Микроинъекция мРНК и Олигонуклеотиды морфолино антисмысловых в данио рерио эмбрионов.

Эта процедура начинается с получения морфо- и транскрибируемой in vitro капсульной мРНК. Микропипетка заполняется путем сифона раствора, содержащего морфо, а объем инъекции затем калибруется с помощью микрометра на одноклеточном этапе. Затем эмбрионы рыбок данио собираются и помещаются в камеру для микроинъекций желтка.

Рабочий раствор вводится в желток чуть ниже клетки и с помощью цитоплазматических движений разносится раствор для микроинъекций в клетку. Вводите раствор в цитоплазму клетки после инъекций. Инкубируйте эмбрионы при температуре 28,5 градусов Цельсия в трех средних температурах E и оценивайте фенотипы, представляющие интерес на последующих стадиях.

Здравствуйте, я Шайло Юэнь из лаборатории, сын доктора Саши и заведующий кафедрой генетики в Медицинской школе Йельского университета. Сегодня мы продемонстрируем надежную технику микроинъекции для проведения исследований сверхэкспрессии мРНК и нокдауна гена морфоолигонуклеотидов у рыбок данио. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения роли S. cilium при кистозных заболеваниях почек.

Итак, приступим. Одним из эффективных подходов к изучению функции генов является микроинъекция транскрибируемой РНК in vitro в эмбрионы рыб данио. В этой демонстрации мы будем микроинъекции транскрипта, помеченного EGFP, и использовать экспрессию GFP живого целого эмбриона в качестве видимого считывания для успешной инъекции.

Во-первых, мы проведем реакцию транскрипции РНК in vitro на интересующем вас транскрипте. В нашей лаборатории мы регулярно вводим интересующий нас A-C-D-N-A в вектор PC два плюс и выполняем реакцию синтеза in vitro большого количества кэпированной РНК с помощью набора M message M machine SP six. Далее мы очистим образец РНК, пропустив его через простой мини-набор RN или экстракцией фенолхлороформа и осаждением изопропанола.

Тщательно определите концентрацию препарата РНК и храните ее при температуре минус 80 градусов Цельсия до готовности к применению в день инъекции. Слегка разморозьте вихрь образца РНК и кратковременно поверните вниз. Теперь приготовьте рабочий раствор со стерильной водой и конечной концентрацией от 0,025 до 0,05%фенолового красного, феноловый красный служит видимым маркером для введения раствора в эмбрион.

Здесь мы приготовим рабочий раствор 100 нанограмм на микролитр мРНК EGFP с 0,05% фенола красного. Наконец, держите рабочий образец на льду и верните запас РНК до минус 80 градусов по Цельсию. Приступайте к приготовлению морфо, когда будете готовы к введению этого образца.

Антисмысловые олигонуклеотиды Морино широко используются для модификации экспрессии генов путем блокирования трансляции целевого белка или модификации prem NA. Сплайсинг морфос у рыб данио служит мощным инструментом обратной генетики, сбивая функцию генов. Здесь мы введем микро-олиго, направленное на сайт трансляционной инициации pkd two. Мы обычно используем 300 М морфо-олиго, специально разработанного для интересующего нас гена, полученного от ООО «Генные инструменты».

Затем мы добавляем 100 микролитров стерильной воды, чтобы получить трехмиллимолярный исходный раствор, а затем аликвотируем раствор и храним при температуре минус 20 градусов Цельсия до готовности к использованию в день инъекции. Нагреваем раствор морино до 65 градусов Цельсия в течение пяти минут. Затем мы сразу же охлаждаем раствор на льду и кратковременно вращаем: этот шаг денатурирует все вторичные структуры в олиго и обеспечивает полное растворение раствора.

Далее мы приготовим рабочий раствор, разведя раствор Morpho в стерильной воде и доведя концентрацию от 0,025 до 0,05% пинального красного. В этой демонстрации мы будем готовить рабочий раствор 0,5 миллимолярного PKD two morino с 0,05% фенола красного. Держите рабочий раствор при комнатной температуре и приступайте к наполнению микропипеткой, когда будете готовы к введению этого образца.

Для начала нам нужно изготовить микропипетки, которые будут использоваться для инъекций. Это делается путем нагрева и вытягивания капиллярных трубок из силикатного стекла BOS в полярном устройстве с микропипеткой. После того, как иглы вытащены, их хранят в чашке Петри поверх небольшого количества глины или клейкой ленты.

Далее мы подготовим пластины камеры микровпрыска, залив 1,5%aros в одну XE три средние пластины, отформованные клиновидными желобами. Это послужит простым методом удержания эмбрионов во время инъекции. Затем пластинам агрокамеры дают застыть и хранят при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока они не будут готовы к использованию.

