Channelrhodopsin2 опосредованная стимуляция синаптические потенциалы в Drosophila Нервно-мышечная переходов

Эта процедура начинается с выращивания дрозофилы. В-третьих, личинки возрастного возраста с соответствующим генотипом на пище, содержащей все транс-ретинолы. Каждый личинок прикалывается с головой и хвостом.

Затем флэт флэт. Затем мозг и задние нервы перерезаются, чтобы остановить ритмичную двигательную активность. Далее синий светодиодный источник света с блоком управления настраивается и фокусируется на препарировании.

Наконец, используйте острый электрод, чтобы пронзить шестую мышцу. Затем подайте световые импульсы с помощью источника напряжения. Здравствуйте, я Николас Марштейн из лаборатории доктора Лесли Гриффита, факультета биологии Университета Брандейса.

Здравствуйте, меня зовут Стефан Пулвер, я тоже из лаборатории Гриффита. Сегодня мы покажем вам методику вызова синаптических потенциалов с отсутствующим корнем канала в нервно-мышечном соединении личинки дрозофилы. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения синаптической физиологии и дрозофилы.

Мы также используем его для обучения студентов синаптической физиологии и учебных лабораторных работ. Итак, приступим. Чтобы начать работу с этим протоколом, поддерживайте канал БАС в два и ладно, 3 7, 1 галлон четыре нахлыстовых лески в отдельных бутылках, содержащих стандартные нахлыстовые среды.

Соберите девственниц из, ладно, 3 7, 1 галлона, четырех нахлыстовых лесок и самцов с канала БАС redsin. Две линии. Затем сделайте мухобойку, которая смешана с одним миллимоляром, всем транс-ретинолом или TR.To сделайте это расплавленным обычным материалом от мух в микроволновой печи примерно на одну минуту.

После расплавления дайте фильтрующему материалу остыть в течение примерно 30-60 секунд, а затем добавьте 100 микролитров 100 миллимолярных TR в 100% этаноле на каждые 10 миллилитров мухового фильтрующего материала. Когда флаконы, содержащие среду TR, будут готовы, положите собранные самцы и самки в каждый флакон. Поместите флаконы в темное место при температуре от 22 до 25 градусов по Цельсию, чтобы мухи могли спариваться и откладывать яйца, подождите четыре-пять дней, пока не станет видна третья звездчатая личинка.

На этом этапе можно избавляться от взрослых мух. Теперь мы готовы приступить к настройке электрофизиологической установки. Прикрепите любой окуляр препарирующего прицела к синему светодиодному источнику света с радиатором.

С помощью штифта и зажима прикрепите магнитное основание к окуляру и светодиодному источнику света. Поместите магнитное основание на воздушный стол электрофизиологической установки. Далее подключите источник света к цепи управления, а затем подключите цепь управления к внешнему источнику напряжения.

Мы используем выходное напряжение от системы сбора данных электрофизиологии Power Lab от AD Instruments. После подключения к источнику напряжения подайте от одного до пяти вольтовых импульсов в цепь управления, чтобы активировать синий свет, отрегулируйте магнитную базу и источник света до тех пор, пока луч синего света не сфокусируется на области, занимаемой личиночным вскрытием. После внесения надлежащих корректировок мы готовы перейти к вскрытию личинок.

Чтобы приступить к вскрытию, поместите шесть булавок по 0,1 мм в пол посуды, выстланной согаром. Удалите треть в виде личинок звездчатки из пищевой среды и поместите ее в любую пластиковую чашку Петри. Промойте личинки солевым раствором, чтобы удалить любую пищу, которая прилипла к личинкам.

Затем поместите личинок в рассекательную чашку рядом с выдернутыми булавками и заполните чашку наполовину физиологическим раствором. Теперь сориентируйте личинок так, чтобы вы могли видеть две серебристые трубки, проходящие по спинной поверхности животного. Эти серебристые трубки и есть трахея.

Вставьте большой штифт непосредственно в хвост между трахеальными трубками. Удерживайте личинок и вставьте вторую большую булавку в ее голову. Обязательно растягивайте корпус в продольном направлении, когда вставляется штифт.

С помощью ножниц сделайте небольшой надрез возле хвоста. Продолжайте разрез по всей длине тела. Убедитесь, что кончики ножниц подняты, чтобы не перерезать вентральные нервы и/или мышцы стенки тела.

Поместите четыре булавки на четыре угла животных. Теперь откройте среднюю часть. Вставьте булавки в чашку для препарирования так, чтобы животное было разделано.

Также приколите препарат так, чтобы он обучался с помощью щипцов и ножниц. Удалите животное, органы пищеварения, трахею и жировые тела. Промойте приготовленный материал солевым раствором.

После полоскания найдите лобные доли и вентральный ганглий препарата с помощью микроножниц. Осторожно прорежьте брюшной ганглий сразу за лобными долями. После того, как вскрытие будет завершено, продолжайте стимуляцию синим светом и запись мышц.

Чтобы выполнить мышечную запись, потяните за электрод сопротивления от 10 до 20 мегаом. С помощью электронного съемника электродов заполните вытягиваемый электрод тремя молярами KCL. Поместите заполненный электрод в держатель электрода.

Теперь поместите подготовку к личинкам под препарирующий микроскоп на оснастке. Отрегулируйте синий свет так, чтобы расчлененный препарат был центрирован в луче света. Определите мышцу шесть или М 6 в любом сегменте стенки тела личинки с помощью микроманипулятора, осторожно вставьте электрод в М 6 и следите за быстрой гиперполяризацией мышцы.

Потенциалы мембраны покоя должны быть в диапазоне от отрицательных 30 до отрицательных 70 милливольт. После того, как электрод будет правильно вставлен, подайте импульсы напряжения от 20 до 100 миллисекунд в цепь управления. Постепенно увеличивайте напряжение, подаваемое на цепь управления.

Следите за потенциалами exci контактов в мышечной клетке. Вот репрезентативный результат, который показывает потенциал exci перехода, вызванный короткими световыми импульсами. Показанная здесь амплитуда потенциала exci перехода представляет собой суммированную амплитуду от двух моторных нейронов, которые, как известно, оба питаются.

М шесть. Более низкая интенсивность или более короткая продолжительность света могут обнажить потенциал возбуждающего перехода меньшей амплитуды от одного моторного нейрона. Мы только что показали вам, как выполнять канальную дорогу без двух опосредованных стимуляций синаптических потенциалов в нервно-мышечном соединении глазного нерва.

При выполнении этой процедуры важно помнить о том, чтобы не повредить стенку тела препарата во время вскрытия. Также важно помнить, что, хотя подготовка может быть перевозбуждена сразу после вскрытия, со временем она успокоится и позволит сделать хорошие записи. При прокалывании мышц будьте осторожны, чтобы не опускаться ниже первого слоя мышц в стенку тела.

Когда электрод застревает в стенке тела. Иногда вы можете получить гиперполяризованные потенциалы, но на самом деле не находиться в мышечной клетке. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.