Микроинъекции данио рерио Эмбрионы для анализа функции гена
9 марта 2009 г.
Это видео показывает, как морфолино или мРНК может быть введен в данио эмбрионов на один-клеточной стадии для уменьшения или увеличения уровня специфических генных продуктов в течение последующего развития.
Самцов и самок zebrafish скрещивают в специальной клетке для разведения, в которой оплодотворенные икринки оседают на дно, что позволяет легко их собрать. Затем икринки выстраивают в ряд в чашке Петри вдоль предметного стекла микроскопа. После этого кончик заполненной инъекционной иглы обрезают и настраивают параметры инъекции таким образом, чтобы объем вводимого болюса соответствовал требуемому значению при измерении микрометром.
Наконец, яйца вводятся по одному по очереди. Здравствуйте, я Джонатан Розен из лаборатории Джона МА на кафедре кардиологии Детской больницы Бостона. А я Майкл Суини, также из лаборатории VY.
Сегодня мы продемонстрируем, как вводить мРНК или морфолино в эмбрионы zebrafish. В нашей лаборатории мы используем эту процедуру для изучения эффектов нокдауна или гиперэкспрессии продуктов конкретных генов. Итак, приступим.
Для начала, накануне инъекции, необходимо подготовить аквариумы для содержания и разведения рыб, установив в них разделители для увеличения общего количества полученных икринок. При желании рыб можно расселять в соотношении две самки на одного самца. На следующее утро, после включения освещения в помещении, из нескольких аквариумов следует извлечь разделители и оставить рыб примерно на 20 минут для беспрепятственного спаривания. С помощью сита соберите икру из нерестовых садков и промойте ее водой для икры, после чего перенесите в чашку Петри.
С помощью яичной воды рыб можно перегруппировать в более крупные аквариумы для получения дополнительных порций икры для инъекций. Отрегулируйте время сбора икры так, чтобы получить максимальное количество икринок, не допустив их развития beyond стадии одной клетки. В завершение поместите предметное стекло в перевернутую крышку чашки Петри диаметром 100 миллиметров.
С помощью переносной пипетки расположите икринки вдоль края предметного стекла в один ряд, затем удалите излишки воды с предметного стекла, прижав салфетку Kimwipe к стороне, противоположной икринкам. Далее мы подготовим иглы для микроинъекций с помощью микропуллера. Стеклянный капилляр с внешним диаметром 1 мм вытянут в две иглы, которые затем помещают в чашку Петри диаметром 150 мм. Иглы можно подготовить заранее, разложив их на пандусах из силиконового пластилина.
Мы используем следующие настройки: Heat 6, pole 60, velocity 80. Заполните широкий конец иглы тремя µL инъекционного материала с помощью микропипетки-загрузчика.
Встряхните болюс в сторону кончика иглы, пока не останется всего несколько пузырьков воздуха или они исчезнут совсем. Затем включите источник сжатого воздуха и микроинъектор. Вставьте иглу в микроинъектор и убедитесь в плотности прилегания в корпусе.
Убедитесь, что микроманипулятор находится в подходящем положении, обеспечивающем широкий диапазон перемещения и регулировки. Переместите кончик иглы в плоскость обзора микроскопа. Поднимите его над предметным столиком и сфокусируйтесь на самой тонкой части кончика.
С помощью острого пинцета отщипните кончик иглы так, чтобы она оставалась достаточно узкой для прокола хориона и желтка, но при этом обеспечивала стабильный размер капли. Чтобы рассчитать объем каждой инъекции, поместите каплю минерального масла на микрометр, введите иглу в масло и нажмите на педаль, чтобы ввести каплю раствора в масло. Контролируйте размер капли, подрезая иглу и, при необходимости, регулируя давление инъекции при введении в масло.
Бусина диаметром 0,1 миллиметра содержит 500 пиколитров материала для инъекции. Обычно используются объемы инъекции 500 пиколитров или один нанолитр. Идеальные объемы инъекции должны заполнять примерно 10% объема яйца.
Качество кончика иглы имеет решающее значение как для легкости инъекции, так и для качества и воспроизводимости результатов. Теперь приступайте к процедуре инъекции. Убедитесь, что эмбрионы не развились дальше стадии четырех клеток.
