ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Мы благодарим Дэвида Theilmann (Тихий Agri-Food Research Centre, Summerland, Британская Колумбия) за предоставление бакуловирус AcMNPV и полезные обсуждения. Эта работа была поддержана грантами от Канады Фонд инноваций (CFI), канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR), Майкл Смит фонда исследований в области здравоохранения (MSFHR), и естественным наукам и инженерным исследованиям Совета Канады (NSERC) .

Часть 1: Подготовка ооцитов Xenopus для микроинъекции <ol><li> Место небольшой кусочек (около 2 см) яичников Xenopus laevis в 50-мл коническую трубку, содержащую 20 мл коллагеназы решения (5 мг / мл коллагеназы в кальции без солевых изменение Барта: 88 мМ NaCl, 1 мМ KCl, 0,82 мМ MgSO 4, 10 мМ HEPES, рН 7,5). Коллагеназа используется для удаления фолликула клетками, которые окружают ооцитов. </li><li> Поместите пробирку на платформе шейкера и рок-это мягко (при 100 оборотов в минуту) в течение одного часа. На этот раз меняется в зависимости от разных партий коллагеназы. Таким образом, после одного часа, взять небольшой образец ооцитов и рассмотреть их под микроскопом вскрытии. Правильно де-folliculated ооцитов должна быть хорошо отделены друг от друга, и она должна быть легкой, чтобы вставить стекло иглы в ооцит. Если ооцитов не являются достаточно де-folliculated, они остаются в коллагеназы решение и вновь проверяется каждые пять минут. </li><li> Вымойте ооцитов три раза физиологическим раствором изменение Барта (MBS: 88 мМ NaCl, 1 мМ KCl, 0,82 мМ MgSO 4, 0,33 мМ Ca (NO 3) 2, 0,41 мМ CaCl 2, 10 мМ HEPES, рН 7,5), и передавать их к 100-мм диаметра чашки Петри содержащие MBS плюс 1% пенициллина / стрептомицина. Ооциты готов к microinjected. Если микроинъекции будут выполняться на другой день, хранить ооцитов при 4 ° С не более одной недели. </li><li> Использование рассекает микроскоп, выберите зрелой стадии VI ооцитов для микроинъекции. Эти ооциты большие, с хорошим контрастом между черным полушарии животного и сливочного цвета растительного полушарии. </li><li> Передача зрелых ооцитов VI этап в тарелку микролуночные (Nunc, 10 мкл и объема). Это должно быть сделано тщательно, используя 200-мкл пипетки с пипетки, разрезанные на конце, чтобы бесперебойное всасывания ооцитов. </li></ol> Часть 2: Микроинъекция ооцитов Xenopus <ol><li> Подготовка импорт субстрат microinjected путем добавления небольшого количества 1% бромфенол синий, для оказания помощи в визуализации микроинъекции. Например, мы добавляем 1 мкл бромфенол синего до 10 мкл субстрата. </li><li> Место небольшую полоску парафильмом на 100-мм блюдо диаметром Петри, и обойтись без 5-мкл каплю раствора для инъекций по парафильмом полосы. </li><li> Заполнить ранее калиброванный инъекционной иглой (полученные путем вытягивания 6,6 мкл микропипетки Драммонд с Inject + Matic Puller) с решением для инъекций. Для этого microinjector установлен на стремлении режима. Для калибровки инъекционной иглой делают точка знаки на иглу каждые 0,5 мм, что соответствует объемом 50 NL. </li><li> Для цитоплазматической инъекции, вставить кончик иглы в ооцит в вегетативного полушария, очень близко к животным полушарии, на примерно 45-градусный угол. Включите настройку microinjector к microinject и microinject каждого ооцита с 50 п импорта подложки. Точка знаки на иглы используются для мониторинга количества субстрата, который был вводили. </li><li> Передача вводят ооцитов в небольшой (35-мм в диаметре) чашки Петри заполнены MBS, и инкубируют при комнатной температуре в течение необходимого количества времени (временные точки выбираются так, чтобы наблюдение импорта подложки связанные с НПС; это происходит от 10 до 30 минут для белков и вирусов, которые активно транспортируются к NPC, на этот раз также зависит от места инъекции и размер белка / вируса). </li><li> При инкубации завершения передачи ооцитов в 4-мл стеклянный флакон, содержащий 2% глутаральдегида в MBS, и исправить течение ночи при 4 ° C. </li></ol> Часть 3: Препарирование ооцитов Xenopus <ol><li> На следующий день, мыть ооциты 3 раза с MBS. </li><li> Передача ооцитов в небольшой чашке Петри заполнены с низким буфера соли (LSB: 1 мМ KCl, 0,5 мМ MgCl 2, 10 мМ HEPES, рН 7,5). Использование рассекает микроскопа и рассекает пинцет, удалите вегетативного полюса друг от яйцеклетки. Это полезно для стабилизации ооцитов будучи расчлененным с одним пинцетом, а другая пара используется как ножницы для удаления растительного полюса. На этом этапе можно оценить успех микроинъекции наличием синий оттенок в цитозоле. Протокол продолжаться только в течение ооцитов, которые были microinjected успешно. Кроме того, если образцы должны быть