Живая съемка Плотные-ядерные Пузырьки в начальной культивированный нейронов гиппокампа
May 29th, 2009
Живая клетка изображений имеет особую полезность при изучении динамики торговли органелл. Здесь мы опишем протокол для живого изображения плотных процессоров пузырьки в культуре нейронов использованием широкого поля флуоресцентной микроскопии. Этот протокол является гибкой и может быть адаптирована для изображения других органелл типа митохондрий, эндосомы и пероксисом.
Визуализация живых клеток особенно полезна при изучении динамики органного трафика. В этом видео будет освещена процедура, используемая для визуализации плотных ядер в культивируемых нейронах гиппокампа. Трансфекционные комплексы сначала получают путем смешивания среды D-N-A-M-E-M и липэктомического реагента для трансфекции.
Поскольку нейроны гиппокампа культивируются на перевернутых покровных листках, обращенных к глиальному монослою, эти покровные листки должны быть перевернуты, чтобы подвергнуть их воздействию реагента для трансфекции. После того, как будет предоставлено достаточно времени для экспрессии вязких белков с плотным ядром метки GFP, создается камера для визуализации. Визуализация плотных ядровых ICALs в культивируемых нейронах может быть выполнена с помощью широкопольной флуоресцентной микроскопии.
Этот протокол является гибким и может быть адаптирован для визуализации других органелл, таких как митохондрии, эндосомы и пероксисомы. Здравствуйте, меня зовут Майкл Сильверман, и добро пожаловать в мою лабораторию клеточной нейробиологии в Университете Саймона Фрейзера. Нас интересует, как органеллы перемещаются в нервных клетках.
Чтобы подойти к этому вопросу, мы обозначим мембранные дон органеллы, в частности, плотные сердцевинные везикулы в культивируемых нейронах гиппокампа. И чтобы показать вам, как мы это делаем, я передаю слово Дэвиду. Привет, я Дэвид из лаборатории Сильвермана.
Сегодня я покажу вам процедуру визуализации живых клеток плотных везикул и культивируемых нейронов с помощью широкопольной западной микроскопии. Давайте начнем. Для большинства экспериментов мы используем чашки с нейронами гиппокампа крыс, которые были культивированы при плотности клеток 250 000 клеток на шестисантиметровую чашку для каждой трансфекции, меченной двумя 1,5-миллилитровыми пробирками, одна для плазмиды, ДНК, а другая для реагента для трансфекции.
В ламинарном вытяжном шкафу, чтобы соединить один микрограмм плазмидной ДНК с сотней микролитров МЕМ в одной пробирке при комнатной температуре, обязательно используйте МЭМ, который не содержит никаких добавок. Соедините шесть микролитров губ со ста микролитрами MEM в другом тюбике. Такое же количество может быть использовано для двойного трансфекта, даже если соотношение ДНК губ в таких случаях будет уменьшено вдвое.
Чтобы продлить срок годности реагента для губ, постоянно храните его в холодильнике или в настольном холодильнике, инкубируйте пробирки в течение пяти минут при комнатной температуре. Перенесите смесь ДНК из MEM в липидную трубку и аккуратно перемешайте с APE Next инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре. Через 25 минут добавьте 60 микролитров 50 миллимолярной нейронной кислоты К, чтобы свести к минимуму цитотоксическое повреждение культивируемых нейронов.
Поскольку мы культивируем нейроны на нижней стороне покровных стеблей, подвешенных над монослоем GL, необходимо инвертировать покровные листки и подвергать нейроны воздействию трансфекционного раствора. Аккуратно откидывают крышку, подсовывают ноги вверх с помощью стерильных щипцов. Расположите их так, чтобы они не накладывались друг на друга.
Будьте осторожны, чтобы не поцарапать поверхность крышки с нейронным покрытием или поверхность посуды, покрытую ggl. В конце 30-минутной инкубации возьмите примерно N 0,5 миллилитров среды из шестисантиметровой чашки и аккуратно смешайте с ДНК в пробирке. Перелейте раствор ДНК обратно в чашку, равномерно капая на поверхность среды.
Аккуратно двигайте блюдо вперед и назад в одном направлении, но следите за тем, чтобы среда не разбухла. После смешивания в одном направлении остановитесь и повторите в перпендикулярном направлении, чтобы равномерно распределить комплексы липэктомии ДНК по всей чашке. Инкубировать в течение 90 минут в инкубаторе для тканевых культур при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.
