Микроинъекции Xenopus ооцитов Laevis

Микроинъекция цитов Opus Lavu с последующей электронной микроскопией с тонким срезом является отличной системой для изучения нуклеоцитоплазматического транспорта. В этом эксперименте ооциты дефолиируются коллагеназой, а также отбираются циты шестой стадии и помещаются в многолуночную чашку. Затем в циты вводят микроинъекцию ядерного импортного субстрата после инкубации цитов при комнатной температуре, чтобы позволить субстрату проникнуть в ядро.

Циты фиксируются и рассекаются. Расчлененные циты встраиваются в низкоплавкие арос, снова фиксируются тетраоксидом осмия, обезвоживаются и погружаются в эпоксидную смолу. Залитые эпоксидной смолой образцы разрезаются с помощью ультрамикротома, и срезы помещаются на медную сетку для образцов.

После окрашивания срезы визуализируются под просвечивающим электронным микроскопом. Здравствуйте, я Сара Коэн из лаборатории доктора Нелли Пейн на факультете зоологии Университета Британской Колумбии. Меня зовут Шелли Оу, я тоже из лаборатории Panta.

Сегодня мы покажем вам процедуру микроинъекции цитов Zenap Lavis. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения ядерного импорта таких грузов, как вирусы. Итак, приступим.

Чтобы начать эксперимент, поместите небольшой кусочек около двух сантиметров яичника Zenap Lavis в коническую трубку объемом 50 миллилитров, содержащую 20 миллилитров раствора коллагеназы. Коллагеназа удаляет фолликулярные клетки, которые окружают циты, затем помещает трубку на платформу шейкера и осторожно взбивает со скоростью 100 оборотов в минуту в течение 30 минут. Это время варьируется в зависимости от количества коллагеназы.

Поэтому через час возьмите небольшой образец цитов и рассмотрите его под препарирующим микроскопом. Правильно. Дефолиированные циты должны быть хорошо отделены друг от друга. Вставьте стеклянную иглу в цитиру, чтобы убедиться, что она легко вставляется.

Если циты недостаточно дефолиированы, оставьте их в растворе коллагеназы и проверяйте снова каждые пять минут. Как только циты будут достаточно дерегулированы, промойте их три раза модифицированным солевым раствором и перенесите в 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую MBS плюс 1% пенициллина стрептомицина. С помощью препарирующего микроскопа выберите зрелые циты шестой стадии для микроинъекции.

Эти циты большие с хорошим контрастом между черным животным полушарием и кремовым растительным полушарием. Перенесите зрелые клетки шестой стадии в многолуночную чашку. Для этого используйте пипетку объемом 200 микролитров с наконечником пипетки, который был обрезан на конце, чтобы обеспечить беспрепятственное отсасывание ооцитов, и осторожно перенесите ооциты в многолуночный колодец.

Мы используем чашку без микролунок с объемом 10 микролитров, участки ЭО теперь готовы к микроинъекции. Подготовьте импортный субстрат для микроинъекций, добавив один микролитр 1%-ного фенолового синего брома на 10 микролитров субстрата. Краситель brom fol blue добавляет визуализацию микроинъекции.

Затем поместите небольшую полоску параформа на чашку Петри диаметром 100 миллиметров и нанесите каплю раствора для инъекций объемом пять микролитров на полоску парама. Затем получите иглу для инъекции, вытащив микропипетку Drummond объемом 6,6 микролитра с помощью инъекции плюс Matt Puller Откалибруйте иглу для инъекций, сделав точечные метки на игле через каждые 0,5 миллиметра, что соответствует объему 50 нанолитров. Установите микроинъектор в режим аспирации и заполните иглу инъекционным раствором для цитоплазматического введения.

Вставьте кончик иглы в цит в растительном полушарии, очень близко к полушарию животного под углом примерно 45 градусов. Затем поверните настройку микроинъектора на микроинъекцию и сделайте микроинъекцию в каждый цит 50 нанолитров импортного субстрата. Следите за точками на игле, чтобы контролировать количество введенного субстрата после завершения инъекций.

Перенесите циты в 35-миллиметровую чашку Петри, заполненную MBS. Инкубируйте циты при комнатной температуре в течение нужного количества времени. Выберите временные точки, которые позволяют наблюдать за импортным субстратом, связанным с ядерно-бедными комплексами или NPC.

Обычно мы используем временные точки от 10 до 30 минут для белков и вирусов, которые активно транспортируются к NPC. Эти временные точки также зависят от места инъекции и размера белка вируса. Когда инкубация завершена, переносим циты в стеклянный флакон объемом четыре миллилитра, содержащий 2% глутаральдегида в MBS и фиксируем на ночь при четырех градусах Цельсия на следующий день, трижды промываем циты MBS, теперь мы готовы к препарированию цитов.

