Homing гемопоэтических клеток в костном мозге

Хоуминг — это явление, при котором трансплантированные гемопоэтические клетки попадают в костный мозг реципиента. В данной статье описан протокол изучения самонаведения кроветворных клеток на соответствующие участки в костном мозге. Путем выделения интересующей популяции клеток, окрашивания этой популяции красителем и введения их в кровоток животного-реципиента.

Процент клеток, положительных на краситель у животного, определяется через определенный период времени. С помощью этого метода можно сравнить эффективность хоуминга этих клеток от двух генетически различных животных. Здравствуйте, меня зовут RHI Рин Юсеф, и я являюсь научным сотрудником лаборатории доктора Дэвида Скаддена в Центре регенеративной медицины Массачусетской больницы общего профиля и Гарвардском институте стволовых клеток.

Сегодня мы покажем вам процедуру изучения хоуминга гемопоэтических стволовых клеток в костный мозг, где они обычно находятся. Мы используем этот протокол в нашей лаборатории для изучения различий между хоумингом гемопоэтических стволовых клеток от различных генетически измененных мышей. Итак, приступим.

Чтобы начать эксперимент по хоумингу, мы извлекаем костный мозг как из WT, так и из лизофосфатидного рецептора one или LPA R one. Все рассечения мышей должны проводиться в колпаке для культуры тканей с ламинарным потоком, особенно если клетки будут пересажены животному-реципиенту. Для вскрытия сначала поместите вкладыш на нижнюю часть капюшона. Затем поместите на вкладыш инструменты для препарирования, в том числе пару автоклавов, щипцы и острые ножницы, стерильный одноразовый скальпель и спиртовые свопы.

Далее в вытяжке помещается бутылка с модифицированной стерильной PBSA, шестилуночной пластиной, ступкой и пестиком, конической трубкой объемом 50 куб. см с синей крышкой и одноразовым фильтром. После эвтаназии, опосредованной CO2, стерилизовали тело мыши в 70% изопропаноле в течение пяти секунд, чтобы предотвратить загрязнение интересующих клеток. В случае с шерстью мыши, похоже, этот шаг не ставит под угрозу выход клеток или экспериментальные результаты.

После стерилизации мыши с помощью щипцов и острых ножниц сделайте небольшой надрез в брюшной части кожи мыши над животом. Далее с помощью рук растяните кожу. Кожа должна отслаиваться от задних конечностей.

Легко извлекайте бедренную и большеберцовую кости осторожно, чтобы предотвратить смещение головки бедренной кости. Так как в нем содержится большое количество костного мозга. Затем отделите верхние конечности от туловища животного, просто применяя к ним вытяжение, сохраняя туловище неподвижным.

При этом верхние конечности удаляются как единое целое. Извлеките гумовый глаз из этих верхних конечностей. Собранные кости поместите в модифицированный PBS в шесть луночных планшетов, помеченных для образцов WT.

Повторите это вскрытие для мышей с KO и соберите в шестилуночный планшет с модифицированным PBS, на этот раз помеченным для образцов KO. После завершения вскрытия утилизируйте тушки мышей и поместите новый вкладыш в капот. Затем очистите кости с помощью одноразового скальпеля.

Поместите очищенные кости в ступку по одной мышке за раз. Сегодня мы начали с образцов WT. Добавьте в ступку два миллилитра модифицированного PBS и измельчите кости с помощью пестика.

Сначала раздробите кости, двигая пестиком вперед и назад 10 раз. Далее измельчите кости круговыми вращательными движениями. Вы сделаете серию из 50 движений по часовой стрелке, а затем 50 движений против часовой стрелки.

После первого подхода из 50 круговых движений переведите жидкость из раствора в фильтр 70 микрометров, расположенный сверху на конической трубке объемом 50 миллилитров. Не забудьте добавить в раствор два миллилитра PBS. После каждой передачи фильтра это предотвратит высыхание костей и приведет к апоптозу клеток.

Как только материал в растворе станет белым, перенесите оставшийся в фильтре материал обратно в раствор и снова начните измельчение. Это гарантирует, что ячейки в фильтре не будут потрачены впустую. Повторите серию круговых движений один или два раза, чтобы материал в растворе стал белого цвета, что указывает на завершение экстракции.

Повторите эту процедуру для образцов с мыши. Не переживай. Остальная часть протокола гораздо менее трудоемка.

Для сбора в центрифуге отдельных образцов WT и KO в конических пробирках со скоростью 1200 об/мин в течение 10 минут отсасывают супернатин с помощью отдельных аспираторных пипеток для каждой пробирки. Далее добавьте в каждую гранулу два кубических метра стерильного, буфер для лизиса CK и инкубируйте на льду. В течение пяти минут добавьте h CCC модифицированного PBS в каждую пробирку.

Затем возьмите по 10 микролитровых проб из каждой пробирки и поставьте пипеткой в две отдельные лунки. В 96 лунке планшет четко маркирован WT и kko. Поместите пробирки в центрифугу и вращайте их со скоростью 1200 об/мин в течение 10 минут.

Пока трубки вращаются, добавьте 30 микролитров трианового синего красителя и 60 микролитров модифицированного PBS в каждую лунку 96-луночного планшета с интересующими клетками. Смешайте клетки и хорошо умирайте, пипетируя вверх и вниз. Снимите пробирки с центрифуги и восстановите.

Суспензируйте клетки в PBS без кальция, магния или L-глутамина в концентрации 20 миллионов клеток на миллилитр. Это часто составляет в среднем около пяти миллилитров объема для образцов WT и KO. Чтобы пометить клетки, добавьте в каждую пробирку краситель для окрашивания клеток до конечной концентрации в пять микромоляров.

Вортекс сразу же в течение 10 секунд после красителя хорошо перемешивают с образцами. Выдерживают при температуре 37 градусов в течение 10 минут и не допускают воздействия света. Далее заполните трубки обычным PBS, а не модифицированным PBS и крутите в течение 10 минут.

При 1200 об/мин продолжайте использовать эту PBS, а не модифицированную PBS С этого момента. После центрифугирования аспирируйте супернатин и ресуспендируйте клетки в PBS при концентрации 40 миллионов клеток на миллилитр. Загрузите 500 микролитров в один кубический шприц с иглой 27 калибра.

Пять шприцев для мышей WT и пять шприцев для мышей K. Накройте шприцы фольгой, чтобы глаз с красителем не распался. Введите 500 микролитров клеточной смеси каждому животному-реципиенту, которое было облучено девятью серыми цветами облучения за 4-24 часа до инъекции.

Наличие наготове дополнительного шприца может помочь, так как инъекции хвоста могут быть сложной задачей. Через восемь часов после инъекции извлекают костный мозг из задних конечностей каждого животного-реципиента. Следующий процесс, костный мозг, предварительно проводится с использованием донорских образцов.

Резус суспендирует клетки каждого животного в одном кубическом сантиметре PBS и подсчитывает популяцию клеток с помощью гемоцитометра. Наконец, проанализируйте образцы на двухпоточном цитометре LSR от BD или аналогичного прибора. Мы только что показали вам, как провести анализ гемопоэтических стволовых клеток.

Количество клеток, которые вы выбираете для введения мышам-реципиентам, краситель, который вы используете для окрашивания этих клеток, и время, в которое реципиенты пожертвовали, — все это переменные, которые должны быть определены заранее. Прежде чем вы проведете эксперимент, ваш вопрос и гипотеза определят выбор этих переменных. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.