готовы к Е. М., это рассечение шаг делает его гораздо проще найти ядра при обрезке и срезов образцов. </li><li> Fix расчлененный ооцитов снова с 2% глутаральдегида в LSB в течение одного часа при комнатной температуре. </li><li> После фиксации, мыть расчлененный ооцитов три раза с LSB. </li></ol> Часть 4: Подготовка Injected ооцитов для вложения и тонких Секционирование EM <ol><li> Передача расчлененный ооцитов к депрессии слайда. Аспирируйте столько жидкости, как позваны, а затем быстро (чтобы они не высыхают) охватывают расчлененный ооциты с 2% легкоплавких агарозы. Хотя агарозном еще мягкие, используйте пипетки на отдельные ооциты друг от друга, и обеспечить, чтобы каждый ооцит лицевой стороной вверх или вниз (а не вбок). </li><li> Разрешить агарозном закрепить в течение приблизительно 10 минут. После агарозном затвердевает, используйте лезвие, чтобы разрезать агарозы на мелкие кусочки, каждый из которых содержит один расчлененный яйцеклетки. </li><li> Место агарозном встраиваемый ооцитов в 4-мл стеклянный флакон, и после их исправить с 1% OsO 4 в LSB в течение одного часа при комнатной температуре. </li><li> Промыть образец три раза в LSB. При необходимости, хранить образцы при температуре 4 ° С в течение ночи и продолжают протокола на следующий день. </li><li> Последовательно обезвоживают образцов в восходящей серии алкоголя (50, 70 и 90% этанола в течение 20 минут каждый). Далее следуют два изменения в 100%-ным этанолом в течение 15 минут каждый. Наконец обезвоживают образцы со 100%-ным ацетоном в течение 15 мин. </li><li> Проникнуть образцов смеси 1:1 Epon (Fluka) и ацетона в течение одного часа, после чего инфильтрат с 2:01 смесь Epon и ацетона в течение двух часов, и, наконец, в чистом Epon в течение не менее шести часов. </li><li> Место образцы в плоских форм вложения заполнены свежей чистой Epon. Ооцитов ориентированы таким образом, что стороны ядра ближе к инъекции - в этом случае стороны ооцитов, которые были расчлененные - будет секционного в первую очередь. Этот шаг оптимизирует возможность визуализации импорта выбраны подложки. </li><li> Наконец, полимеризуются Epon в течение двух дней при 60 ° C. </li><li> Для того чтобы представить образцы, блоки отделаны, а затем секционного использованием ультрамикротоме. Разделы переносятся на сетках Е.М., окрашенных с использованием стандартных процедур и визуализированы с просвечивающего электронного микроскопа. Мы не будем показывать это часть протокола, как это стандартная процедура EM. </li></ol> Часть 5: Представитель Результаты: Если протокол был успешным, то ядерная оболочка (NE) и НПС должны быть четко видны в ЭМ микрофотографии. В зависимости от введенного субстрата и количества времени между введением и фиксации, субстрат должен быть виден во цитоплазматических лицо NPC, в NPC, или, по крайней ядерной лица NPC. На рисунке 1 показано Н. Е. сечения с прилегающей цитоплазмой (с) и ядра (п) из ооцитов Xenopus, которая была введена с капсиды из бакуловирус AcMNPV, инкубировали при 4 ° С в течение четырех часов, и обработанные для вложения и шлифе EM, как описано. Стрелки указывают на NPC. Капсида док на цитоплазматических лицо NPC указывает белая стрелка. В отличие от этого, на рисунке 2 показано Н. Е. сечения с прилегающей цитоплазмой (с) и ядра (п) из ооцитов Xenopus, которые были введены с Вирус парвовирус Минута Мыши (MVM), выдерживают при комнатной температуре в течение четырех часов, и обработаны для вложения и тонкий срез EM, как описано. Используя эту технику, мы обнаружили, что MVM вызывает нарушения NE (Коэн и Panté, 2005). Скобки указывают на перерывы в NE. Стрелки указывают на NPC. Предполагаемые капсиды MVM связанные с Н. Е. обозначены белыми стрелками. <img src="/files/ftp_upload/1106/1106_fig1.png" alt="Рисунок 1" width="600" height="459" /> Рисунок 1: Электронная микрофотография NE сечения с прилегающей цитоплазмой (с) и ядра (п) из ооцитов Xenopus, которая была введена с капсиды из бакуловирус Ас MNPV, инкубировали при 4 ° С в течение четырех часов, и обрабатываемых в вложения и тонкий срез EM, как описано. Стрелки указывают на NPC. Капсиды обозначены белыми стрелками. Шкала бар: 100 нм. <img src="/files/ftp_upload/1106/figure2.png" alt="Рисунок 2" width="600" height="264" /> Рисунок 2: Электронная микрофотография NE сечения с прилегающей цитоплазмой (с) и ядра (п) из ооцитов Xenopus, которые были введены с Вирус парвовирус Минута Мыши (MVM), выдерживают при комнатной температуре в течение четырех часов, и обработаны для вложения и тонкий срез EM, как описано. Стрелки указывают на NPC. Скобки указывают на перерывы в NE. Предполагаемые капсиды MVM связанные с Н. Е. обозначены белыми стрелками. Шкала бар: 100 нм.

