Name: Горизонтальное Подготовка Кусочек сетчатки (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-20T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Изучите новый метод горизонтального среза сетчатки для сохранения дендритной морфологии нейронов. Этот подход улучшает анализ функций сетчатки и открывает новые возможности для исследований зрительной системы.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Мы благодарим доктора. Ричард Х. Masland и Акимичи Канеко за предоставленную нам ценные советы и предложения устанавливает порядок горизонтальных подготовки кусочек сетчатки.

<ol><li> Подготовка агара блок (30 мг / мл, то есть 3%, в дистиллированной воде). Растворите и микроволновые это первый и перелить его в стеклянную посуду. Держите блюдо в холодильнике при температуре 4 ° С. Совет: агар блок должен быть подготовлен заранее. </li><li> Подготовка низкой температуры плавления агарозном геле (25 мг / мл, т.е. 2,5%, в среде). Растворите и микроволновые его. Храните ее в ванну с горячей водой при температуре 35 ° С. Совет: Имейте в агарозном геле не слишком жарко. Если она слишком горячая, она занимает много времени, чтобы быть затвердевшим, и гель может убить сетчатки . </li><li> Усыпить животное, выяснять глазного яблока и открыть его как наглазник. Для сжижения стекловидного тела, открыл наглазник вымачивают в течение 10 мин в гиалуронидазы в среде (0,07 мг / мл), если это необходимо. </li><li> Вырезать агар в блок (например, 1 см х 1,5 см для мыши сетчатки) и прочно прикреплены на vibratome стадии мгновенного клея. Хранить агар блок мокрой. </li><li> Место лезвием на 5 градусов на срез. Аккуратно вырезать верхнюю поверхность агара блок со скоростью ок. 50 мкм / с, частота. 50 Гц. Совет: Убедитесь, что верхняя поверхность агара блок абсолютно гладкой и ровной. Несколько разрезов (по крайней мере 3 раза), может быть, необходимых для получения гладкой и ровной поверхности агара блока. </li><li> Промыть наглазник со средой без гиалуронидазы. Изолировать сетчатки от пигментного эпителия и поместить его фоторецепторов стороной вниз на лист фильтровальной бумаги. Чтобы прочно прикрепить сетчатку к фильтровальной бумаге, вакуумные сетчатки на фильтровальной бумаге несколько раз. Совет: Убедитесь, что сетчатка прикрепляется к фильтровальной бумаге абсолютно плоской. После того как вы положили сетчатки на фильтровальной бумаге, вырезать избыточное фильтровальной бумаги окружающей сетчатки (рис. 2). Избыток фильтровальной бумаги часто мешает лезвие от вдаваясь в соответствующий слой сетчатки. </li><li> Аккуратно протрите лишнюю среды на агар блока и осторожно поместите сетчатки на фильтровальную бумагу на агар блока. Чтобы твердо место фильтровальной бумаги на агар блока, приложите мгновенного клея на краю фильтровальной бумаги. Совет: Чтобы избежать unexpectable трещины, места сетчатки, как перед возможной степени на верхней поверхности агара блока. </li><li> Аккуратно влить низкой температуры плавления агарозном геле за сетчаткой. Подождите 1 мин и осторожно вылейте среды на это, чтобы охладить его. Агарозном геле становится затвердевшим быстро. Совет: Слишком жарко агарозном гель убивает сетчатки. </li><li> Поднимите положением лезвия до нескольких сотен мкм выше верхней поверхности агара блока и аккуратно вырезать начало затвердевших агарозном геле. </li><li> Книзу положением лезвия. Вырезать сетчатки на уровне проксимальной трети внутренний ядерный слой (примерно между 200 и 250 мкм выше верхней поверхности агара блок). Совет: Слишком большая скорость лезвия может повредить сетчатку строго. Приблизительный 50 мкм / сек (50 Гц) является целесообразным. </li><li> Обратите внимание, что amacrine клетки в настоящее время лицевой стороной вниз. Тщательно подберите кусочек сетчатки вместе с затвердевшим агарозном геле и поместить его лицевой стороной вверх в камере или блюдо. Подсказка: Поскольку мышь сетчатки является крошечным и волнистые, трудно получить идеальный горизонтальный срез на соответствующем слое. &quot;Косой&quot; срез может быть альтернативным методом, чтобы получить относительную плоский кусок сетчатки. Чтобы получить косой срез, поставить еще один бумажный фильтр между сетчаткой на фильтровальную бумагу и агар блока, как показано на рис.2б. Хотя вы не можете ожидать, идеальный горизонтальный срез, Есть всегда несколько областей, где сомы amacrine ячейка находится на поверхности среза. </li></ol>