Начало наполнения микропипеткой. Разрежьте дистальный конец с помощью щипцов или лезвия хирургической бритвы, чтобы создать отверстие, которое будет видно только под препарирующим микроскопом при 50-кратном увеличении. Далее поместите два микролитра вашего рабочего раствора.

В качестве капли на защитную крышку прикрепите заднюю часть микропипетки к пятимиллилитровому шприцу, оснащенному трубкой на игле для подкожных инъекций, и слегка погрузите дистальный конец микропипетки в каплю рабочего раствора. Будьте осторожны, чтобы не сломать кончик микропипетки. Сифоньте рабочий раствор через дистальный конец микропипетки, потянув за поршень шприца.

Далее мы откалибруем объем впрыска микропипетки. Поместите каплю минерального масла на предметное стекло и включите питание и подачу воздуха к импульсному микроинжектору аппарата давления. Затем прикрепите микропипетку к держателю микропипетки микроинъекторного аппарата.

Микроинжектор регулируется давлением, а разряды активируются нажатием на ножную педаль под микроскопом диссекции. Проверьте объем впрыска с помощью микроинжектора, чтобы нанести каплю рабочего раствора на микрометрическое масло. Измерьте диаметр капли, так как она плавает в виде сферы на поверхности масла.

Отрегулируйте продолжительность и давление инъекции, чтобы тщательно откалибровать объем инъекции. Этот шаг способствует воспроизводимости эксперимента с микроинжекцией. В этой демонстрации все микроинъекции будут делаться с диаметром капли 0,15 миллиметра.

Наконец, после калибровки объема инъекции используйте ручку удержания на микроинъекторе, чтобы предотвратить обратное заполнение и утечку микропипета. Теперь пришло время подготовить эмбрионы данио-рерио. Рыбки данио-рерио случайным образом спариваются, в первые несколько часов каждого утра, чтобы начать подготовку, собирают эмбрионы на стадии одной клетки и помещают их в одну среду XE three.

С помощью трехмиллилитровой пипетки для переноса расположите эмбрионы вдоль клиновидных желобов в пластинах камеры микроинъекций. Уберите среду так, чтобы зародыши были неглубокими, погруженными и не затопленными. Этот этап способствует оседанию эмбрионов на дно желоба, а также проникновению микропипетки в корион.

Теперь приступим к инъекциям. Сначала мы будем манипулировать эмбрионами с помощью микропипетки так, чтобы цитоплазма эмбриона одной клеточной стадии была видна под микроскопом. Следите за тем, чтобы не сломать кончик микропипетки, проникнуть в корион, а затем в желток с помощью микропипетки, чтобы ввести эмбрион

В этой демонстрации мы сначала проведем микроинъекцию в желток, расположенный непосредственно под клеткой, и позволим цитоплазматическому и диффузионному введению рабочего раствора в клетку. Этот поток заметен благодаря добавленному в рабочий раствор фенольному красному цвету. Так как это одноклеточный эмбрион, его можно вводить от руки или с помощью манипулятора.

Мы также продемонстрируем прямую инъекцию в цитоплазму клетки. Прямая микроинъекция в клетку более надежна, но требует много времени, так как требуется правильная ориентация эмбриона и техника микроинъекции. Поскольку клеточная мембрана более прочная, чем мембрана желтка, часто быстрее проникает в микропипетку через желток, чтобы добраться до клетки.

Цитоплазма, ориентирующая полюс животного к дну желоба и работающая твердыми руками, может помочь в этом методе инъекции. После микроинъекции поместите эмбрионы в чашку Петри со средой Е три и инкубируйте их при температуре 28,5 градусов Цельсия для нормального развития. В течение следующих нескольких часов и дней развития эмбриона наблюдайте за эмбрионами на предмет интересующих вас фенотипов.

Чтобы проверить успешность микроинъекции, мы будем контролировать экспрессию GFP в развивающихся эмбрионах, начиная со стадии щита, с помощью флуоресцентной микроскопии всего эмбриона in vivo. Экспрессия конструкции наиболее сильна на ранних этапах эмбрионального развития и часто снижается во время развития. По мере введения кэпированной РНК постепенно разрушается и зависит от стабильности экспрессируемого белка. Основываясь на ранее опубликованных результатах, мы ожидаем, что два морфина PKD будут имитировать кривизну дорсальной оси тела, обнаруженную у двух мутантных рыбок данио-рерио PKD, и присутствовать кисты почек примерно через два-три дня после оплодотворения.

Мы только что показали вам надежную технику микроинъекции для проведения исследований сверхэкспрессии мРНК и нокдауна гена морфооолигонуклеотида у рыбок данио. Помните, что это важно. Вводите твердой рукой. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.