<ol><li>Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+intact+Xenopus+oocytes+in+nucleocytoplasmic+transport+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies.</a> Methods Mol. Biol. 322, 301-314 (2006).</li>
<li>Panté, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pore+complex+is+able+to+transport+macromolecules+with+diameters+of+about+39+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (2), 425-434 (2002).</li>
<li>Rabe, B., Vlachou, A., Panté, N., Helenius, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+import+of+hepatitis+B+virus+capsids+and+release+of+the+viral+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nuclear import of hepatitis B virus capsids and release of the viral genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (17), 9849-9854 (2003).</li>
<li>Cohen, S., Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pushing+the+Envelope%3A+Microinjection+of+MVM+into+Xenopus+oocytes+causes+damage+to+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Pushing the Envelope: Microinjection of MVM into Xenopus oocytes causes damage to the nuclear envelope.</a> J. Gen. Virol. 86 (12), 3243-3252 (2005).</li>
<li>Panté, N., Jarmolowski, A., Izaurralde, E., Sauder, U., Baschong, W., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+nuclear+export+of+different+classes+of+RNA+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Visualizing nuclear export of different classes of RNA by electron microscopy.</a> RNA. 3, 498-513 (1997).</li>
</ol>

Микроинъекция ооцитов Xenopus в сочетании с тонкими секционирования EM является весьма эффективным инструментом для изучения nucleocytoplasmic транспорта. Эта система была использована для перевода различных шагов импорта через NPC, например, взаимодействие ядерных подложки импорта со структурными компонентами NPC, таких как цитоплазматических и ядерных нитей корзине (обзор Panté, 2006). Он также был использован для изучения ядерных импорт ядерного репликацию вирусов (Panté и Канн, 2002; Рабе и др., 2003;.<...