<ol><li>Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+spatiotemporal+patterns+of+dendritic+Ca2%2B+signals+in+goldfish+retinal+amacrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells.</a> Brain Res. , 64-73 (2004).</li>
<li>Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifying+currents+stabilize+the+membrane+potential+in+dendrites+of+mouse+amacrine+cells%3A+patch-clamp+recordings+and+single-cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Inward rectifying currents stabilize the membrane potential in dendrites of mouse amacrine cells: patch-clamp recordings and single-cell.</a> , 328-340 (2004).</li>
<li>MA, M. acN. eil, RH, M. asland <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+diversity+among+amacrine+cells%3A+implications+for+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Extreme diversity among amacrine cells: implications for function.</a> Neuron. , 971-982 (1998).</li>
</ol>

Все экспериментальные протоколы были проведены в соответствии с Национальными Институтами Здоровья руководящие принципы для использования животных.

Есть несколько важных преимуществ горизонтальной подготовки кусочек сетчатки. Во-первых, морфология клетки, которые расширяют дендритов горизонтально, таких как amacrine клетки и горизонтальные клетки, сохраняется. Было показано, что Есть более 20 видов amacrine клеток в сетчатке (Макнил и Masland, 1998), так что это довольно важно сравнить морфологию клеток с физиологического свойства. Во-вторых, в целом монтажа сетчатки, широкое освещение endfeets глиальных клеток с предотвращает доступ патч для пипеток amacrine клеток. В ...

<table><tbody><tr><td>Агар</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-1296</td><td></td></tr><tr><td>Агароза L</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>317-01182</td><td>Низкоплавкий агароз </td></tr><tr><td>Гиалуронидаза</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Тип I-S, 300 Ед/мг</td></tr><tr><td>Среда</td><td></td><td></td><td>в мМ: 102 NaCl, 3,1 KCl, 2,0 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1,0 MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 23 NaHCO3&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;и 10 глюкозы при pH 7,8, или Ames&amp;rsquo; Раствор (Sigma)</td></tr><tr><td>Микроволновая печь</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Водяная баня</td><td></td><td></td><td>35 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Вибратом, вибротомический микротом</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>МФ-мембранные фильтры</td><td>EMD Millipore</td><td>HAWP01300</td><td>Фильтровальная бумага, размер пор 0,45 мкм &amp;#181;м</td></tr><tr><td>Инструменты для диссекции</td><td></td><td></td><td>пинцет, лезвие, зажим, пинцет &lt;электронная микроскопия&gt;и т. д.&lt;/em&gt;.</td></tr><tr><td>Мгновенный клей</td><td></td><td></td><td>&lt;электронная микроскопия&gt;например,&lt;/em&gt; Alonalpha, Krazy Glu</td></tr><tr><td>Шприц объемом 50 мл</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Шприцевой фильтр</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0001300</td><td></td></tr></tbody></table>

Горизонтальное Подготовка Кусочек сетчатки

Horizontal Slice Preparation of the Retina

Традиционно вертикальная часть и целое монтажа подготовки сетчатки были использованы для изучения функции сетчатки схем. Однако многие из нейронов сетчатки, такими как amacrine клеток, расширить свои дендриты горизонтально так, что морфология клетки должна быть серьезно поврежден в вертикальных срезов. В целом монтажа подготовки, особенно для патч-зажим записей, нейронов сетчатки в среднем слое не являются легкодоступными из-за широкого освещения глиальные клетки (Мюллер ячейки) endfeets с. Здесь мы описываем новый метод нарезки сохранить дендритных морфологии нейронов сетчатки без изменений. Срез был сделан горизонтально на внутренний слой сетчатки использованием vibratome слайсер после сетчатки было заложено в низкой температурой плавления агарозном геле. В этом горизонтальные подготовки кусочек сетчатки, мы изучили функцию нейронов сетчатки по сравнению с их морфологии, с помощью патч-зажим записи, техника визуализации кальция, иммуноцитохимия, и одноклеточные RT-PCR.

