как наркотик деятельности могут быть потеряны Отменить все неиспользованные антибиотики решения в конце рис обработки день 1.. Создание рабочих растворов антибиотиков (из Руководства пользователя на modsperu.org)
  3. Образец мокроты и пластины подготовки
    1. Обеззараживание
      1. Место 2 мл мокроты в 15 мл центрифужную пробирку (если меньше, составляют до 2 мл с фосфатным буфером, а если больше, используйте только 2 мл)
      2. Добавить 2 мл NaOH-NALC решение
      3. Крышка трубки плотно и вихрь в течение 20 секунд; инвертировать трубки для обеспечения NaOH-NALC контакты решение всей внутренней поверхности трубки и крышки
      4. Пусть стоять в течение минимум 15 минут - может продлить на несколько минут, если образец особенно вязкой. Чтобы избежать лечения, не должна превышать 20 минут
      5. Заполните трубку с 14 мл фосфатного буфера (рН 6,8) для нейтрализации щелочи и прекращается процесс обеззараживания, и хорошо перемешать путем обращения трубки в 4 раза
      6. Центрифуга на 3000 г в течение 15 минут (см. Приложение 2 в Руководстве пользователя на modsperu.org для уравнения оборотов в минуту, необходимых для достижения 3000 г)
      7. Тщательно слейте надосадочную жидкость в контейнер для отходов на 10% гипохлорит натрия или других подходящих дезинфицирующих и сохранить гранул
    2. Подготовка окончательного подвески образца и резервного копирования
      1. Использование 7H9-OADC-PANTA (из трубки, содержащей 5.1ml), ресуспендируют образцов гранул в общем объеме 2 мл в центрифуге трубки с пипетки Пастера, хорошо перемешать
      2. Удалить 1 мл суспензии пробы и храните в микроцентрифужных трубки при температуре 2-8 ° С в качестве резервного
      3. Добавить 1 мл второго образца подвески к трубке с остальными 7H9-OADC-PANTA, хорошо перемешать. Это окончательное решение образца готово для нанесения покрытий
    3. Размещение образцов суспензий в 24-луночного планшета
      1. Место 900μl окончательного подвески образца в каждом из 4-х скважинах столбца в 24-луночного планшета
      2. Повторите с дополнительными образцами, пока все столбцы, пластины, за исключением Колонка 3, заполнены (или пока все образцы покрытием)
      3. Место 900μl из-7H9 OADC среды без образца в 4 скважинах Колонка 3 каждого образца пластину (отрицательный внутреннего контроля)
    4. Добавление антибиотиков для образцов
      1. Использование многоканальной пипетки, внимательно заполните 4 подсказки с 100 мкл из скважин с 7H9-OADC и антибиотиков рабочих растворов (колонка 2 антибиотика в разведении пластинчатых см. Рисунок 1)
      2. Добавить 100 мкл аликвоты в столбце 1 скважин с 900μl решений образце, не касаясь пластины или образец
      3. Повторяйте, пока все столбцы, получили дополнительные 100 мкл среды (свободной от наркотиков скважины) или антибиотики решений (в том числе отрицательные колонки управления 3)
      4. Закрыть пластины с крышкой и поместить в герметичные полиэтиленовые (Ziplock) мешок и печатью (сумка не началась снова с этого момента)
      5. Инкубировать при 37 ° C (CO 2 обогащения не нужно)
  4. Контроль качества
    1. Отрицательные элементы управления работают на каждой пластине. Наличия какого-либо роста в любой из скважин в отрицательную колонки управления указывает перекрестного загрязнения, поэтому вся пластинка должна быть отброшена и образцы повторно покрытием.
    2. Положительные элементы управления работают на отдельную табличку, в конце дня. Один полностью лекарственно-чувствительного штамма работать в колонну и штамма, устойчивого к INH и RIF запускается в другом столбце. Если есть опасения о запуске MDR напряжения, как изониазид monoresistant процедить и РИФ monoresistant штамм может быть запущен в месте восприимчивы и MDR штаммами. Все положительные элементы управления должны иметь рост в свободной от наркотиков скважин, чтобы продемонстрировать, что рост медиа-поддержку. Чтобы продемонстрировать, что концентрации препарата верны, восприимчивых штамма не должны расти в INH или РИФ скважин, но MDR напряжение должно расти и расти в INH и RIF скважин.
  5. Пластина чтения
    1. В день посева, как "день 0", чтения автомобильного начинается на 5-й день, а если отрицательна на 5-й день чтения делается каждый день (или через день в зависимости от нагрузки) до 14-й день, а затем через каждые 2-3 дней с 15-й день -21. Плиты рассматриваются наперевернутый световой микроскоп с 10-кратным цель
    2. Позитивная культура является тот, в котором Есть два или более колониеобразующих единиц (> 2 КОЕ) в обоих без наркотиков скважин. Рано микобактериальные роста выглядят как маленькие изогнутые запятых или спиралей (дни 5-9). Колония образование обычно прогрессирует на «шнуры» или «связок» (см. Библиотека изображений по modsperu.org)
    3. В тот день, культуры положительно в 2 свободных от наркотиков скважин, наркосодержащих скважины должны быть прочитаны. Любой рост в присутствии препарата указывает, что устойчивость к препарату.