Микроинъекции xenopus ооцитов laevis

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Микроинъекции Xenopus laevis ооциты затем тонких срезов электронной микроскопии (ЭМ) является отличной системой для изучения nucleocytoplasmic транспорта. Из-за своего большого ядра и высокой плотности ядерного комплексов пор (НПС), перевозка ядерного материала может быть легко визуализированы в ооцитов Xenopus. Многое понимание механизмов ядерного импорта и экспорта был накоплен за счет использования этой системы (см. обзор Panté, 2006). Кроме того, мы использовали микроинъекции ооцитов Xenopus препарировать ядерной пути импорта из нескольких вирусов, которые воспроизводят в принимающей ядра. Здесь мы показываем, микроинъекции цитоплазмы ооцитов Xenopus с ядерным субстратом импорта. Мы также показываем, подготовка ооцитов вводили для визуализации на тонких срезов EM, в том числе рассечение, обезвоживание, и вложение ооцитов в смоле вложение эпоксидной смолы. Наконец, мы предоставляем представителя результаты для ооцитов, которые были microinjected с капсида из бакуловирус Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) или вирусов парвовирус Минута Мыши (MVM), а также обсудить возможности применения техники.

Здесь мы показываем, цитоплазматические микроинъекции<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Ооцитов с ядерным субстратом импорта, а также подготовка ооцитов вводили для визуализации на тонких срезов электронной микроскопии.

Микроинъекции Xenopus ооцитов Laevis

Микроинъекция ооцитов Xenopus laevis с последующей электронной микроскопией (ЭМ) с получением тонких срезов представляет собой отличную систему для изучения нуклеоцитоплазматического ...