Традиционно вертикальная часть и целое монтажа подготовки сетчатки были использованы для изучения функции сетчатки схем. Здесь мы описываем новый метод нарезки сохранить дендритных морфологии нейронов сетчатки без изменений.

Традиционно для изучения функций ретинальных цепей использовали вертикальные срезы и препараты сетчатки в целом. Однако многие из...

Итак, легендарный экземпляр здесь, и перед нами статья с иллюстрациями.

horizontal-slice-preparation-of-the-retina

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Не-человеческое приматов является важным поступательное видов для нашего понимания развития и старения. Анатомическая организация приматов сетчатки может предоставить важную информацию о нормальных и патологических состояний у человека.

Ворота в мозг: Пройдя Предстоятель глаз

Здесь мы опишем процедуру для получения темно-адаптированных ломтиками мыши сетчатки для электрофизиологических записей.

Патч зажим Recordings от мыши нейронов сетчатки в темно-адаптированной фрагмент подготовка

Мы описываем получения тонких срезов сетчатки водных тигра саламандры...

Одновременное Цельноклеточная Записи из фоторецепторов и второго порядков Нейроны сетчатки амфибий Подготовка Slice

Нейронные сетчатки мыши в возрасте 8 дней на вершине 4% желатина блока. После выделения фоторецепторов слоя (200 мкм) по vibratome, фоторецепторы высевают после механической и ферментативной диссоциации культуры. Фоторецептор слой может быть использован для молекулярных, биохимических анализов или трансплантации.

Vibratome секционирования мыши Retina Подготовка фоторецептора культур

Мы продемонстрируем, как приготовить срезы сетчатки из глаза мыши и записать световые реакции в нейронах сетчатки. Вся процедура проводится в условиях, адаптированных к темноте.

Запись Light-вызывала постсинаптические реакции нейронов темно-адаптированных, мышь сетчатки ломтик препаратов с использованием методов локальной фиксации

Мы опишем протокол для мониторинга динамики Ca 2+ в аксонов фоторецепторов колбочек, используя препарат ломтик экс-естественных условиях сетчатки мыши. Этот протокол позволяет комплексные исследования конус Са 2+ сигналов в качестве важного млекопитающих модельной системы, мышь.

Са изображений<sup&gt; 2+</sup&gt; Динамика колбочек аксонов мыши Retina

Мы разработали горизонтальный срез препарата сетчатки у млекопитающих взрослого с плоскостью секционирования параллельно поверхности сетчатки. Дендритные поля нерадиально ориентированных нейронов сетчатки не были усечены, что позволяет изучение обработки сигналов с накладными-смыкания и визуализации методов.

Подготовка горизонтальных слоев взрослых мышей Retina для электрофизиологических исследований

Визуализации тканей сетчатки может предоставить информацию одной ячейки, которые не могут быть собраны от традиционных биохимических методов. Этот протокол описывает подготовка конфокальная томография сетчатки кусочки от данио рерио. Флуоресцентный генетически закодированный датчики или индикатор красители позволяют визуализации многочисленных биологических процессов в типах различных клеток сетчатки.

Подготовка Ломтики свежих сетчатки от взрослых рыбок данио для Ex Vivo изображений эксперименты

В этой работе представлен альтернативный препарат плоской сетчатки, в котором удаление тел фоторецепторных клеток обеспечивает более быструю диффузию антител и улучшенный доступ к внутренним нейронам сетчатки с помощью пипетки для иммуногистохимии, гибридизации in situ и электрофизиологических экспериментов.

Расщепленная сетчатка как усовершенствованный плоский препарат для исследования нейронов внутреннего ядерного слоя сетчатки позвоночных

Сетчатка демонстрирует сложную пространственную организацию по всей своей ламинарной структуре. Современные методы пространственной транскриптомики и секвенирования требуют срезов тканей толщиной &lt; 20 мкм, что ограничивает их применимость в исследованиях сетчатки. Этот метод криосекции позволяет получить тонкие срезы сетчатки мыши, сохраняя при этом плоские пространственные отношения, что позволяет проводить всестороннее молекулярное картирование пластинок.

В лицо Криосекция сетчатки мыши для многомерного пространственного молекулярного анализа

Изучите новый метод горизонтального среза сетчатки для сохранения дендритной морфологии нейронов. Этот подход улучшает анализ функций сетчатки и открывает новые возможности для исследований зрительной системы.

Горизонтальное Подготовка Кусочек сетчатки

Больше видео