Мониторинг завод гормонов во время реакции на стресс
15 июня 2009 г.
Простой метод при условии, что дает возможность быстрого извлечения и анализа нескольких гормонов растений из небольшого образца ткани. Процедура использует пар экстракции как торжественные стадии очистки. Все результаты измеряются с помощью ГХ / МС с химической ионизации, которая производит в основном (M +1) + ионов.
Данная процедура начинается с гомогенизации растительного материала с использованием керамических шариков и последующей экстракции дихлорэтаном для получения органической фазы. После центрифугирования образцы высушивают на воздухе и подготавливают к экстракции из газовой фазы. После элюирования фильтров экстракции из газовой фазы можно приступить к анализу растительных гормонов с помощью масс-спектрометрии и газовой хроматографии.
Здравствуйте, я Мари Энгельберг из лаборатории Ю. Энгельберг кафедры биологии Техасского университета в Сан-Антонио, а я — Ю. Энгельберг. Сегодня мы продемонстрируем вам простой метод одновременного количественного определения важных растительных гормонов. Мы регулярно используем этот метод для мониторинга изменений уровня этих гормонов в растениях при воздействии насекомых-вредителей.
Мы также можем отслеживать изменения в составе жирных кислот. Итак, приступим. Для экстракции вам сначала потребуется подготовить два виала с завинчивающимися крышками объемом 2 мл.
Для этого в виалу добавьте 400 µL экстракционного раствора и 10 µL соответствующего внутреннего стандарта в концентрации 10 ng/µL. Затем заморозьте виалы в жидком азоте. После замораживания добавьте в виалы керамические бусины.
Пока флаконы находятся в жидком азоте, добавьте от 50 до 200 milligrams растительного материала. Имейте в виду, что вес добавленного растительного материала необходимо оценить перед дальнейшей обработкой для обеспечения точного количественного определения в дальнейшем, которое основывается на сырой массе. Перед тем как плотно закрыть флакон крышкой, убедитесь, что весь жидкий азот испарился.
Убедитесь, что крышка оснащена резиновым уплотнителем для предотвращения утечки растворителей и экстрагированных соединений во время гомогенизации. Гомогенизируйте ткань в гомогенизаторе с шариками Fast Prep или PSU. Для PSU установите скорость гомогенизатора на 6, 000 и обрабатывайте в течение 30 секунд.
После гомогенизации поочередно извлекайте пробирки из гомогенизатора и осторожно открывайте крышку, чтобы добавить в каждый образец 1 мл дихлорметана; снова плотно закройте пробирки и гомогенизируйте их в течение 10–15 с при 6 000 об/мин. После гомогенизации перенесите пробирки в настольную центрифугу и отделите органическую фазу от водной фазы, центрифугируя при 10 000 ×g в течение 60 с. После разделения фаз перенесите нижний зеленый слой из каждой пробирки в чистую стеклянную пробирку объемом 4 мл.
Это органическая фаза, содержащая гормоны и внутренние стандарты. Избегая переноса воды или верхней фазы, удалите растворитель обдувом воздухом через манифольд в течение примерно 10–25 минут. Продолжительность процесса зависит от образца.
С помощью одного наконечника для обдува осторожно проверьте, высохли ли образцы. Следите за тем, чтобы не пересушить образцы, так как это может привести к потере соединений. После высушивания образцов можно приступать к метилированию соединений, содержащих карбоксильную группу, в наших пробах.
Сначала добавьте в каждый флакон 100 µL смеси диэтилового эфира и метанола в объемном соотношении девять к одному. Затем добавьте 4 µL 2 M раствора триметилдиазометана в гексане. Немедленно закройте флаконы винтовыми крышками с открытым верхом, оснащенными силиконовой септой с тефлоновым покрытием, осторожно встряхните флаконы и инкубируйте при комнатной температуре в течение 25–30 минут.
Включите нагревательный блок и установите необходимую температуру сбора. Летучесть метилированных соединений будет варьироваться в зависимости от их размера и количества полярных групп. Температура может составлять от 80 до 200 °C. После 30 минут инкубации остановите реакцию метилирования, добавив в каждый флакон 4 µL 2 М раствора уксусной кислоты в гексане.
Это делается для того, чтобы избежать нежелательных побочных реакций. Фильтры, используемые для экстракции из паровой фазы, изготавливаются вручную из тефлоновых трубок.
