Одноместный Методы Молекула для мониторинга изменений в двухслойных упругих свойств

Здравствуйте, я доктор Ола Андерсон с кафедры физиологии и биофизики медицинского колледжа Вейл Корнелл в Нью-Йорке. Меня зовут Олсон. Я студент по специальности «вычислительная биомедицина» в лаборатории Оливы Андерсон.

А я Шейл Коллингвуд, лаборант-исследователь из лаборатории Андерсона. Сегодня мы покажем вам, как сформировать плоский биослой, как изолировать небольшой участок мембраны с помощью электрода для прокола биослоя, как регистрировать активность одиночного канала и как анализировать результаты, используя таким образом каналы грамина в качестве зондов для изучения свойств липидного биослоя. В предыдущем видео мы показали вам, как подготовиться к этим экспериментам.

Мы продемонстрировали вам способ подготовки используемой нами камеры, а также способ подготовки электрода для пробивки бислоя, который мы применяем для изоляции небольшого участка мембраны, где регистрируется активность каналов. Теперь приступим к пробивке бислоев. Для начала подготовки к экспериментам с бислоями добавьте по 2,5 мл термостабилизированного раствора электролита в каждый отсек предварительно подготовленной камеры. Обычно мы используем раствор 1 М NaCl и 10 мМ.

Доведите pH буферного раствора до семи, настройте микроскоп и источник света таким образом, чтобы отверстие в тефлоне находилось в центре поля зрения и было ярко освещено. Вставьте стеклянную микропипетку в держатель микроэлектрода. Соедините шприц с держателем с помощью отрезка трубки Tygon.

Заполните пипетку в держателе электрода путем всасывания. Будьте осторожны, чтобы не допустить появления пузырьков воздуха, так как они могут нарушить электрический контакт между серебряной гранулой в держателе электрода и кончиком пипетки. Нанесите небольшое количество вазелина на винт, затем поместите его в держатель микроэлектрода.

Вазелин помогает создать герметичное уплотнение. Вставьте держатель электрода в головку патч-клампа в клетке Фарадея. Расположите кончик микропипетки по центру, непосредственно за отверстием в тефлоновой перегородке.

Поместите свернутый серебряный электрод в переднюю камеру. Зафиксируйте его с помощью модельного пластилина и подключите к цепи управления напряжением. В завершение сбалансируйте электроды.

Это имеет решающее значение, поскольку два электрода — тот, что спереди, и тот, что в держателе микроэлектрода — могут иметь слегка различающиеся потенциалы полуэлементов. Потенциал полуэлемента представляет собой разность потенциалов между металлическим серебром и электродом и электролитическим раствором, прилегающим к покрытию из хлорида серебра. Сбалансируйте электроды, отрегулировав ручное смещение таким образом, чтобы ток, протекающий между двумя камерами, колебался в диапазоне от -200 до +200 пА на патч-клампе.

Потенциал смещения будет изменяться со временем, поэтому на протяжении всего эксперимента по формированию липидного бислойного мембранного слоя необходимо регулярно проводить балансировку электродов. Очистите огнеполированную паст-пипетку раствором fch, как описано в сопроводительном видео. Погрузите очищенную пипетку в раствор для нанесения липидов и дайте ему подняться в пипетку примерно на один миллиметр.

Расположите наконечник пипетки непосредственно перед отверстием в тефлоновой перегородке и аккуратно нанесите каплю липидного раствора на отверстие. При успешном выполнении в отверстии образуется ярко окрашенный липидный пузырек, прикрепленный к тефлоновой перегородке липидным перешейком в форме тора или «пончика». Дождитесь истончения мембраны; этот процесс можно ускорить, приложив к мембране потенциал от 100 до 200 millivolt.

Поместите наконечник стеклянной микропипетки в Taurus и подождите несколько минут, чтобы обеспечить более плотное прилегание пипетки к бислою. Теперь вы готовы изолировать участок мембраны с помощью стеклянной микропипетки. Далее введите в мембрану грамин.

Данный раствор грамина был приготовлен из стокового раствора с концентрацией 1 мкМ, который развели до концентрации от 1 до 10 нМ в диметилсульфоксиде. Обычно от 1 до 10 мкл разведения добавляют с каждой стороны мембраны, чтобы конечная концентрация находилась в пикомолярном диапазоне. Используйте магнитные мешалки для перемешивания раствора в течение примерно двух минут, после чего подождите еще 10 минут перед формированием новой малой мембраны для регистрации активности одиночных каналов.

Такое время выдерживания позволяет грамицидину встроиться в мембрану. Проверьте активность каналов, приложив напряжение. Как правило, необходимо добиться примерно одного события открытия канала в секунду.

Каналы видны как отдельные скачки мембранного тока вверх и вниз. Теперь можно приступать к непосредственному проведению эксперимента. Сначала запишите контрольные кривые тока.

Сбалансируйте электрод, как было показано ранее, и сформируйте небольшой мембранный участок или патч, как описано в сопровождающем видео. Подайте положительный потенциал 200 millivolts и запишите активность одиночного канала. Вам следует собрать от 100 до 200 переходов тока одиночного канала.

