Анализ экспрессии генов из морских микробных сообществ использованием экологических транскриптомику

Эта процедура начинается со сбора морской микробной биомассы из проб воды путем предварительной фильтрации через фильтры с пятью и тремя микрометрическими фильтрами с последующим сбором на фильтре 0,22 микрометра. Затем общая РНК экстрагируется из организмов, удерживаемых на фильтре 0,22 микрометра. Наша РНК удаляется из общей РНК путем селективной ферментативной деградации и субтрактивной гибридизации, обогащенный Mr.N, амплифицируется линейно через полиА-хвост и транскрипцию in vitro.

Затем амплифицированная антисмысловая РНК преобразуется в двухцепочечную CD NA с помощью случайного гексамера. Полученный CD NA может быть клонирован и секвенирован или непосредственно пиросеквенирован. Здравствуйте, я Рэйчел Перски из лаборатории доктора Марианны Моран на факультете морских наук Университета Джорджии.

Сегодня мы покажем вам процедуру изучения экспрессии генов в образцах окружающей среды. Использование метатранскриптомики окружающей среды. Скотт Гиффорд покажет вам, как обрабатывать образцы окружающей среды для сбора РНК.

Я покажу вам, как извлечь РНК из образцов и RIN Johanna. AON продемонстрирует удаление РНК. Затем Мария Коста пройдет этапы амплификации РНК и синтеза CD NA.

Итак, приступим. Чтобы начать сбор РНК из окружающей среды, мы настраиваем систему фильтрующих линий, помещая один конец трубки в воду на желаемую глубину для отбора проб, а противоположный конец подключаем к трехмикрометровому фильтру большого объема, помещая насос между двумя концами трубки. Затем трехмикрометровый фильтр подключается к фильтрующей башне 0,22 микрометра, и отток направляется из башни 0,22 микрометра в градуированный груз.

Пропустите через систему несколько литров воды для промывки. По окончании отсоедините трубку от воды во время работы насоса, чтобы удалить оставшуюся воду из трубопровода. Затем с помощью щипцов поместите фильтр 0,22 микрометра на фильтровальную башню и закройте ее.

Поместите конец лески обратно в воду и включите насос. Дайте воздуху очиститься от обоих фильтров и контролируйте объем отфильтрованной воды с помощью тележки. После того, как нужный объем будет отфильтрован, удалите трубопровод из воды и удалите оставшуюся воду из системы.

Как только фильтр высохнет, быстро снимите верхнюю фильтрующую пластину и сложите фильтровальную бумагу. Поместите фильтр в вихревой пакет и защелкните в жидком азоте. Прежде чем мы начнем эксперимент, важно отметить, что, поскольку РНК распространены повсеместно, а мРНК быстро разлагаются, необходимо соблюдать стандартные меры предосторожности для работы в среде, свободной от рибонуклеазы, включая рабочие поверхности и пипетки.

Учитывая это, при работе с любыми материалами, используемыми в этой процедуре, следует надевать чистые перчатки. А образцы должны быть обработаны в максимально сжатые сроки. Чтобы начать экстракцию общей РНК из фильтра 0,22 мкм, мы готовим пробирки для бусин, добавляя восемь миллилитров буфера RLT с добавлением бета-метоэтанола в коническую пробирку объемом 50 миллилитров.

Затем добавляется один-два миллилитра шариков РНК из мобильного набора для извлечения грунта. Быстро достаньте замороженный фильтр из морозилки и сохраните его в мировом пакете. Разбейте его молотком.

Добавьте разбитый фильтр в подготовленную коническую пробирку объемом 50 миллилитров и запечатайте крышку пробирки вихревым скотчем на 10 минут. Затем центрифугируйте 50-миллилитровую пробирку при 5 000 об/мин в течение одной минуты. При комнатной температуре удалите как можно больше лизата и переложите его в пробирку объемом 15 миллилитров, прежде чем снова центрифугировать в течение пяти минут.

При 5000 умноженных на G надосадочная жидкость затем переносится в новую 50-миллилитровую пробирку и к лизату добавляется один объем 100% этанола. Используя шприц объемом 10 миллилитров, протяните лизат через иглу 18-21 калибра и пропустите его обратно около пяти раз. На последующих этапах экстракции используйте KaiGen R и простой мини-набор, следуя инструкциям производителя, нанося лизат на прилагаемую колонку либо с помощью вакуумного коллектора, либо с помощью повторного центрифугирования.

Количественное определение полного спектра РНК фотометрическим методом. После определения общего выхода РНК мы используем набор Ambien turbo DNA free в соответствии с инструкциями производителя для удаления любых загрязнений ДНК. Теперь, когда экстракция РНК завершена, я собираюсь передать всю РНК Джоанне, которая проведет первый и второй этапы удаления РНК.

Спасибо, Рэйчел. Чтобы начать удаление РРНК, осторожно перемешайте и кратковременно центрифугируйте мРНК только в 10 раз реакционный буфер перед использованием в стерильной свободной от РНК пробирке объемом 0,5 миллилитра, смешайте соответствующие объемы 10-кратного ингибитора реакционного буфера РНК, образца общей РНК и экзонуклеазы терминатора. Согласно протоколу эпицентра, инкубировать реакцию при температуре 30 градусов Цельсия в течение 60 минут в амплификаторе с подогреваемой крышкой или на водяной бане.