      Примечание: Если чтение наркосодержащих скважин осуществляется> 1 неделю после положительной культуры отмечается в свободной от наркотиков скважин, это может не отражать сопротивление как прорыв рост иногда видели
    4. Образцы, которые не являются положительными на 21-й день считаются отрицательными культурами
    5. Облачность скважин является результатом загрязнения чрезмерно быстрый рост, в то время микобактериальные рост не приводит к облачность
    6. По завершении 21 дней культуры могут быть отброшены. Культуры остаются в опечатанных мешках и помещают в автоклав мешках и в автоклаве при 121-124 ° С в течение 45-60 минут

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Анализ MODS ориентирован на условиях ограниченных ресурсов. В первый раз, MODS приносит способность к быстрому обнаружению жидкости культуры туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью и туберкулеза с ограниченными ресурсами чуть менее $ 3 за тест. MODS является неимущественные, итерационные методологии и сообщества MODS всегда заинтересована в том, что улучшение других лабораториях удалось сделать.

Периодически озабоченность биобезопасности жидких питательных сред от туберкулеза, поскольку жидкость может быть пролита ил...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

Мы хотели бы выразить признательность Шон Фицуотер и Кармен Джаннина Луна Коломбо по туберкулезу роста покадровой видео сегменте. Мы благодарим Марти Ропер для ее тщательного и отличную обратную связь во время редактирования и совместного редактирования руководство пользователя, от которого текущего протокола было принято главным образом дословно. Производство этого видео был профинансирован NIH / Международный центр Фогарти http://www.fic.nih.gov/ Дэвид Мур AJ, вносимого в Wellcome Trust Клинические научный сотрудник в тропической медицины и лектор по инфекционным болезням из Имперского колледжа в Лондоне (стипендия награда число 078067/Z/05). Марк Ф. Брэди, вносимого в NIH / Фогарти Международный научный центр.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Холодильник/морозильникОборудованиедля хранения заранее приготовленного бульона и стоковых растворов антибиотиков
Вортекс (перемешивание в вортексе)Оборудованиедля облегчения деконтаминации мокроты
ЦентрифугированиеОборудованиедля концентрирования мокроты; с возможностью достижения 3000 g; d–охлаждение не требуется, но оборудование ДОЛЖНО быть биобезопасным (контейнеры должны иметь возможность герметизации)
Инкубатор (37 °C)Оборудованиедля культивирования; обогащение CO2 не требуется
Инвертированный световой микроскопМикроскопдля считывания планшетов MODS
АвтоклавОборудованиедля стерилизации сред, ФСБ и использованных планшетов
ВесыОборудованиевзвесить изониазид, рифампицин и NALC
бульон Middlebrook 7H9 (Difco)РеагентFisher ScientificDF0713-17-9500 г/флакон; основа питательной среды
Casitone (казеин, перевариваемый панкреатином)РеагентFisher ScientificDF0259‐17‐9500 г/флакон; основа питательной среды
