Живая съемка Плотные-ядерные Пузырьки в начальной культивированный нейронов гиппокампа
29 мая 2009 г.
Живая клетка изображений имеет особую полезность при изучении динамики торговли органелл. Здесь мы опишем протокол для живого изображения плотных процессоров пузырьки в культуре нейронов использованием широкого поля флуоресцентной микроскопии. Этот протокол является гибкой и может быть адаптирована для изображения других органелл типа митохондрий, эндосомы и пероксисом.
Визуализация живых клеток особенно полезна при изучении динамики органеллярного транспорта. В этом видео будет представлен метод визуализации плотных сердцевинных гранул в культивируемых нейронах гиппокампа. Сначала подготавливают трансфекционные комплексы, смешивая среду D-N-A-M-E-M и реагент для трансфекции lipectomy.
Поскольку нейроны гиппокампа культивируются на перевернутых покровных стеклах, обращенных к глиальному монослою, эти стекла необходимо перевернуть, чтобы обеспечить их контакт с реагентом для трансфекции. После того как прошло достаточное время для экспрессии белков плотных ядерных везикул с GFP-меткой, конструируется камера для визуализации. Визуализация плотных ядерных ICAL в культивируемых нейронах может быть осуществлена с помощью широкопольной флуоресцентной микроскопии.
Данный протокол является гибким и может быть адаптирован для визуализации других органелл, таких как митохондрии, эндосомы и пероксисомы. Здравствуйте, я Майкл Сильверман, и добро пожаловать в мою лабораторию клеточной нейробиологии в Университете Саймона Фрейзера. Мы изучаем механизмы перемещения органелл в нервных клетках.
Чтобы ответить на этот вопрос, мы маркируем мембранные органеллы, в частности, везикулы с плотным ядром в культивируемых нейронах гиппокампа. И чтобы показать вам, как это делается, я передаю слово Дэвиду. Здравствуйте, я Дэвид из лаборатории Сильвермана.
Сегодня я продемонстрирую процедуру визуализации плотных сердцевинных везикул и культивируемых нейронов в живых клетках с использованием широкопольной западной микроскопии. Приступим. Для большинства экспериментов мы используем чашки с нейронами гиппокампа крысы, которые культивировались с плотностью 250 000 клеток на чашку диаметром шесть сантиметров. Для каждой трансфекции подпишите две пробирки объемом 1,5 миллилитра: одну для плазмидной ДНК, а другую — для реагента для трансфекции.
В ламинарном шкафу смешайте 1 µg плазмидной ДНК со 100 µL MEM в одной пробирке при комнатной температуре; убедитесь, что используемая среда MEM не содержит добавок. В другой пробирке смешайте 6 µL липида со 100 µL MEM. Такое же количество может быть использовано для двойной трансфекции, хотя в этих случаях соотношение липида и ДНК будет в два раза меньше.
Чтобы сохранить срок годности липидного реагента, постоянно держите его в холодильнике или в настольном охладителе, а перед использованием выдержите пробирки в течение пяти минут при комнатной температуре. Перенесите смесь ДНК в среде MEM в пробирку с липидами и осторожно перемешайте с помощью APE Next, затем инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре. Через 25 минут добавьте 60 µL 50 mM K-нейроновой кислоты, чтобы минимизировать цитотоксическое повреждение культивируемых нейронов.
Поскольку мы культивируем нейроны на нижней стороне покровных стекол, подвешенных над монослоем GL, необходимо перевернуть покровные стекла, чтобы подвергнуть нейроны воздействию раствора для трансфекции. Осторожно переверните стекла с помощью стерильного пинцета, чтобы они лежали нижней стороной вверх. Расположите их так, чтобы они не перекрывали друг друга.
Будьте осторожны, чтобы не повредить поверхность покровного стекла, покрытую нейронами, или поверхность чашки, покрытую ggl. По окончании 30-минутной инкубации возьмите примерно 0.5 мл среды из чашки диаметром шесть сантиметров и осторожно смешайте с ДНК в пробирке. Перенесите раствор ДНК обратно в чашку, равномерно распределяя его по поверхности среды.