Микроинъекция ооцитов Opus Lavu с последующей электронной микроскопией тонких срезов представляет собой отличную систему для изучения нуклеоцитоплазматического транспорта. В данном эксперименте ооциты подвергают дефолиации с помощью коллагеназы, после чего отбирают ооциты шестой стадии и помещают их в многолуночный планшет. Затем в ооциты проводят микроинъекцию субстрата ядерного импорта, после чего ооциты инкубируют при комнатной температуре, чтобы субстрат мог проникнуть в ядро.Клетки фиксируют и препарируют. Препарированные клетки заливают в низкоплавкий агар, повторно фиксируют тетраоксидом осмия, дегидратируют и заключают в эпоксидную смолу. Образцы, залитые в эпоксидную смолу, нарезают на ультрамикротоме, и полученные срезы помещают на медную сетку для электронного микроскопического исследования.После окрашивания срезы визуализируют с помощью просвечивающего электронного микроскопа. Здравствуйте, я Сара Коэн из лаборатории доктора Нелли Пане на факультете зоологии Университета Британской Колумбии. Я Шелли Оу, также из лаборатории Пане.Сегодня мы продемонстрируем процедуру микроинъекции в клетки Xenopus laevis. Мы используем этот метод в нашей лаборатории для изучения ядерного импорта таких грузов, как вирусы. Итак, приступим.Для начала эксперимента поместите небольшой фрагмент яичника Zenap Lavis длиной около двух сантиметров в коническую пробирку объемом 50 миллилитров, содержащую 20 миллилитров раствора коллагеназы. Коллагеназа удаляет фолликулярные клетки, окружающие циты; затем поместите пробирку на платформу шейкера и осторожно встряхивайте при 100 RPM в течение 30 минут. Это время может варьироваться в зависимости от различных партий коллагеназы.Спустя один час возьмите небольшой образец цитов и исследуйте их под стереомикроскопом. При правильной дефолиации циты должны быть хорошо отделены друг от друга. Введите стеклянную иглу в цит, чтобы убедиться, что она входит легко.Если циты недостаточно дефолиированы, оставьте их в растворе коллагеназы и проверяйте состояние каждые пять минут. Как только циты будут достаточно дерегулированы, промойте их трижды модифицированным барным физраствором и перенесите в чашку Петри диаметром 100 мм, содержащую MBS с добавлением 1% пенициллина-стрептомицина. С помощью диссекционного микроскопа отберите зрелые циты шестой стадии для микроинъекции.Эти ооциты крупные, с хорошим контрастом между черным животным полюсом и кремового цвета растительным полюсом. Перенесите ооциты на зрелой шестой стадии в многолуночный планшет. Для этого используйте дозатор на 200 µL с наконечником, конец которого обрезан для обеспечения беспрепятственного всасывания ооцитов, и осторожно перенесите ооциты в лунки планшета.Мы используем планшет с микролунками, объем каждой из которых составляет 10 µL. Теперь участки EO готовы к микроинъекции. Подготовьте субстрат для микроинъекции, добавив 1 µL 1% бромфенолового синего к 10 µL субстрата. Краситель бромфеноловый синий позволяет визуализировать процесс микроинъекции.Затем поместите небольшую полоску парафильма в чашку Петри диаметром 100 миллиметров и нанесите каплю раствора для инъекции объемом 5 µL на полоску парафильма. Далее изготовьте инъекционную иглу, используя микропипетку Drummond объемом 6,6 µL и вытягиватель Matt Puller. Калибруйте инъекционную иглу, нанося на нее метки через каждые 0,5 мм, что соответствует объему 50 nL. Переведите микроинъектор в режим аспирации и заполните иглу раствором для цитоплазматической инъекции.Введите кончик иглы в цитоплазму клетки в вегетативном полушарии, максимально близко к анимальному полюсу, под углом примерно 45 градусов. Затем переведите микроинъектор в режим инъекции и введите в каждую клетку 50 нанолитров импортируемого субстрата. Следите за метками на игле, чтобы контролировать объем введенного субстрата по завершении инъекций.Перенесите клетки в чашку Петри диаметром 35 мм, заполненную MBS. Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение необходимого времени. Выберите временные интервалы, позволяющие наблюдать за импортом субстрата, связанного с ядерными поровыми комплексами или NPC.Обычно для белков и вирусов, которые активно транспортируются к NPC, используются временные точки от 10 до 30 минут. Эти временные интервалы также зависят от места инъекции, а также от размера белка или вируса. По завершении инкубации перенесите клетки в стеклянный флакон объемом 4 мл, содержащий 2% глутаральдегида в MBS, и зафиксируйте их в течение ночи при температуре 4 °C. На следующий день трижды промойте клетки MBS; после этого можно приступать к препарированию клеток.Перенесите ооциты в небольшую чашку Петри, наполненную низкосолевым буфером. С помощью диссекционного микроскопа и диссекционного пинцета удалите вегетативный полюс каждого ооцита. Рекомендуется стабилизировать ооцит одним пинцетом, в то время как вторым пинцетом, подобно ножницам, удаляют вегетативный полюс; этот этап диссекции значительно облегчает поиск ядра при подрезке и секционировании образцов для электронной микроскопии.