Лиофилизированный глицерин (глицерол)РеагентSigma-AldrichG‐33‐500500 мл/флакон; основа питательной среды
PANTA (лиофилизированная смесь антибиотиков BD) РеагентFisher ScientificB43451146 флаконов в упаковке; добавка с антибиотиками для сред
OADC (обогатительная среда Middlebrook OADC BD)РеагентFisher ScientificB1188610 x 20 мл/упаковка; добавка к питательным средам
Диметилсульфоксид (Hibri-Max)РеагентSigma-AldrichD-2650100 мл/флакон; для приготовления стокового раствора рифампицина
Стоковые растворы антибиотиков: изониазидРеагентSigma-AldrichI-337750 г/флакон; прямое определение чувствительности
Стоковые растворы антибиотиков: рифампицинРеагентSigma-AldrichR-35011 г/флакон; прямое определение чувствительности
Гидроксид натрия (гранулы)РеагентSigma-Aldrich221465500 г/флакон; деконтаминация мокроты
Цитрат натрия (тринатриевая соль дигидрат)РеагентSigma-AldrichS-4641500 г/флакон; деконтаминация мокроты
N-ацетил-L-цистеинРеагентSigma-AldrichA-725050 г/флакон; деконтаминация мокроты
Кристаллы однозамещенного фосфата калия. KH2PO4РеагентSigma-AldrichP0662500 г/флакон; деконтаминация мокроты
Натрия фосфат двузамещенный, безводный. Na2HPO4РеагентSigma-AldrichS0876500 г/флакон; деконтаминация мокроты
Гипохлорит натрияРеагентбытовой отбеливательутилизировать контаминированные отходы
центрифужные пробирки объемом 15 мл (полипропиленовые, Falcon 35, 15 мл)‐2096)Расходный материалFisher Scientific14‐959‐49B500 шт./упаковка; для деконтаминации и концентрирования мокроты
24-луночные планшеты (Plates Tissue 24 wells BD Falcon 35‐3047)Расходные материалыFisher Scientific08-772-150 планшетов в упаковке; для культивирования и считывания данных
Герметичные полиэтиленовые пакеты 6 x 6 “ (зип-пакет)Расходные материалыдля обеспечения биобезопасности при использовании 24-луночного планшета
Стеклянные пробирки с крышкой (16 x 100 мм и 18 x 145 мм)Расходные материалыVWR international47729-583500 пробирок в упаковке; для хранения аликвот приготовленного бульона
Микроцентрифужные пробирки с завинчивающейся крышкой (1,5 мл)Расходный материалFisher Scientific05‐669‐221000 шт./уп.; для хранения аликвот стоковых растворов антибиотиков
0.22μфильтры (водные растворители) Шприцевой фильтр Millex blueРасходный материалFisher ScientificSLGL 025 OS50 единиц в упаковке; для фильтрации стоковых растворов антибиотиков
0.22μфильтры (органические растворители) Шприцевой фильтр Millex yellowРасходный материалFisher ScientificSLGV 033 RS50 единиц в упаковке; для фильтрации стоковых растворов антибиотиков
Одноразовые пипетки Пастера из боросиликатного стекла, 9″Расходный материалFisher Scientific13‐678‐20°C720 шт./упак.; для смешивания PANTA со средой
Наконечники с фильтром 1000 мкл‐1300μлРасходный материалFisher Scientific02‐707‐511000 шт/уп; для дозирования среды в планшет
Наконечники USA Scientific Tips One 1‐200μжелтые наконечникиРасходный материалFisher Scientific1111‐00061000 наконечников в упаковке; для разведения стоковых растворов антибиотиков