В идеале эмбрион должен находиться на стадии одной клетки. Затем, подведите иглу к колонне яиц, проколите поверхность хориона и одним плавным движением введите ее в желток, контролируя процесс визуально. При любом раздавливании или разрыве желточного мешка введите инъекционный материал в желток.
Избегайте введения пузырьков воздуха и следите за эмбрионами, которые были заметно повреждены в процессе инъекции по мере продвижения по ряду. При необходимости отрегулируйте давление для поддержания постоянного размера капли, и с помощью наконечника пипетки удалите яйца, которые выглядят неоплодотворенными или были разрушены в процессе инъекции. После завершения работы с колонной яиц осторожно промойте инъекционные яйца струей воды для яиц, чтобы переместить их в чистую чашку Петри, и при необходимости повторите процедуру.
Оставьте несколько неинъекционных эмбрионов в качестве контроля. Позже, в течение первого дня, удалите погибшие эмбрионы и запишите количество инъекционных эмбрионов. Периодически заменяйте воду в чашке, чтобы снизить риск инфицирования.
Обратите внимание, что в зависимости от вводимого вещества выживаемость эмбрионов может быть ниже, чем у их неинъецированных сибсов. К счастью, можно легко провести инъекции огромному количеству эмбрионов, поэтому это редко становится проблемой. Теперь мы продемонстрируем репрезентативные результаты инъекций как морфолино, так и мРНК.
Неинъекционный контроль через 48 часов после оплодотворения выглядит нормально, как и ожидалось. Однако эмбрионы, в которые был введен морфолино HG E three i three eeg FFR one, подавляющий экспрессию изоформ HG, содержащих первый из двух EEG-подобных повторов, демонстрируют отек мозга и инъекционный удар в области сердца. Инъекция мРНК heart glass также вызвала выраженный фенотип через 24 часа после оплодотворения.
Головки неинъекционных контрольных образцов выглядели нормально. Напротив, у некоторых эмбрионов, которым вводили M NNA, наблюдалась анофтальмия. Мы только что продемонстрировали, как инъекция морфолино или мРНК на стадии одной клетки может усилить или ослабить экспрессию специфических генов в ходе последующего развития. При выполнении этой процедуры важно помнить об этом.
Высокая концентрация мРНК или морфолино может вызвать неспецифическую летальность эмбрионов с морфолино. Каждый препарат необходимо протестировать эмпирически, однако, как правило, концентрации от 200 до 500 мкМ обеспечивают специфический нокдаун активности гена без общей летальности. На этом все.
Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.
Обзор
В данном видео демонстрируется инъекция морфолино или мРНК в эмбрионы данио-рерио на стадии одной клетки для манипулирования экспрессией генов в процессе развития.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биология развития
- Генетическая манипуляция
Теоретическая часть
- Зебрадани широко используются в качестве модельного организма в биологии развития.
- Методы инъекций позволяют изучать функции и регуляцию генов.
- Манипулирование экспрессией генов может дать представление о процессах развития.
- Бережное обращение с эмбрионами имеет решающее значение для успешного проведения экспериментов.
Цель исследования
- Продемонстрировать технику инъекции мРНК или морфолино в эмбрионы zebrafish.
- Изучить влияние нокдауна или гиперэкспрессии генов на развитие.
- Предоставить протокол для исследователей, заинтересованных в генетических манипуляциях.
Используемые методы
- Разведение данио-рерио и сбор оплодотворенных икринок.
- Подготовка игл для микроинъекций и их заполнение материалом для инъекций.
- Прецизионное введение материала в эмбрионы на стадии одной клетки.
- Мониторинг развития эмбрионов и регистрация результатов.
Основные результаты
- Инъецированные эмбрионы демонстрировали специфические фенотипы в зависимости от используемого материала.
- Контрольные эмбрионы развивались нормально, в то время как у инъецированных наблюдались различные результаты.
- Инъекция морфолино в некоторых случаях приводила к заметному отеку мозга.
- Инъекции мРНК приводили к отчетливым изменениям в развитии.
Выводы
- Данный метод эффективно изменяет экспрессию генов в эмбрионах zebrafish.
- Для достижения успеха необходима тщательная оптимизация параметров инъекции.