Затем завершите реакцию с осаждением фенолаэтанола, сначала добавив свободную от РНК воду в общий объем 200 микролитров, а затем добавив один объем раствора фенолхлороформа один к одному в центрифугу для мРНК. Соберите водную фазу, а затем осадите со стопроцентным этанолом и ударьте. Это потенциальный пункт остановки.

РНК может храниться при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока образец не будет готов к использованию в последующих приложениях. После того, как мы завершим первое обогащение мРНК, мы будем использовать наборы Ambien microbe enrich и microbe express в соответствии с инструкциями производителя для удаления любых остатков РРНК из нашего образца. Чтобы облегчить удаление эукариотической РРНК, мы будем использовать набор для обогащения микробов.

Все объемы определяются путем прочтения инструкции производителя. Для начала пипетки 300 микролитров связывающего буфера в 1,5 миллилитровую пробирку. Добавьте от пяти до 100 микрограммов общей РНК в максимальном объеме 30 микролитров и сделайте вихрь.

Аккуратно добавьте два микролитра смеси capture oligo на пять микрограммов РНК в связывающий буфер и осторожно постучите по пробирке. Кратковременно раскрутите смесь. Денатурируйте смесь при температуре 70 градусов Цельсия в течение 10 минут, а затем опустите смесь на колени при температуре 37 градусов Цельсия на один час.

Во время этой инкубации подготовьте шарики oligo mag, промыв их один раз в воде, не содержащей нуклеаз, и один раз в буфере для связывания, и захватывая бусины на магнитной подставке между промывками. Храните бусины на льду и прогревайте их до комнатной температуры. За пять минут до использования нагрейте раствор для стирки до 37 градусов Цельсия в термоблоке.

Добавьте олигосмесь для захвата РНК в промытые шарики oligo mag, закопайте, аккуратно перемешайте в тюбике и отжмите. Кратковременно инкубируйте смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. Поместите пробирку в магнитную подставку и подождите около трех минут, прежде чем аспирировать содержащую мРНК надосадочную жидкость, а затем перенести ее в сборную пробирку на льду.

Далее добавьте к захваченным бусинам 100 микролитров предварительно подогретого раствора для стирки. А аккуратно вихревыми захватами бусин и восстановлением надосадочной жидкости дуры. Это надосадочная жидкость с Mr.NA в пробирке для сбора на льду.

Поместите пробирку для сбора на лед во время подготовки к удалению прокариотической RРНК с помощью набора ambi microbe express, который мы будем использовать для удаления остаточного прокариотического, RRNA. Используйте биоанализатор или Experion для проверки на загрязнение РРНК и МРТ. Качество NA. Это потенциальный пункт остановки.

РНК может храниться при температуре минус 80 градусов Цельсия. После удаления РРНК мы будем использовать набор Ambien message AMP two bacteria kit в соответствии с инструкциями производителя для амплификации нашей мРНК. Итак, теперь, когда у нас есть чистый образец мРНК, я передам эксперимент Марии, которая проведет вас через амплификацию мРНК и синтез CDNA.

Спасибо, Ханна. Прежде чем мы начнем амплификацию мРНК, рассчитаем объемы каждого компонента Ambien message AMP two bacteria kit master mixes online, мы начинаем полиаденилирование матричной РНК, помещая до 1000 нанограммов общей РНК в стерильную микропробирку без свободной РНК. Используйте 6,5 микролитров образца и без свободной РНК воды в первом буфере для синтеза РНК с помощью транскрипции in vitro.

Рекомендуется использовать гибридизационные печи или инкубаторы из-за их равномерной температуры. И поскольку чрезвычайно важно, чтобы внутри труб не образовывался конденсат, мы настоятельно рекомендуем 14-часовую инкубацию реакции транскрипции in vitro. Чтобы максимизировать выход РНК для получения наивысшего выхода А РНК, проводите IBT в конечном объеме реакции 40 микролитров для хранения РНК А при отрицательных 80 градусах Цельсия в количествах примерно 10 микролитров.

Как только РНК амплифицируется, наступает время синтеза комплементарной или CDNA. Универсальный рибо Promega Clone. Комплект системы синтеза CDNA используется для синтеза CD NA из NA. В наборе есть инструкции по преобразованию двух микрограммов, NA в CD NA. Мы рекомендуем вводить от 6 до 10 мкг НК и соответствующим образом масштабировать реакции.

Очистите CD NA с помощью осаждения этанола или системы очистки ДНК promega wizard. Согласно инструкции производителя, хранить образцы при отрицательных 80 градусах Цельсия двухцепочечная КДНК может быть непосредственно секвенирована на этом этапе из 10 литров морской воды, мы извлекли примерно 10 микрограммов РНК окружающей среды и амплифицировали в 20 раз за счет преобразования амплифицированной МРТ. NA и двухцепочечные CDNA были получены в достаточном количестве материала для секвенирования и анализа транскриптов окружающей среды. Мы только что показали вам, как оценить экспрессию генов морских микробных сообществ с помощью метатранскриптомики окружающей среды.

Всегда помните, что при выполнении этой процедуры мРНК быстро разрушается, а РНК распространены повсеместно. Поэтому примите стандартные меры предосторожности для работы в среде без ядер ребер и обрабатывайте образцы как можно быстрее. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.