С одной стороны вставляется плотно прилегающая стеклянная трубка длиной около четырех сантиметров. Видны два диска из сетки из нержавеющей стали, которые удерживают около 20–30 mg абсорбента. Промойте фильтры, которые будут использоваться для сбора метилированных и летучих растительных гормонов, используя 200 µl метанола.
Затем дважды промойте фильтры 200 µL дихлорметана. После каждого промывания просушите фильтры на воздухе до полного удаления остатков растворителя. Теперь фильтры можно использовать для улавливания летучих гормонов методом экстракции из газовой фазы.
После инкубации образцов в течение 30 минут резиновые септы крышек четырехмиллилитровых флаконов надрезают скальпелем. Теперь экстрагированный материал готов к сбору растительных гормонов методом экстракции из паровой фазы. Очищенные фильтры подключают к отдельным вакуумным линиям при скорости потока около 800 milliliters per minute.
Затем фильтры вводят в виалу через прорези в септах. Также вводится небольшой наконечник дозатора, который служит отверстием для впуска воздуха. На этом начальном этапе процедуры виалы с вставленными фильтрами необходимо держать в вертикальном положении, чтобы жидкость внутри виалы не соприкасалась с кончиком фильтра, так как это приведет к его загрязнению.
Затем флаконы для ГХ-МС удерживают вручную до полного испарения жидкости через фильтр. После этого флаконы с прикрепленными фильтрами помещают на нагревательный блок, и в течение трех минут собирают термически испаренные соединения. После этого заключительного этапа экстракции из паровой фазы флаконы с закрепленными фильтрами помещают на штатив и дают им остыть.
Когда фильтры достигнут комнатной температуры, подготовьте виалы для ГХ объемом 1.5 milliliter с вставками. Снова введите петлей 150 microliters дихлорэтана в виалы. После выдувания остатков растворителя из фильтра виалы закрывают крышками, после чего они готовы к анализу методом газовой хромато-масс-спектрометрии.
Для анализа используйте газовый хроматограф, оснащенный инжектором с делителем потока, соединенный с масс-спектрометром, работающим в режиме химической ионизации; после ввода соединения разделяют на колонке HP-1MS, выдерживаемой при 40 °C в течение одной минуты. Температурный режим предусматривает подъем температуры со скоростью 15 °C в минуту до 250 °C с выдержкой в течение 10 минут; в качестве газа-носителя используют гелий при постоянном потоке 0,7 мл/мин. Для анализа методом масс-спектрометрии в качестве газа для ХИ могут использоваться как квадрупольный масс-спектрометр, так и масс-спектрометр с ионной ловушкой.
Можно использовать либо изобутан, либо метанол. Однако в каждом случае перед созданием программ подсчета выбранных ионов следует проверить фрагменты реакции ионизации. Мы используем систему газового хроматографа variant GC 3, 900 в сочетании с масс-спектрометром Saturn MS 2200 и метанол в качестве реагента для ХИ.
Описание нашей программы приведено в письменном протоколе. Убедитесь, что все соединения идентифицированы путем сравнения с аутентичными коммерчески доступными стандартами. Количественное определение JA SA и A BA проводится путем сопоставления площади пика извлеченных ионов с площадью пика извлеченных ионов соответствующего внутреннего стандарта и также основывается на сырой массе использованного растительного материала.
После извлечения данных из файлов GCM S и проведения некоторых расчетов мы обнаружили, что этилен вызывал значительное накопление салициловой кислоты, ясмоновой кислоты, а также абсцизовой кислоты по сравнению с необработанным контролем. Данные по каждому отдельному гормону были получены в результате одного анализа, что демонстрирует применимость данного метода для мультиплексного анализа гормонов. Мы представили вам простой, но эффективный метод экстракции и количественного определения важных растительных гормонов и других сигнальных соединений.
Этот метод прост в исполнении, и большинство продемонстрированных инструментов можно легко изготовить из стандартных лабораторных материалов. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен простой метод быстрого извлечения и анализа нескольких растительных гормонов из небольших образцов тканей. В качестве основного этапа очистки в данной методике используется экстракция в паровой фазе с последующим анализом с помощью газовой хроматографии/масс-спектрометрии (GC/MS).
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология растений
- Анализ гормонов
- Масс-спектрометрия
Теоретическая часть
- Понимание действия растительных гормонов имеет решающее значение для изучения роста и реакций растений.
- Традиционные методы экстракции гормонов могут быть трудоемкими и сложными.
- Данный метод упрощает процесс, делая его более доступным для исследователей.