На данном этапе появление синего оттенка в цитозоле указывает на успешную микроинъекцию; клетки, в которые микроинъекция не была проведена успешно, следует удалить. Далее повторно зафиксируйте диссецированные клетки 2% glutaraldehyde в LSB в течение одного часа при комнатной температуре. После фиксации трижды промойте диссецированные клетки раствором LSB. После промывки ооциты, подвергшиеся инъекции, готовы к заливке и подготовке тонких срезов em.Перенесите препарированные ооциты на предметное стекло с лункой, максимально удалите жидкость аспирацией, а затем действуйте быстро, чтобы клетки не высохли. Покройте препарированные клетки 2% низкоплавким агарозом, пока он еще мягкий. С помощью наконечника пипетки разделите клетки друг от друга и убедитесь, что каждая клетка расположена либо лицевой стороной вверх, либо вниз, но не боком.Дайте агарозе затвердеть в течение примерно 10 минут. После затвердевания агарозы с помощью лезвия бритвы разрежьте ее на маленькие кусочки, в каждом из которых находится одна диссекированная клетка. Затем поместите клетки, встроенные в агарозу, в стеклянный флакон объемом 4 мл и, используя роторный смеситель, зафиксируйте их 1% осмием тетраоксидом в LSB в течение одного часа при комнатной температуре.После фиксации в течение одного часа при необходимости трижды промойте образец в LSB. Храните образец при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи и продолжите выполнение протокола на следующий день. Последовательно дегидратируйте образцы в 50%, 70% и 90% этаноле по 20 минут в каждом растворе, затем проведите дегидратацию дважды в 100% этаноле по 15 минут.В завершение обезвоживают образцы в 100% ацетоне в течение 15 минут. После завершения этапов обезвоживания образцы инфильтруют смесью Epon, Fluaviation и ацетона в соотношении 1:1 в течение одного часа, затем смесью Epon и ацетона в соотношении 2:1 в течение двух часов и, наконец, в чистом Epon не менее шести часов. По окончании последнего этапа инфильтрации образцы помещают в плоские формы для заливки, заполненные свежим чистым Epon.Ориентируйте ооциты таким образом, чтобы срезов была сторона ядра, расположенная ближе к месту инъекции. В этом случае будет срезана та сторона ооцитов, которая подверглась диссекции. Этот этап оптимизирует вероятность визуализации импорта выбранного субстрата.После правильной ориентации клеток полимеризуйте эпон в течение двух дней при температуре 60 °C. После этапа полимеризации с помощью ультрамикротома получите срезы толщиной 50 nm из образцов, залитых эпоксидной смолой. Соберите срезы на медную подложку для ЭМ, окрасьте образцы и визуализируйте их с помощью просвечивающего электронного микроскопа.Если протокол был выполнен успешно, ядерная оболочка и NPC должны быть четко видны на электронных микрофотографиях. В зависимости от введенного субстрата и времени, прошедшего между введением и фиксацией, субстрат должен быть виден на цитоплазматической стороне NPC, внутри NPC или на ядерной стороне NPC. Этот репрезентативный результат демонстрирует поперечный срез ядерной оболочки с прилегающей цитоплазмой и ядром клетки zenap, в которую были введены капсиды вируса vao.Наконечники стрелок A-C-M-N-P-V указывают на NPC, а белая стрелка указывает на капсид, пристыкованный к цитоплазматической стороне NPC. Напротив, на данном рисунке представлен поперечный разрез ядерной оболочки с прилегающей цитоплазмой и ядром ооцита zenap, в который был введен парвовирус мышей. Используя этот метод, мы обнаружили, что MVM вызывает нарушения целостности ядерной оболочки.Скобки указывают на разрывы ядерной оболочки. Наконечники стрелок указывают на ядерные поры (NPC), а предполагаемые капсиды MVM, связанные с ядерной оболочкой, отмечены белыми стрелками. Мы только что продемонстрировали вам способ микроинъекции и диссекции xap levu cytes.При выполнении данной процедуры важно помнить, что свойства коллагеназы могут варьироваться от партии к партии. Поэтому тщательно протестируйте используемую коллагеназу, чтобы определить оптимальное время дефолиации. Кроме того, после этапов дефолиации и промывки в MBS клетки можно хранить при температуре four degrees Celsius до одной недели перед микроинъекцией.Наконец, всегда держите ваши блоки в охлажденном состоянии и ни в коем случае не допускайте пересыхания тканей. Они должны быть полностью погружены в среду на всех этапах дегидратации и инфильтрации. На этом всё.Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Xenopus эмбрионального эпителия являются идеальной системой модель для изучения ячейки поведения, таких как развитие полярности и изменением формы во время эпителиальных морфогенеза. Традиционные гистологии основных образцов все чаще дополняется жить-клеточной конфокальной микроскопии. Здесь мы показываем, методы, чтобы изолировать лягушки тканей и визуализировать жить эпителиальных клеток и их цитоскелета с использованием живых-клеточной конфокальной микроскопии.