Осторожно перемещайте чашку вперед-назад в одном направлении, стараясь не вызвать всплески среды. После перемешивания в одном направлении остановитесь и повторите процедуру в перпендикулярном направлении, чтобы равномерно распределить липосомно-ДНК-комплексы по всей чашке. Инкубируйте в течение 90 минут в инкубаторе для культур тканей при 37 °C и 5% carbon dioxide.
После инкубации переверните покровные стекла ножками вниз и расположите их так, чтобы они не перекрывали друг друга. Наконец, дайте экспрессии ДНК продолжаться в течение требуемого времени, которое обычно составляет от одной ночи до 48 часов в инкубаторе. Для прижизненной визуализации плотных сердечек, меченных GFP, в культивируемых нейронах гиппокампа требуется флуоресцентный микроскоп, оснащенный ПЗС-камерой.
Потребуется камера для визуализации с контроллером температуры и нагревателем объектива. Камера не должна иметь открытых портов; эта модификация может быть указана при заказе оборудования. Затем запустите камеру микроскопа, флуоресцентную лампу и программное обеспечение для захвата изображений.
Включите питание платформы камеры и нагревателей объективов. Также сейчас подходящий момент, чтобы нанести каплю иммерсионного масла на объективы. Теперь подготовьте платформу с подогревом и камеру для визуализации.
Для удобства манипуляций пометьте одну сторону верхней части камеры перманентным маркером. Поместите камеру верхней частью вверх на крышку пробирки объемом 50 миллилитра, которая служит идеальным держателем для камеры.
Нанесите кольцо смазки в паз вокруг отверстия на боковой стороне камеры, помеченной как верхняя. Избегайте избыточного использования смазки, так как она может попасть внутрь камеры и уменьшить область обзора. Используйте пинцет.
Прикрепите чистый неиспользованный покровное стекло длиной 18 сантиметров к верхней стороне камеры. Слегка надавите на края покровного стекла, чтобы обеспечить плотное прилегание в углублении камеры. Переверните камеру и нанесите аналогичное кольцо смазки в углубление на противоположной или нижней стороне камеры.
Перенесите 750 µL среды для визуализации в камеру. Это избыточный объем, однако смазка должна предотвратить вытекание среды, а излишки предотвратят образование пузырьков воздуха при наложении покровного стекла с клетками. Храните подготовленную камеру в инкубаторе для культур тканей до начала использования.
Следует избегать длительной инкубации (один час и более), так как среда для визуализации будет испаряться, что приведет к изменению ее состава. Для окончательной сборки камеры для визуализации образа жизни переместите подготовленную камеру и чашку с трансфецированными покровными стеклами из инкубатора в ламинарный бокс для культивирования тканей. С помощью стерильного пинцета осторожно извлеките одно покровное стекло из чашки с трансфецированным материалом.
Затем прикоснитесь краем покровного стекла к салфетке Kimwipe, чтобы удалить излишки питательной среды. После этого поместите покровное стекло стороной с нейронами вниз на подготовленную камеру. Сначала прикоснитесь одной стороной стекла к смазке, а затем прижмите его по краям, чтобы стекло легло ровно, не создавая пузырьков воздуха.
Ожидается, что излишки среды для визуализации вытекут; протрите их, стараясь не сдвинуть покровное стекло с места. Переместите кювету на предварительно нагретый платформенный нагреватель и зафиксируйте ее. Затем перенесите кювету на предметный столик, чтобы минимизировать фотообесцвечивание и фототоксичность.
Отрегулируйте лампу, установив минимальную интенсивность, необходимую для обнаружения трансфицированных клеток. Теперь найдите интересующую вас клетку. При использовании иммерсионного объектива с малым увеличением, например 40 x, рекомендуется придерживаться заранее определенной схемы поиска, чтобы обеспечить максимальный охват покровного стекла и избежать повторного получения одних и тех же изображений.
