В этой статье мы показали, как рассекают центральной нервной системы с третьего возраста личинок дрозофилы.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Препарирование личинок ЦНС у дрозофилы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Центральной нервной системы (ЦНС), личинок дрозофилы является сложным и плохо изучены. Один из способов исследовать ЦНС является использование иммуногистохимии для изучения экспрессии различных романа и маркеров белков. Окрашивание целом личинки нецелесообразно, так как жесткие кутикулы предотвращает антител от проникновения внутрь полости тела. Для того, чтобы пятно этих тканей необходимо препарировать животное до фиксации и окрашивания. В этой статье мы показали, как рассекают дрозофилы личинки без повреждения ЦНС. Начните с разрывая личинки пополам с парой тонких щипцов, а затем включите кутикулы "наизнанку", чтобы разоблачить ЦНС. Если вскрытие производится тщательно ЦНС будет оставаться прикрепленной к кутикуле. Мы обычно держат ЦНС придается кутикулы всей фиксации и окрашивания шагов, и только полностью удалить ЦНС от кутикулы незадолго до монтажа образцов на предметных стеклах. Мы также покажем некоторые характерные образы личиночной ЦНС витражи с Евой, транскрипционный фактор выражается в подмножество нейронов в ЦНС. Статья завершается обсуждением некоторых практических применений этой техники и возможные трудности, которые могут возникнуть.
Протокол
- Рассеките 3-го возраста личинки, оставляя ЦНС придается кутикулы. Место в 1,5 мл трубки.
- Зафиксируем в PBS (1x), содержащий 2% формальдегида в течение 40 мин с качалки. ; Использование 250ul за каждые 5-10 расчлененный ЦНС.
- Удалить формальдегида и кратко промыть 3 раза PBS + 0,1% Тритон Х-100 (PBST). Используйте мелко вытащил пипетки Пастера, чтобы избежать потери ткани.
- Блок неспецифический белок сайты связывания и permeabilize клеточных мембран путем инкубации ткани 1-8 часов в PBST + 5% BSA, покачиваясь при 4 ° C.
- Инкубируйте в первичных антител разводят в PBST + 5% BSA качалке при температуре 4 ° С в течение ночи. Оптимальное разведения антител будет варьироваться для разных антител.
- Промыть 3 раза в PBST с последующими двумя 30 минут моет при температуре 4 ° C.
- Инкубируйте в вторичными антителами разводят в PBST + 5% БСА в течение 1-3 часов качания при 4 ° C. Промыть 3 раза в PBST с последующими двумя 30 минут моет при температуре 4 ° C. Если вторичный сопряжена с светочувствительных соединений, оберните трубу в алюминиевую фольгу.
- Рассеките ткани в дальнейшем (при необходимости) и установите на слайдах.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Это видео демонстрирует, как вскрыть ЦНС из третьих личинки дрозофилы возраста. После вскрытия, ЦНС могут быть окрашены с использованием стандартного протокола иммуногистохимии. В настоящее время, многое до сих пор неизвестно о том, как взрослые нервной системы создается, а также как он хранит и передает информацию. Исследования развивающихся дрозофилы ЦНС личиночной должны расширить наши знания о нервная система электропроводки и функции.
Личинки дрозофилы обладают рядом stereotpyed поведения, таких как ответ на сигналами окружающе...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не заявляют о наличии конфликта интересов.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии | |
|---|---|---|---|---|
| Пинцет | с тонкими кончиками | |||
| Часовое стекло с 9 лунками | ||||
| Пластиковая чашка Петри |
Ссылки
- Lin, D. M., Goodman, C. S. Ectopic and increased expression of fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance. Neuron. 13, 507-523 (1994).
- Park, Y., Fujioka, M., Kobayashi, M., Jaynes, J., Datta, S. even skipped is required to produce a trans-acting signal for larval neuroblast proliferation that can be mimicked by ecdysone. Development 128. , 1899-1909 (2001).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