- Газовая хроматография-масс-спектрометрия является мощным инструментом для анализа растительных гормонов.
Цель исследования
- Обеспечить быстрый и эффективный метод экстракции растительных гормонов.
- Обеспечить возможность одновременного количественного определения основных растительных гормонов.
- Позволить исследователям отслеживать гормональные изменения в растениях.
Используемые методы
- Гомогенизация растительного материала с использованием керамических шариков.
- Экстракция органической фазы с помощью дихлорметана.
- Центрифугирование для разделения фаз.
- Экстракция паровой фазы с последующим анализом методом ГХ-МС.
Основные результаты
- Данный метод позволяет эффективно экстрагировать несколько гормонов.
- Результаты демонстрируют эффективность экстракции в газовой фазе.
- Анализ ГХ/МС обеспечивает надежное количественное определение гормонов.
- Эту процедуру можно регулярно использовать для мониторинга гормональных изменений.
Выводы
- Данный метод упрощает экстракцию и анализ растительных гормонов.
- Он подходит для небольших образцов тканей, что делает его универсальным.
- Исследователи могут использовать этот подход для расширения своих исследований реакций растений.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Количественный мониторинг динамики растительных гормонов в условиях стресса имеет решающее значение для валидации мишеней и снижения рисков биологических гипотез в рамках технологических процессов сельскохозяйственной биотехнологии. Данный рабочий процесс на основе ГХ-МС обеспечивает чувствительное мультиплексное измерение жасмоновой кислоты, салициловой кислоты и абсцизовой кислоты, что повышает прогностическую достоверность при изучении путей стрессового ответа. Воспроизводимость и масштабируемость этого метода позволяют использовать его в качестве универсальной платформы для ранних этапов поиска и трансляционных исследований при разработке признаков сельскохозяйственных культур.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Обеспечивает точный количественный анализ колебаний уровня гормонов при стрессе, что позволяет уточнить участие соответствующих сигнальных путей.
- Поддерживает функциональную валидацию генов-кандидатов или мишеней в сетях стрессового ответа.
- Способствует снижению механистических рисков путем разграничения специфических гормональных эффектов и вмешивающихся переменных.
- Обеспечивает непрерывность данных для сортировки портфеля и приоритизации кандидатов на определенные признаки.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение валидированных количественных данных для последующего скрининга генетических или химических модуляторов.
- Стандартизирует протоколы измерения уровня гормонов, что повышает воспроизводимость результатов в разных экспериментах и исследовательских группах.
- Позволяет проводить мультиплексный анализ, увеличивая пропускную способность и эффективность анализа при оценке соединений.
- Поддерживает повторное использование платформы для различных исследований стрессовых ответов в растительных системах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит количественное определение гормонов в соответствие со стратегиями трансляционных биомаркеров для улучшения сельскохозяйственных культур.
- Обеспечивает преемственность от этапа первичного поиска до доклинической валидации признаков стрессоустойчивости.
- Снижает риски при отборе кандидатов за счет предоставления надежных количественных биологических показателей.
- Поддерживает прогностическое снижение рисков при принятии решений о дальнейшем развитии признаков.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод количественного определения гормонов на основе ГХ-МС интегрируется в конвейеры сельскохозяйственных биотехнологий: от этапа первичного поиска до идентификации ведущих соединений и доклинической валидации признаков.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез и уточнению путей регуляции за счет обеспечения временного и пространственного профилирования гормонов.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные результаты для разработки анализов и скрининга соединений.
- Аналитика: обеспечивает высокочувствительные мультиплексные измерения для сравнительного анализа условий стресса.
- Трансляционные исследования: способствует согласованию биомаркеров и обеспечению преемственности на разных этапах исследований.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как стандартизированная масштабируемая платформа для многократного применения в различных исследованиях стресса растений.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность в исследованиях стрессовых реакций.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость рабочих процессов количественного определения гормонов.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет предоставления надежных биологических данных.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию и продвижение кандидатов на признаки сельскохозяйственных культур с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в подготовке проб, работе с ГХ-МС и анализе данных.
- Необходим доступ к оборудованию для гомогенизации, центрифугирования и ГХ-МС.
- Требуется межгрупповая стандартизация внутренних стандартов и протоколов количественного определения.
- Метод adaptable к различным видам растений и типам тканей при условии оптимизации протокола.
- Точность идентификации соединений зависит от наличия аутентичных стандартов.