После того как необходимое поле зрения будет найдено, переключитесь на канал флуоресцентно меченого интересующего белка. Перейдите на иммерсионный объектив с большим увеличением, например от 60 до 100x, и верните интенсивность лампы на высокий уровень. Используйте потоковый сбор данных (stream acquisition) или аналогичную функцию вашего программного обеспечения для визуализации, чтобы зарегистрировать динамику флуоресцентно меченого белка для быстродвижущихся органелл. Время экспозиции и интервал между экспозициями должны быть минимизированы для получения записей с высокой частотой кадров.
Фокальный дрейф, наблюдаемый в окне предварительного просмотра, можно скорректировать в режиме реального времени с помощью ручной регулировки фокуса. Обязательно сделайте фазовое изображение и любые другие сопутствующие снимки, необходимые для последующего анализа и представления. Сохраните все изображения перед дальнейшим исследованием покровного стекла и началом следующей записи.
Обычно получение от трех до пяти записей с одного покровного стекла считается успешным; каждое стекло снимают в течение 30–60 минут. Следует учитывать влияние фототоксичности на общее состояние клеток, так как в поврежденных клетках транспорт снижается. Наблюдения при визуализации живых клеток обычно представляют собой записи, также называемые стеками изображений, которые демонстрируют перемещение меченных флуоресцентными метками органелл в поле зрения. Ниже представлено репрезентативное видео транспорта плотных ядерных iCal.
Для облегчения наблюдения цвета были инвертированы. Обратите внимание на движущиеся частицы. Графики CH представляют собой изображения, иллюстрирующие перемещение частиц путем сопоставления линейных сканов, где каждая временная точка представлена столбцом на графике.
На этом рисунке показано, как две частицы, движущиеся в противоположных направлениях, отображаются на графике CH. Дальнейший анализ хронограмм позволяет получить информацию о скорости потока частиц, реверсии длины пробега и стационарных частицах. Здравствуйте, мы только что продемонстрировали вам способ получения высокоскоростных записей транспорта везикул dsco в культивируемых капиллярных нейронах гиппокампа.
При выполнении этой процедуры важно не забыть предварительно прогреть все компоненты камеры для визуализации и платформы, чтобы снизить стресс клеток при их перемещении из инкубатора на предметный столик. Работать следует быстро, но осторожно. На этом всё.
Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается протокол визуализации плотных везикул в культивируемых нейронах гиппокампа в режиме реального времени с помощью широкопольной флуоресцентной микроскопии. Данный метод может быть адаптирован для визуализации других органелл, что расширяет возможности изучения динамики их транспорта.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Методы визуализации
Теоретические сведения
- Визуализация живых клеток имеет решающее значение для понимания динамики органелл.
- Везикулы с плотным ядром играют важную роль в функционировании нейронов.
- Полевая флуоресцентная микроскопия является мощным инструментом визуализации.
- Для таких исследований обычно используют нейроны гиппокампа.
Цель исследования
- Предоставить подробный протокол визуализации плотных везикул ядра.
- Способствовать изучению транспорта органелл в нейронах.
- Продемонстрировать возможность адаптации данного протокола визуализации для других органелл.
Используемые методы
- Приготовление трансфекционных комплексов с использованием среды D-N-A-M-E-M.
- Трансфекция культивируемых нейронов гиппокампа белками с GFP-меткой.
- Конструирование иммажинизационной камеры для флуоресцентной микроскопии.
- Прижизненная визуализация плотных везикул с помощью широкопольной микроскопии.
Основные результаты
- Успешная визуализация плотных сердцевинных везикул в живых нейронах.
- Демонстрация динамики транспорта органелл.
- Возможность адаптации протокола для визуализации других органелл.
- Понимание роли плотных сердцевинных везикул в нейронной активности.
Выводы
- Данный протокол расширяет понимание динамики органелл в нейронах.
- Визуализация живых клеток является ценным инструментом для нейробиологических исследований.