После инкубации переверните чехол лапками вниз и расположите их так, чтобы они не перекрывались. Наконец, позвольте экспрессии ДНК продолжаться в течение желаемого времени, которое обычно составляет от ночи до 48 часов в инкубаторе. Для визуализации плотного ядра, меченного GFP, в культивируемых нейронах гиппокампа в реальном времени требуется флуоресцентный микроскоп, оснащенный ПЗС-камерой.
Потребуется камера визуализации с регулятором температуры и обогревателем объектива. Камера не должна содержать открытых портов, модификация которых может быть включена при заказе камеры. Затем запустите камеру микроскопа, люминесцентную лампу и программное обеспечение для получения изображений.
Включите питание камеры платформы и обогревателей объектива. Это также хорошее время, чтобы нанести каплю масла на цели. Теперь подготовьте нагретую платформу и камеру визуализации.
Для удобства манипуляций. Пометьте одну сторону верхней части камеры перманентным маркером. Поместите камеру верхней стороной вверх на крышку 50-миллилитровой трубки, которая является идеальным держателем камеры.
Нанесите кольцо смазки на канавку, окружающую отверстие в боковой части камеры, обозначенной сверху. Избегайте чрезмерного использования смазки, так как она попадет в камеру и уменьшит видимую площадь. С помощью щипцов.
Прикрепите чистый неиспользованный 18-сантиметровый защитный листок к верхней стороне камеры. Слегка надавите на защитное стекло по краям, чтобы создать плотное уплотнение в углубленной канавке камеры. Переверните камеру и нанесите аналогичное кольцо смазки на канавку на противоположной или нижней стороне камеры.
Перенесите в камеру 750 микролитров среды для визуализации. Это чрезмерное количество, но смазка должна предотвращать разлив среды, а избыток предотвратит попадание пузырьков при нанесении накладки на покрытую ячейкой крышку. Держите подготовленную камеру в инкубаторе для тканевых культур до тех пор, пока она не понадобится.
Следует избегать длительной инкубации, такой как час или более, так как среда визуализации испаряется и изменяется в составе. Для окончательной сборки камеры для визуализации образа жизни переместите подготовленную камеру и чашку с трансфицированной крышкой из инкубатора в колпак для культуры тканей. С помощью стерильных щипцов осторожно снимите одну покровную листушку с трансфицированной посуды.
Затем коснитесь края покровного листа салфеткой, чтобы оттянуть питательную среду. Далее поместите крышку слип-нейроном вниз на подготовленную камеру. Прикоснитесь к одной стороне крышки, сначала нанесите смазку и надавите на края, чтобы крышка закрылась плашмя без попадания пузырей.
Ожидается, что излишки носителя изображения выльются наружу, сотрите излишки носителя изображения, но будьте осторожны, чтобы не сдвинуть защитное стекло с места. Переместите камеру к нагревателю предварительно разогретой платформы и закрепите камеру на месте. Далее перенесите камеру в стадию для уменьшения фотообесцвечивания и фототоксичности.
Отрегулируйте лампу на минимальное количество интенсивности, необходимое для поиска трансфицированных клеток. Теперь найдите интересующую вас клетку. При использовании масляного объектива с малым увеличением, например 40-кратного, полезно придерживаться запланированной схемы поиска, чтобы обеспечить максимальное покрытие скольжения крышки и избежать избыточного получения изображений.
После того, как нужное поле будет найдено, переключите канал интересующего вас флуоресцентно меченного белка. Переключитесь на масляный объектив с большим увеличением, например, от 60 до ста раз, и верните интенсивность лампы к высокому значению, используйте захват потока или аналогичную функцию вашего программного обеспечения для визуализации для записи динамики флуоресцентно меченного белка для быстро движущихся органелл. Время экспозиции и задержка между экспозициями должны быть сведены к минимуму для получения записей с высокой частотой кадров.
Смещение фокуса, наблюдаемое при предварительном просмотре на экране, можно исправить в режиме реального времени путем ручной регулировки фокусировки. Обязательно сделайте фазовое изображение и любые другие сопроводительные изображения, необходимые для последующего анализа и представления. Сохраните все изображения перед дальнейшим изучением обложки и следующей записью.
