Изготовление Миогенный Engineered Создает тканей

Данная процедура начинается со сбора скелетной мышечной ткани новорожденных крыс линии Lewis. Из этой ткани мы выделяем миобласты. Миобласты культивируют в чашках для культивирования тканей в течение двух дней, после чего их собирают и добавляют в смесь для создания тканевой конструкции на основе коллагена.

Эту смесь осторожно переносят пипеткой в форму, погруженную в культуральную среду, и инкубируют при 37 °C. Здравствуйте, я Кристина Песак из лаборатории Дугласа Коуэна на кафедре анестезиологии Детской больницы Бостона и Гарвардской медицинской школы. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру создания искусственно выращенной миогенной ткани.

Данная процедура используется нами для создания биоинженерной ткани, предназначенной для имплантации в сердце. Наша цель — установить электрическую связь между верхними и нижними камерами сердца в качестве альтернативного метода терапии имплантации кардиостимулятора детям с полной поперечной блокадой сердца. Итак, приступим.

В данной конструкции используется литейная форма для придания формы хирургически имплантируемому тканевому конструкту на основе коллагена. В сопутствующем видео описывается процесс создания инженерных тканевых конструктов, содержащих скелетные миобласты. Также демонстрируется имплантация созданной по данному протоколу клеточной ткани в сердце.

Форму для ткани можно изготовить практически любой формы или размера, чтобы удовлетворить физиологическим требованиям любого сердца, для которого предназначена эта ткань. В данной демонстрации форма позволит создать фрагмент ткани, который можно будет разрезать так, чтобы он поместился в атриовентрикулярную (AV) борозду сердца взрослой крысы. Начните изготовление формы, используя лезвие бритвы, чтобы разрезать силиконовую трубку на отрезки длиной три сантиметра, а затем разрежьте каждый отрезок вдоль пополам.

Отрежьте небольшой кусочек полиэфирной сетки. Затем нанесите каплю силиконового клея RTV имплантационного класса на внутреннюю поверхность самого края трубки. Старайтесь использовать минимальное количество клея, так как он обладает некоторой токсичностью для культивируемых клеток.

Быстро поместите небольшой кусочек полиэфирной сетки на каплю силиконового клея и совместите её с концом трубки. Это создаст слегка приподнятую плоскую поверхность для крепления конструкции. Повторите эту процедуру для другого конца трубки.

Дайте форме высохнуть при комнатной температуре в течение трех дней. Рекомендуется изготавливать от 20 до 30 форм за один раз, так как они фактически являются одноразовыми. После полного высыхания адгезива, чтобы обеспечить стерильность форм, храните их в контейнере с 70% ethanol до момента использования подготовленных форм.

Затем убедитесь, что все необходимые растворы также готовы к использованию для выделения клеток. Приготовьте разбавленный раствор ламинина, содержащий 1 mg ламинина в 250 mL PBS, фильтрованного через мембрану с порами 0,2 µm, с добавлением антибиотиков и фунгицида.

Затем нанесите на чашки для культивирования тканей диаметром 150 миллиметров по четыре миллилитра разведенного раствора ламината и инкубируйте их при 37 °C не менее четырех часов перед использованием. Также необходимо подготовить еще два раствора: среду для миобластов и раствор для дигестии скелетных мышц.

Составы растворов приведены в текстовой части протокола. Стерилизуйте буфер для переваривания, используя фильтрующий диск с порами 0,2 micron, установленный на шприц объемом 10 milliliter. Аликвоты буфера для переваривания можно хранить при температуре minus 20 degrees Celsius.

Рассчитайте, что на один помет крыс линии Льюиса потребуется пять миллилитров буфера для переваривания. Инкубируйте необходимый объем буфера для переваривания тканей и 10 миллилитров среды для миобластов при 37 °C. Затем приступайте к препарированию крысят.

Сначала с помощью пинцета и маленьких ножниц возьмите как минимум один помет принесенных в жертву новорожденных крыс линии Lewis. Удалите параспинальные мышцы из тел новорожденных крыс линии Lewis, сделав разрез вдоль спины по ходу спинного мозга, отслоив кожу и слои фасции, после чего вырежьте мышцы. Поместите вырезанные мышцы в коническую пробирку объемом 50 milliliter, заполненную 40 milliliters 1X HBSS на льду.

Позвольте полоскам мышц осесть на дно пробирки и осторожно удалите большую часть жидкости и остатков крови с помощью вакуумного всасывания стерильной пастернаковской пипеткой в культуре. Затем перенесите собранные фрагменты мышц в чашку Петри диаметром 150 мм и максимально удалите оставшуюся жидкость путем аспирации. С помощью двух односторонних лезвий бритвы измельчите ткань до состояния густой пасты.