Ссылки

  1. Arias, M. Clinical evaluation of the microscopic-observation drug-susceptibility assay for detection of tuberculosis. Clin Infect Dis. 44, 674-674 (2007).
  2. Caviedes, L. Rapid, efficient detection and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in sputum by microscopic observation of broth cultures. The Tuberculosis Working Group in Peru. J Clin Microbiol. 38, 1203-1203 (2000).
  3. Caviedes, L., Moore, D. A. Introducing MODS: a low-cost, low-tech tool for high-performance detection of tuberculosis and multidrug resistant tuberculosis. Indian J Med Microbiol. 25, 87-87 (2007).
  4. Caws, M. Evaluation of the MODS culture technique for the diagnosis of tuberculous meningitis. PLoS ONE. 2, e1173-e1173 (2007).
  5. Ejigu, G. S. Microscopic-observation drug susceptibility assay provides rapid and reliable identification of MDR-TB. Int J Tuberc Lung Dis. 12, 332-332 (2008).
  6. Kim, S. J. Risk of occupational tuberculosis in National Tuberculosis Programme laboratories in Korea. Int J Tuberc Lung Dis. 11, 138-138 (2007).
  7. Mello, F. C. Clinical evaluation of the microscopic observation drug susceptibility assay for detection of Mycobacterium tuberculosis resistance to isoniazid or rifampin. J Clin Microbiol. 45, 3387-3387 (2007).
  8. Moore, D. A. Future prospects for the MODS assay in multidrug-resistant tuberculosis diagnosis. Future Microbiol. 2, 97-97 (2007).
  9. Moore, D. A. Infrequent MODS TB culture cross-contamination in a high-burden resource-poor setting. Diagn Microbiol Infect Dis. 56, 35-35 (2006).
  10. Moore, D. A. Microscopic-observation drug-susceptibility assay for the diagnosis of TB. N Engl J Med. 355, 1539-1539 (2006).
  11. Moore, D. A. Microscopic observation drug susceptibility assay, a rapid, reliable diagnostic test for multidrug-resistant tuberculosis suitable for use in resource-poor settings. J Clin Microbiol. 42, 4432-4432 (2004).
  12. Moore, D. A., Roper, M. H. Diagnosis of smear-negative tuberculosis in people with HIV/AIDS. Lancet. 370, 1033-1033 (2007).
  13. Oberhelman, R. A. Improved recovery of Mycobacterium tuberculosis from children using the microscopic observation drug susceptibility method. Pediatrics. 118, e100-e100 (2006).
  14. Palomino, J. C., Martin, A., Portaels, F. MODS assay for the diagnosis of TB. N Engl J Med. 356, 188-189 (2007).
  15. Park, W. G., Bishai, W. R., Chaisson, R. E., Dorman, S. E. Performance of the microscopic observation drug susceptibility assay in drug susceptibility testing for Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 40, 4750-4750 (2002).
  16. Shiferaw, G. Evaluation of microscopic observation drug susceptibility assay for detection of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 45, 1093-1093 (2007).
  17. Tovar, M. Improved diagnosis of pleural tuberculosis using the microscopic- observation drug-susceptibility technique. Clin Infect Dis. 46, 909-909 (2008).
  18. Vargas, D. Diagnosis of sputum-scarce HIV-associated pulmonary tuberculosis in Lima, Peru. Lancet. 365, 150-150 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

анализ MODSдиагностика туберкулезатуберкулез с множественной лекарственной устойчивостьюкультура в жидких средахмикроскопическое исследованиеопределение чувствительности к лекарственным препаратамдеконтаминация мокротыинвертированная микроскопиябокс биологической безопасностифосфатный буфер
MODS метод диагностики туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью и туберкулеза
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.