Анализ экспрессии генов из морских микробных сообществ использованием экологических транскриптомику

Данная процедура начинается с получения биомассы морских микроорганизмов из проб воды путем предварительной фильтрации через фильтры с размером пор 5 и 3 мкм с последующим сбором на фильтр 0,22 мкм. Затем из организмов, задержанных на фильтре 0,22 мкм, экстрагируют общую РНК. рРНК удаляют из общей РНК путем селективной ферментативной деградации и субтрактивной гибридизации; обогащенный Mr.N амплифицируют линейно с помощью полиаденилирования и транскрипции in vitro.

Затем амплифицированная антисмысловая РНК конвертируется в двухцепочечную кДНК с помощью случайных гексамеров. Полученную кДНК можно клонировать и секвенировать или подвергнуть прямому пиросеквенированию. Здравствуйте, я Рэйчел Перски из лаборатории доктора Марианн Моран с кафедры морских наук Университета Джорджии.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру анализа экспрессии генов в образцах из окружающей среды с использованием методов экологической метатранскриптомики. Скотт Гиффорд покажет, как обрабатывать образцы окружающей среды для сбора РНК.

Я покажу вам, как выделить РНК из образцов и определить значения RIN. AON продемонстрирует процесс удаления РНК. Затем Мария Коста разберет этапы амплификации РНК и синтеза кДНК.

Итак, приступим. Для начала сбора экологической РНК мы подготавливаем систему фильтрационной линии, поместив один конец трубки в воду на нужную глубину отбора проб и присоединив другой конец к объемному фильтру с размером пор 3 µm, установив насос между двумя концами трубки. Затем фильтр 3 µm соединяют с системой фильтров 0.22 µm, а поток воды из системы фильтров 0.22 µm направляют в мерный стакан.

Пропустите через систему несколько литров воды для промывки. По окончании, при работающем насосе, извлеките трубку из воды, чтобы удалить остатки жидкости из линии. Затем с помощью пинцета установите фильтр 0.22 мкм на фильтровальную колонку и закройте ее.

Поместите конец трубки обратно в воду и включите насос. Дайте воздуху выйти из обоих фильтров и контролируйте объем профильтрованной воды по мерной шкале на канистре. Как только будет профильтрован необходимый объем, извлеките трубку из воды и удалите оставшуюся в системе воду.

Как только фильтр высохнет, быстро снимите верхнюю фильтровальную пластину и сложите фильтровальную бумагу. Поместите фильтр в контейнер типа whirl pack и подвергните мгновенной заморозке в жидком азоте. Перед началом эксперимента важно отметить, что поскольку РНК присутствуют повсюду, а мРНК быстро деградируют, необходимо соблюдать стандартные меры предосторожности для работы в среде, свободной от рибонуклеаз, в том числе при подготовке рабочих поверхностей и дозаторов.

Исходя из этого, при работе с любыми материалами, используемыми в данной процедуре, следует использовать чистые перчатки. Обработку образцов необходимо проводить в максимально короткие сроки. Для начала экстракции общей РНК из фильтра 0,22 мкм подготовим пробирки с бусинами, добавив 8 мл буфера RLT с добавлением бета-меркаптоэтанола в коническую пробирку объемом 50 мл.

Затем добавляют от одного до двух миллилитров магнитных частиц для выделения РНК из набора для экстракции из почвы Mobile Power. Быстро извлеките замороженный фильтр из морозильной камеры, не вынимая его из упаковки Whirl-Pak, и разбейте его молотком.

Поместите раздробленный фильтр в подготовленную коническую пробирку объемом 50 мл и загерметизируйте крышку пробирки парафином или лабораторной лентой, затем перемешайте на вортексе в течение 10 минут. После этого центрифугируйте пробирку объемом 50 мл при 5 000 RPM в течение одной минуты. При комнатной температуре максимально удалите лизат и перенесите его в пробирку объемом 15 мл, после чего повторно центрифугируйте в течение пяти минут.

После центрифугирования при 5 000 ×g супернатант переносят в новую пробирку объемом 50 мл и к лизату добавляют один объем 100% этанола. С помощью шприца объемом 10 мл пропустите лизат через иглу калибра 18–21 туда и обратно примерно пять раз. Для последующих этапов экстракции используйте набор KaiGen R and easy mini в соответствии с инструкциями производителя, нанося лизат на прилагаемую колонку с помощью вакуумного манифольда или путем повторного центрифугирования.

Количественно определите содержание общей РНК спектрофотометрически. После определения общего выхода РНК мы используем набор Ambien turbo DNA free в соответствии с инструкциями производителя для удаления любых загрязнений ДНК. Теперь, когда экстракция РНК завершена, я передам общую РНК Йоханне, которая выполнит первый и второй этапы удаления рРНК.

Спасибо, Рейчел. Чтобы начать удаление рРНК, осторожно перемешайте и кратко центрифугируйте 10-кратный реакционный буфер для выделения мРНК перед использованием; в стерильной, свободной от РНК пробирке объемом 0,5 мл смешайте соответствующие объемы 10-кратного реакционного буфера, ингибитора РНК, образца общей РНК и терминаторной экзонуклеазы. Согласно протоколу Epicentre, инкубируйте реакционную смесь при 30 °C в течение 60 минут в термоциклере с подогреваемой крышкой или на водяной бане.