Live-камера и цифровой обработки изображений Количественный анализ эмбриональных эпителиальных клеток в Xenopus laevis</em

Культивирование нейронных эксплантов от...

Нейронных культур эксплантов от<em&gt; Xenopus Хепориз</em

Мы описываем методы манипулирования незрелыми ооцитами Xenopus laevis, созревание яйцеклеток in vitro до яйцеклеток и интрацитоплазматическую инъекцию сперматозоида. Этот протокол допускает деградацию некоторых материнских белков и сверхэкспрессию генов, представляющих интерес при оплодотворении, и, следовательно, является ценным для изучения роли специфических факторов в раннем эмбриональном развитии.

Манипуляция и<em&gt; In Vitro</em&gt; Созревание<em&gt; Xenopus Laevis</em&gt; ооциты, а затем внутриклеточное инъекции сперматозоида в целях изучения эмбрионального развития

Контроль синтеза белка происходит в основном на этапе инициации трансляции, дефицит которого связан с различными нарушениями. Чтобы лучше понять их этиологию, мы описали здесь протокол с использованием ооцитов Xenopus laevis, оценивающий трансляцию транскрипта mos в присутствии мутанта фактора инициации трансляции eIF4G1.

Xenopus Laevis как модель для идентификации перевода Обесценение

Рукопись здесь предоставляет простой набор методов для анализа секрецию и распространение флуоресцентно меченых лигандов в Xenopus. Это обеспечивает контекст для тестирования на способность других белков, чтобы изменить распределение лиганда и позволяет эксперименты, которые могут дать представление о механизмах, регулирующих морфогена градиенты.

Использование конфокальной Анализ<em&gt; Xenopus Laevis</em&gt; По расследованию модуляторы Wnt и Shh морфогена градиентов

Мы описываем систему ооцитов Xenopus и колпачков животных для экспрессии клонирования генов, способных вызывать ответ в компетентной эктодерме, и обсуждаем методы последующего анализа таких генов. Эта система полезна для функциональной идентификации широкого спектра генных продуктов.

Функциональная Клонирование Использование<em&gt; Xenopus</em&gt; Ооцитов выражение системы

Здесь мы представляем протокол использования карт судьбы и трассировщиков линий для целевых инъекций в отдельные бластомеры, которые дают начало почке эмбрионов Xenopus laevis.

Методика Целевой показатель микроинъекции к проявляющему<em&gt; Xenopus</em&gt; почки

Описаны оптимизированные процедуры выделения одиночных фолликулов, микроинъекций цитоплазматической РНК, удаления окружающих клеточных слоев и экспрессии белков в ооцитах Xenopus. Кроме того, представлен простой метод быстрой смены раствора в электрофизиологических экспериментах с лиганд-зависимыми ионными каналами.

Xenopus ооциты: Оптимизированные методы микроинъекции, Удаление тироцит слоев и быстрые изменения в Решение электрофизиологических экспериментов

В этой статье описывается усовершенствование традиционной флюорометрии с напряжением (VCF), в которой вместо малеимидных красителей используются флуоресцентные неестественные аминокислоты (fUAA), чтобы исследовать структурные перестройки в ионных каналах. Процедура включает в себя инъекцию ДНК ооцита Xenopus, совместную инъекцию РНК / fUAA и одновременные измерения тока и флуоресценции.

Флуорометрия с фиксацией напряжения в<em&gt; Xenopus</em&gt; Ооциты с использованием флуоресцентных неестественных аминокислот

Этот протокол призван продемонстрировать, как микровимизм ДНК / DOTAP смесь в глазные будни одного дня старый Xenopus laevis эмбрионов, и как изображение и реконструировать отдельные зеленые флуоресцентные белки (GFP), выражая оптические аксональные арборы в тектальных средних мозгов нетронутыми, живые головастики Xenopus.

Микроинъекция ДНК в глазные будни в Xenopus laevis Эмбрионы и изображения GFP Экспрессинг Оптические аксональные беседки в Intact, живые Ксенопус Tadpoles

Здесь мы представляем протокол для экспрессии белков щелевого перехода в ооцитах Xenopus и регистрации соединительного тока между двумя аппозированными ооцитами с использованием коммерческого усилителя, предназначенного для двойной записи напряжения-зажима ооцитов в режиме измерения высокого бокового тока.

Запись тока перехода разрыва от ооцитов Ксенопуса

Изучите микроинъекцию ооцитов Xenopus laevis с последующей ультратонкой резкой для визуализации ядерного импорта методом электронной микроскопии. Этот подход позволяет исследовать механизмы транспорта через ядерную оболочку.

Микроинъекции Xenopus ооцитов Laevis

Больше видео