- В дальнейших исследованиях этот метод может быть использован для изучения различных органелл.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Живая визуализация плотных сердцевинных везикул в первичных нейронах позволяет напрямую наблюдать за динамикой транспорта органелл, что является ключевым процессом в нейрональной сигнализации и синаптической функции. Данный подход способствует валидации мишеней, обеспечивая функциональный анализ транспорта, высвобождения и рециклирования везикул в нейрональных моделях, релевантных конкретным заболеваниям. Адаптируемость метода к различным органеллам и низкая стоимость реализации делают его подходящим для раннего этапа снижения рисков при изучении механизмов нейродегенеративных заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, касающиеся путей везикулярного транспорта в нейронах.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет прямой визуализации динамики плотных сердечковидных везикул в первичных культурах нейронов гиппокампа.
- Прогностическая ценность: облегчает оценку влияния связывания с мишенью на транспорт органелл, помогая в приоритизации перспективных соединений.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Позволяет создавать валидированные нейрональные модели, подходящие для последующего скрининга соединений и исследований модуляции сигнальных путей.
- Количественные показатели: Обеспечивает измерение скорости везикул, длины пробега и направленного потока с помощью анализа кимограмм для сравнительной оценки условий.
- Масштабируемость и повторное использование: Совместимость с широкопольной флуоресцентной микроскопией позволяет использовать платформу для изучения различных органелл и при различных экспериментальных условиях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: позволяет напрямую моделировать нейрональные процессы, вовлеченные в развитие нейродегенеративных расстройств, при которых нарушается везикулярный транспорт.
- Трансляционная преемственность: обеспечивает связь между результатами фундаментальных исследований и доклинической валидацией за счет сохранения физиологической релевантности в первичных нейронах.
- Принятие решений с учетом рисков: дает понимание механизмов, позволяющее принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) на основе функционального восстановления или нарушения фенотипов транспорта.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум поиска новых лекарственных средств — от проверки гипотез относительно мишени через идентификацию соединений-лидеров до доклинической валидации, что особенно актуально для программ в области нейробиологии.
- Открытийная биология: Обеспечивает проверку гипотез о влиянии генов или соединений на транспорт везикул, их высвобождение или нейрональную полярность.
- Скрининг: Позволяет подготовить анализ за счет стандартизированной трансфекции и визуализации везикулярных белков с GFP-меткой в нейронах гиппокампа.
- Аналитика: Позволяет получать количественные показатели, такие как скорость частиц, длина пробега и направленность движения, с помощью анализа кимограмм и хронограмм.
- Трансляционные исследования: Связывают с доклинической работой путем моделирования релевантных для заболевания нейрональных систем, в которых дисфункция плотных везикул способствует развитию патологии.
- Корпоративное повторное использование: Представляет собой гибкий и недорогой метод визуализации, применимый к различным органеллам (например, митохондриям, эндосомам) и переносимый между проектами.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов за счет уменьшения неопределенности в механистическом понимании динамики органелл нейронов.
- Операционная ценность: Способствует стандартизации благодаря воспроизводимым протоколам трансфекции, подготовки камер и визуализации.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала, обеспечивая возможность ранней функциональной оценки мишеней с использованием доступной инфраструктуры микроскопии.
- Влияние на портфель: Поддерживает риск-ориентированное продвижение за счет выявления соединений, модулирующих везикулярный транспорт в валидированных моделях нейронов.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с первичными культурами нейронов, методами трансфекции и визуализацией живых клеток.
- Метод основан на использовании широкопольной флуоресцентной микроскопии с ПЗС-камерой, термостатируемой камерой и подогревом объектива.
- Необходима стандартизация между исследовательскими группами в отношении эффективности трансфекции, условий визуализации и анализа с помощью кимограмм.
- Адаптация метода для других органелл требует валидации конструктов с GFP-меткой и оптимизации уровней экспрессии во избежание артефактов гиперэкспрессии.
- Практические ограничения включают низкую эффективность трансфекции (~0.5%), что требует достаточной плотности культуры для анализа отдельных клеток и увеличения времени скрининга для фиксации достаточного количества событий.