Затем остановите реакцию с помощью фенол-этанольного осаждения: сначала добавьте безнуклеазную воду к РНК до общего объема 200 µL, а затем добавьте один объем раствора фенола и хлороформа в соотношении 1:1 к мРНК и центрифугируйте. Соберите водную фазу, после чего осадите её 100% этанолом и солью. На этом этапе пробу можно заморозить.

РНК можно хранить при температуре -80 °C до момента использования образца в последующих анализах. После завершения первого этапа обогащения мРНК мы воспользуемся наборами Ambien microbe enrich и microbe express в соответствии с инструкциями производителя, чтобы удалить из образца остаточную рРНК. Для облегчения удаления эукариотической рРНК будет использован набор microbe enrich.

Все объемы определяются в соответствии с инструкциями производителя. Для начала работы пипеткой перенесите 300 µL связывающего буфера в пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте от 5 до 100 µg общей РНК в максимальном объеме 30 µL и перемешайте на вортексе.

Осторожно добавьте 2 µL смеси захватывающих олигонуклеотидов, рассчитанных на 5 µg РНК, в буфер для связывания и аккуратно постучите по пробирке. Кратковременно центрифугируйте смесь. Денатурируйте смесь при 70 °C в течение 10 минут, после чего инкубируйте её при 37 °C в течение одного часа.

Во время этой инкубации подготовьте олигонуклеотидные магнитные частицы, промыв их один раз в воде, свободной от нуклеаз, и один раз в связывающем буфере, фиксируя частицы на магнитном штативе между промывками. Храните частицы на льду и доведите их до комнатной температуры. За пять минут до использования нагрейте промывочный раствор до 37 °C в термоблоке.

Добавьте смесь олигонуклеотидов для захвата РНК к промытым магнитным бусинам с олигонуклеотидами, аккуратно перемешайте содержимое пробирки и центрифугируйте. Кратковременно инкубируйте смесь при 37 °C в течение 15 минут. Поместите пробирку в магнитный штатив и подождите около трех минут, после чего аспирируйте супернатант, содержащий мРНК, и перенесите его в пробирку для сбора на льду.

Затем добавьте 100 µL предварительно нагретого промывочного раствора к захваченным бусинам. Осторожно перемешайте бусины на вортексе и сберите супернатант. Перенесите этот супернатант, содержащий mRNA, в пробирку для сбора на льду.

Поместите пробирку для сбора на лед, готовясь к удалению прокариотической рРНК с помощью набора ambi microbe express, который мы будем использовать для удаления остаточной прокариотической рРНК. Используйте биоанализатор или систему Experion для проверки наличия контаминации рРНК и оценки качества мРНК. На этом этапе процесс можно приостановить.

РНК можно хранить при температуре -80 °C. После удаления рРНК мы воспользуемся набором Ambien message AMP two bacteria согласно инструкции производителя для амплификации мРНК. Теперь, когда у нас есть чистый образец мРНК, я передам ход эксперимента Марии, которая подробно расскажет вам об амплификации мРНК и синтезе кДНК.

Спасибо, Ханна. Прежде чем приступить к амплификации мРНК, рассчитайте объемы каждого компонента мастер-миксов набора Ambien message AMP two bacteria онлайн; затем мы начнем полиаденилирование матричной РНК, поместив до 1000 nanograms общей РНК в стерильную микроцентрифужную пробирку, свободную от РНКаз. Используйте 6.5 microliters образца и не добавляйте воду, свободную от РНКаз, в первый буфер для синтеза РНК посредством инвитро-транскрипции.

Рекомендуется использовать гибридизационный печь или инкубатор ввиду обеспечения равномерной температуры. Поскольку крайне важно исключить образование конденсата внутри пробирок, мы настоятельно рекомендуем проводить инкубацию реакции транскрипции in vitro в течение 14 часов. Для максимизации выхода РНК и достижения наивысшего выхода РНК проводите IBT в конечном объеме реакции 40 µL; храните РНК при температуре -80 °C в аликвотах примерно по 10 µL.

После амплификации РНК наступает этап синтеза комплементарной ДНК (кДНК). Для синтеза кДНК из РНК используется набор Promega universal ribot Clone cDNA synthesis system. В инструкции к набору приведено руководство по конверсии 2 µg РНК в кДНК. Мы рекомендуем использовать от 6 до 10 µg РНК, соответственно масштабируя объемы реакций.

Очистите кДНК, используя осаждение этанолом или систему очистки ДНК Promega Wizard. Согласно инструкциям производителя, храните образцы при температуре -80 °C. На данном этапе двухцепочечную кДНК можно подвергнуть прямому секвенированию. Из 10 литров морской воды мы экстрагировали примерно 10 мкг экологической РНК и амплифицировали ее в 20 раз; путем конверсии амплифицированной мРНК была получена достаточная كمколичество двухцепочечной кДНК для секвенирования и анализа экологических транскриптов. Мы только что продемонстрировали вам способ оценки экспрессии генов в морских микробных сообществах с помощью экологической метатранскриптомики.

Всегда помните, что при выполнении данной процедуры мРНК быстро деградирует, а РНКа присутствуют повсюду. Поэтому соблюдайте стандартные меры предосторожности для работы в среде, свободной от РНКа, и обрабатывайте образцы максимально быстро. На этом всё.

Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.