- Результаты подчеркивают потенциал этого метода для изучения функций генов.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Микроинъекции в эмбрионы zebrafish позволяют осуществлять быструю и масштабируемую модуляцию экспрессии генов для валидации мишеней на ранних стадиях разработки лекарственных препаратов. Данный метод поддерживает высокопроизводительный фенотипический скрининг, обеспечивая точный нокдаун или гиперэкспрессию специфических генов для оценки функциональных последствий в системе позвоночных. Такой подход позволяет снизить механистические риски, связывая генетические пертурбации с наблюдаемыми фенотипами развития, что дает возможность оценить достоверность мишени и принять решения по приоритизации портфеля проектов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы посредством направленного нокдауна или гиперэкспрессии генов для выяснения роли конкретных сигнальных путей.
- Операционная ценность: обеспечивает быстрое создание моделей с потерей функции (loss-of-function) и приобретением функции (gain-of-function) для снижения рисков при выборе мишеней перед разработкой анализа.
- Прогностическая ценность: способствует биологическому снижению рисков путем установления связи между генетической модуляцией и фенотипическими результатами в релевантной для заболевания системе позвоночных.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: получение стандартизированных генетически модифицированных эмбрионов, пригодных для последующего анализа фенотипа в рамках скрининговых кампаний.
- Практическая ценность: возможность подготовки сотен инъецированных эмбрионов в час, что обеспечивает масштабируемость и воспроизводимость форматов анализа.
- Трансляционная ценность: получение количественных наблюдаемых фенотипов (например, морфологических изменений), которые служат надежными конечными точками для скрининга соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: обеспечивает преемственность от этапа изучения функций генов до доклинической валидации путем моделирования вариантов человеческих генов в контексте позвоночных.
- Операционная ценность: поддерживает принятие решений о продвижении проекта с учетом рисков за счет выявления фенотипов, которые коррелируют с эффективностью модуляции мишени или ее токсичностью.
- Прогностическая достоверность: помогает приоритизировать мишени на основе степени тяжести и специфичности фенотипа, наблюдаемых после инъекции, что снижает количество ложноположительных результатов при идентификации перспективных соединений.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум ранних этапов поиска лекарственных средств, обеспечивая валидацию мишеней посредством генетического воздействия и позволяя перейти к фенотипическому скринингу и идентификации ведущих соединений при наличии наблюдаемых дозозависимых результатов.
- Открывающая биология: способствует проверке гипотез, позволяя точно модулировать экспрессию генов для оценки необходимости и достаточности мишени в путях развития.
- Скрининг: позволяет создавать готовые к анализу биологические системы со стандартизированным генетическим фоном для последовательной оценки соединений.
- Аналитика: обеспечивает количественную оценку фенотипа (например, частоту морфологических дефектов) для сравнения условий и анализа генетических или фармакологических эффектов.
- Трансляционные исследования: связывают генетические манипуляции с фенотипами развития, моделирующими механизмы заболеваний человека, что способствует валидации на основе биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу для итеративного изучения мишеней по нескольким генам и путям в рамках портфельных проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность валидации мишени за счет снижения механистической неопределенности путем прямого генетического воздействия на модели позвоночных.
- Операционная ценность: Обеспечивает высокую воспроизводимость и масштабируемость с возможностью инъектирования сотен эмбрионов в час с использованием стандартизированных протоколов микроинъекций.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует процесс принятия решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go), предоставляя ранние фенотипические доказательства модуляции мишени, что сокращает инвестиции в неперспективные мишени.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию с учетом рисков, связывая ген-специфические фенотипы с результатами развития, что обосновывает распределение капитала при выборе мишеней.
Особенности реализации
- Требуется опыт в разведении zebrafish, работе с эмбрионами и технике микроинъекций для обеспечения жизнеспособности и стабильности результатов.
- Метод зависит от специализированного оборудования, включая микроинъекторы, источники сжатого воздуха, микрометры и вытягиватели игл для точного контроля объема.
- Для получения воспроизводимых результатов необходима стандартизация объема инъекции, качества игл и стадии развития эмбрионов независимо от оператора и места проведения исследования.
- При применении метода для различных генетических линий или моделей заболеваний требуются корректировки для сохранения релевантности фенотипа.
- Существуют практические ограничения, такие как чувствительность эмбрионов к травме при инъекции и концентрационно-зависимые побочные эффекты, что требует эмпирической оптимизации для каждой мишени.