Повторите этот шаг при напряжении -200 мВ. Разорвите патч, вытеснив электролит через кончик пипетки. С помощью нейлонового винта снова сбалансируйте электроды, отведите пипетку в заднюю камеру, удалите излишки липидов и сформируйте новый патч.

Вы также можете повторить эти шаги, чтобы провести записи при других потенциалах. Теперь вы готовы к регистрации экспериментальных кривых тока при добавлении модификатора бислоя. В данном случае на обе стороны мембраны добавляется антидепрессант флуоксетин.

Стоковый раствор флуоксетина следует разбавить до концентрации 25 мМ в DMSO. Добавьте пять мкл этого раствора для достижения концентрации 50 мкМ в камере. DMSO может влиять на свойства бислоя. Поэтому важно ограничить количество DMSO в растворе до 25 мкл, 1% или 150 мМ.

Перемешивайте в течение пяти минут, затем подождите 10 минут, чтобы модификатор уравновесился между водным раствором и мембраной. Теперь зарегистрируйте активность канала в присутствии модификатора, как описано ранее. Повторяйте эти шаги для регистрации активности канала при возрастающих концентрациях модификатора.

Мы получаем множество данных об изменениях в бислое, количественно определяя время жизни каналов и скорость их появления. Для проведения такого анализа необходимо регистрировать моменты образования и исчезновения каналов. В данном случае мы используем алгоритм на основе анализа переходов, при котором компьютер вычисляет первую производную для определения резких изменений тока и отмечает их как события открытия или закрытия каналов.

События сохраняются в виде временных рядов, что позволяет определить время жизни каналов до и после перехода. Также сохраняются уровни тока, которые помогают определять амплитуды каналов непосредственно в ходе эксперимента. Компьютер строит гистограмму амплитуд переходов тока, что позволяет отслеживать процесс регистрации этих переходов.

Это также позволяет оценить качество эксперимента. Если амплитуды текущих переходов сильно разбросаны, значит, возникли проблемы. Если гистограмма узкая, значит, работа выполняется правильно.

После того как будет накоплено более 200 событий перехода, рассчитайте средний ток и стандартное отклонение для переходов в основном пике. Частоту появления каналов можно оценить, просто разделив количество переходов в гистограмме амплитуд тока на время наблюдения. Не забудьте также разделить результат на два, так как канал учитывается в гистограмме дважды: один раз при его появлении и второй раз при его исчезновении.

Проанализируйте временные ряды событий перехода для получения распределения времени жизни каналов. Определение времени жизни осуществляется простым способом на текущих записях, в которых в любой момент времени открыт не более одного проводящего канала. В этом случае компьютер определяет, является ли каждый переход открытием или закрытием канала, причем событие закрытия может относиться только к предшествующему событию открытия.

Время между двумя переходами представляет собой время жизни канала. В случаях, когда переходы канала происходят слишком близко друг к другу, чтобы их можно было различить, необходимо вручную назначать моменты появления и исчезновения. Назначение усложняется в случае наличия двух или более одновременно проводящих каналов, так как в этом случае неизвестно, какое исчезновение канала соответствует конкретному появлению.

По этой причине предпочтительна низкая активность каналов. Проблему назначения можно решить, используя генератор случайных чисел для сопоставления появлений с исчезновениями. Таким образом, вы получите серию времен жизни каналов.

Эти данные преобразуются в гистограмму времени жизни, которая, в свою очередь, преобразуется в график выживаемости; среднее время жизни определяется путем аппроксимации графика выживаемости одноэкспоненциальным распределением с использованием метода нелинейных наименьших квадратов для экспериментов, в которых большая мембрана не разрывается. При добавлении модификатора бислоя можно сравнить его влияние на скорость появления каналов. Такое сравнение неоправданно, если большая мембрана разрывается; функция мембранного белка регулируется липидным составом клеточной мембраны.

Эта регуляция обусловлена сочетанием специфических взаимодействий белков с липидами и более общих взаимодействий между липидным бислоем и мембранными белками. Данные взаимодействия особенно важны в фармакологических исследованиях, так как многие современные фармацевтические препараты на рынке являются амфифильными веществами, способными изменять свойства липидного бислоя, что, в свою очередь, может привести к изменению функции мембранных белков.

Граминовые каналы могут использоваться в качестве молекулярных преобразователей силы для определения того, способны ли амфифилы изменять свойства липидного бислоя. Построение графиков изменения времени жизни и скорости появления в зависимости от концентрации модификатора позволяет понять, как меняются свойства бислоя.

Увеличение частоты означает, что бислой легче деформируется для размещения сайта Gram и димеризации. Увеличение времени жизни означает, что деформация бислоя, связанная с формированием канала, менее затратна с точки зрения энергии. Модификатор может увеличить частоту и время жизни за счет повышения эластичности мембраны или влияния на ее кривизну.

Мы продемонстрировали, как использовать хромоканалы для проверки того, изменяют ли малые молекулы упругие свойства бислоя. На этом все. Спасибо за просмотр.

Желаем удачи в проведении ваших экспериментов.