Мышечную пасту переваривают в предварительно нагретом растворе для дигестии. Налейте часть раствора для дигестии на мышечную пасту и перенесите смесь раствора и пасты в новую пробирку объемом 50 миллилитров. Используя пипетку объемом 10 миллилитров, для эффективного переваривания мышц крыс линии Lewis весом три литра обычно используют от 10 до 15 миллилитров раствора.

Поместите пробирку на качалку и инкубируйте при 37 °C в течение примерно 30 минут. В процессе ферментативного переваривания ткань периодически тритурируют, избегая образования пузырьков. Используйте 10 мл пипетку, установленную на аккумуляторный дозатор.

После разжижения мышечной ткани пропустите раствор через клеточный фильтр с диаметром пор 70 мкм. Затем центрифугируйте отфильтрованные клетки при комнатной температуре в течение 10 минут при 600 G; с помощью пастерновской пипетки и вакуумного аспиратора удалите максимально возможный объем жидкости, после чего ресуспендируйте осадок в 10 миллилитрах подогретой среды для миобластов. Выдержите клетки на непокрытом 150-миллиметровом планшете для культивирования тканей в течение 15 минут, чтобы способствовать удалению фибробластов, так как они прикрепляются быстрее, чем миобласты.

Поместите планшет в увлажненный инкубатор, настроенный на 37 °C с 5% carbon dioxide. Извлеките планшет из инкубатора и перенесите клетки, которые еще не прикрепились к культуре с покрытием из Lamin. Взбейте и разведите их в среде для миобластов в таком количестве, чтобы на одного-двух крысят приходился один планшет.

Если клетки высеять слишком плотно, они дифференцируются в миотрубки. Наконец, поместите клетки для выращивания в увлажненный термостат при 37 °C с 5% CO2. После одного-двух дней инкубации клетки будут готовы к формированию тканевых конструктов.

После одного-двух дней инкубации извлеките четыре 150-миллиметровые чашки для культивирования миобластов из инкубатора. Не ждите более 48 часов, иначе фибробласты вытеснят популяцию миобластов. Аспирируйте среду из клеток.

Затем дважды промойте клетки теплым (до 37 °C) XPBS, чтобы отделить миобласты от планшета, добавьте в каждый планшет по четыре миллилитра подогретого 0,05% раствора tryin EDTA и верните планшеты в инкубатор на пять минут. Соберите миобласты в ламинарном шкафу и перенесите жидкость в пробирку объемом 50 мл. Используйте 10 мл среды для миобластов, чтобы промыть все планшеты, и объедините полученный раствор с клетками в центрифужной пробирке.

Осадите клетки при комнатной температуре в течение 10 минут при 600 G и максимально удалите избыток жидкости путем аспирации. Затем ресуспендируйте миобласты в 1,4 milliliters среды для миобластов и поместите их на лед. С помощью пинцета осторожно извлеките форму для конструкта из этаноловой ванны и дважды промойте её путем погружения в XPBS; перед тем как поместить форму в пустую лунку шестилуночного планшета для культивирования тканей, удалите все следы PBS с помощью пастернавской пипетки.

На данном этапе необходимо приготовить раствор. Поместите следующие реагенты на лед: 10 x hams F 10 fungi zone penicillin streptomycin.

Клетки коллагена I типа ресуспендируют в среде для миобластов, бикарбонате натрия и геле. Смешайте реагенты в соответствии с письменным протоколом. Перемешайте смесь на вортексе в течение 20 секунд, после чего она станет розовой.

Обратите внимание, что коммерчески доступные варианты коллагена I типа оказывают различное влияние на смешивание, затвердевание и консистенцию конечного продукта. Верните пробирку в ведерко со льдом на несколько минут, чтобы из раствора вышли пузырьки воздуха.

Важно, чтобы коллаген первого типа не подвергался облучению, иначе он не превратится в желатин. В данном случае используется продукт, полученный из кожи яиц. До затвердевания смеси осторожно залейте ее в форму в культуральной пластинности.

Каждая форма будет вмещать примерно один миллилитр вязкой жидкости. Старайтесь избегать появления пузырьков воздуха в ходе этой процедуры. Осторожно перенесите планшет с формами для конструктов в инкубатор при 37 °C.

По мере затвердевания смесь изменит цвет с темно-розового на светло-розовый; в то время как форма затвердевает, подогрейте среду для миобластов до 37 °C. Примерно через полчаса инкубации осторожно погрузите каждый тканевый конструкт в подогретую среду для миобластов и верните планшет в инкубатор. При правильном выполнении данного протокола тканевый конструкт, содержащий миобласты, будет готов к имплантации in vivo или для дальнейшего анализа.

После двух дней инкубации мы продемонстрировали вам способ создания миогенного тканеинженерного конструкта. При выполнении этой процедуры важно помнить, что все реагенты, необходимые для приготовления раствора конструкта, следует хранить на льду, чтобы предотвратить преждевременное затвердевание. На этом всё.

Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.