Перенесите циты в небольшую чашку Петри, наполненную буфером с низким содержанием соли. С помощью препарирующего микроскопа и препарирующего пинцета удалите растительный столб из каждой ооциты. Полезно стабилизировать ооцит с помощью одной пары пинцетов, в то время как другая пара используется как ножницы для удаления вегетального полюса, этот этап вскрытия значительно облегчает поиск ядра при обрезке и срезе образцов для электронной микроскопии.

На этом этапе наличие синего оттенка в цитозоле указывает на успешную микроинъекцию и отбрасывание цитов, которые не были успешно введены в микроинъекции. Далее снова зафиксировать рассеченные циты 2%-ным глутаральдегидом в LSB в течение одного часа при комнатной температуре после фиксации, трижды промыть рассеченные циты LSB. После того, как циты промыты, мы готовы подготовить введенные ооциты к их встраиванию и тонкому срезу.

Перенесите рассеченные ооциты на углубительное горло, отасуньте как можно больше жидкости, а затем действуя быстро, чтобы они не пересохли. Покройте рассеченные циты аросом с низким содержанием таяния 2%, пока арос еще мягкий. С помощью наконечника пипетки отделите циты друг от друга и убедитесь, что каждая клетка направлена либо вверх, либо вниз, но не боком.

Дайте агросу застыть около 10 минут. Как только агрос застынет, используйте лезвие бритвы, чтобы разрезать его на небольшие кусочки, каждая из которых содержит одну рассеченную циту. Затем поместите встроенные циты aros в стеклянный флакон объемом четыре миллилитра и с помощью вращающегося миксера зафиксируйте их 1%-ным тетраоксидом осмия в LSB на один час при комнатной температуре.

После фиксации в течение одного часа при необходимости трижды промойте образец в LSB. Храните образец при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи и продолжайте протокол на следующий день. Последовательно обезвоживайте образцы в 50% 70% и 90% этаноле в течение 20 минут каждый, затем дважды обезвоживайте в 100% этаноле в течение 15 минут каждый.

Наконец, обезвоживайте образцы 100% ацетоном в течение 15 минут после завершения этапов обезвоживания. Инфильтрируйте образцы смесью эпона, флуа и ацетона один к одному в течение одного часа, затем инфильтрируйте смесью эпона и ацетона два к одному в течение двух часов и, наконец, в чистый эпон в течение не менее шести часов. Когда заключительный этап инфильтрации будет завершен, поместите образцы в плоские формы для встраивания, наполненные свежим, чистым эпоном.

Ориентируйте циты таким образом, чтобы сторона ядра, расположенная ближе к месту инъекции, была рассечена. Первый. В этом случае сторона цитов, которая была рассечена, будет рассечена. Во-первых, этот шаг оптимизирует вероятность визуализации импорта выбранной подложки.

После того, как циты будут правильно ориентированы, полимеризуйте эпон в течение двух дней при температуре 60 градусов Цельсия. После этапа полимеризации с помощью ультрамикротома получите срезы эпоксидных залитых образцов толщиной 50 нанометров. Соберите срезы на медной сетке для образцов, окрасьте образцы и визуализируйте их под просвечивающим электронным микроскопом.

Если протокол прошел успешно, то ядерная оболочка и NPC должны быть хорошо видны на эм микрофотографиях. В зависимости от инъецируемого субстрата и промежутка времени между инъекцией и фиксацией, субстрат должен быть виден на цитоплазматической поверхности NPC в NPC или на ядерной поверхности NPC. Этот репрезентативный результат показывает поперечное сечение ядерной оболочки с прилегающей цитоплазмой и ядром из цита зенапа, в который были введены капсиды вируса вао.

Стрелки A-C-M-N-P-V указывают на NPC, а капсид, стыкующийся на цитоплазматической поверхности NPC, обозначен белой стрелкой. Для сравнения, на этом рисунке показано поперечное сечение ядерной оболочки с прилегающей цитоплазмой и ядром ооцита Зенапа, в который был введен вирус парвовируса мышей. Используя эту методику, мы обнаружили, что MVM вызывает разрушение ядерной оболочки.

Скобками обозначены разрывы в ядерной оболочке. Стрелки указывают на NPC, а предполагаемые капсиды MVM, связанные с ядерной оболочкой, обозначены белыми стрелками. Мы только что показали вам, как делать микроинъекции и препарировать циты xap levu.

При проведении этой процедуры важно помнить, что разные партии коллагеназы различаются. Поэтому тщательно проверяйте свою коллагеназу, чтобы определить оптимальное время для дефолиации. Кроме того, после дефолиации и промывки MBS циты могут храниться при температуре четыре градуса Цельсия в течение одной недели перед микроинъекцией.

Наконец, всегда держите ягодицы такими, чтобы спрятаться на льду, и никогда не позволяйте осине высохнуть. Они должны быть полностью погружены в воду на всех этапах обезвоживания и инфильтрации. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.