Как правило, от трех до пяти записей с одного покровного листа считаются успешными, и покровные листы визуализируются в течение 30-60 минут; следует помнить о фототоксичности каждого фототоксичного фактора в общем состоянии клетки, поскольку в поврежденных клетках уменьшается количество транспортеров. Наблюдения за живыми клетками обычно состоят из записей, также известных как стопки изображений, которые показывают движение флуоресцентно помеченных органелл в поле зрения. Вот типичный ролик о плотном ядерном транспорте iCal.
Цвет был инвертирован для более удобного наблюдения. Обратите внимание на движущиеся частицы. Графики CH — это изображения, которые иллюстрируют движение частиц путем сопоставления линейных сканов, где каждая временная точка представлена столбцом на графике.
На этом рисунке показано, как две частицы, движущиеся в противоположных направлениях, представлены на CH-графике. Дальнейший анализ хронографов может предоставить информацию о скорости потока частиц, изменении длины пробега и неподвижных частицах. Здравствуйте, мы только что показали вам, как получить высокоскоростные записи транспорта везикул dsco и культурных нейронов гиппопотама.
При проведении этой процедуры важно не забывать о предварительном нагреве всех компонентов камеры визуализации и платформы, чтобы снизить напряжение в клетках во время их перехода из инкубатора на сцену. Работать следует быстро, но аккуратно. Вот и все.
Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
В этой статье описан протокол для визуализации живых плотных пузырьков в культуре нейронов гиппокампа с использованием широкополосной флуоресцентной микроскопии. Метод адаптируется для визуализации других органелл, что улучшает исследование динамики транспорта органелл.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Техники визуализации
Предпосылки
- Визуализация живых клеток важна для понимания динамики органелл.
- Плотные пузырьки играют важную роль в функционировании нейронов.
- Широкополосная флуоресцентная микроскопия является мощным инструментом визуализации.
- Нейроны гиппокампа часто используются в таких исследованиях.
Цель исследования
- Предоставить детальный протокол для визуализации плотных пузырьков.
- Облегчить исследование транспорта органелл в нейронах.
- Продемонстрировать адаптивность протокола визуализации для других органелл.
Используемые методы
- Приготовление трансфекционных комплексов с использованием среды D-N-A-M-E-M.
- Трансфекция культурированных нейронов гиппокампа с белками, метченными GFP.
- Создание камеры для визуализации флуоресцентной микроскопии.
- Визуализация плотных пузырьков в живых нейронах с использованием широкополосной микроскопии.
Основные результаты
- Успешная визуализация плотных пузырьков в живых нейронах.
- Демонстрация динамики транспорта органелл.
- Адаптивность протокола для визуализации других органелл.
- Понимание роли плотных пузырьков в нейронной активности.
Выводы
- Протокол улучшает понимание динамики органелл в нейронах.
- Визуализация живых клеток является ценным инструментом для исследований в области нейробиологии.
- Дальнейшие исследования могут использовать этот метод для различных органелл.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Live imaging of dense-core vesicles in primary neurons enables direct observation of organelle trafficking dynamics, a key process in neuronal signaling and synaptic function. This approach supports target validation by providing functional readouts of vesicle transport, release, and recycling in disease-relevant neuronal models. The method’s adaptability to multiple organelles and low-cost implementation makes it suitable for early-stage mechanistic de-risking in neurodegenerative disease programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to vesicle trafficking pathways in neurons.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization of dense-core vesicle dynamics in primary cultured hippocampal neurons.
- Predictive Value: Facilitates assessment of target engagement effects on organelle transport, aiding in lead compound prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces validated neuronal models suitable for downstream compound screening and pathway modulation studies.
- Quantitative Outputs: Enables measurement of vesicle velocity, run length, and directional flux via kymograph analysis for comparative condition evaluation.
- Scalability & Reuse: Compatible with wide-field fluorescence microscopy, allowing platform reuse across multiple organelles and experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly models neuronal processes implicated in neurodegenerative disorders where vesicle trafficking is disrupted.
- Translational Continuity: Bridges discovery observations with preclinical validation by maintaining physiological relevance in primary neurons.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides mechanistic insights that inform go/no-go decisions based on functional rescue or disruption of trafficking phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for neuroscience-focused programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of genes or compounds affecting vesicle trafficking, release, or neuronal polarity.
- Screening: Enables assay readiness through standardized transfection and imaging of GFP-tagged vesicle proteins in hippocampal neurons.
- Analytics: Generates quantitative readouts such as particle velocity, run length, and directional movement via kymograph and chronograph analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling disease-relevant neuronal systems where dense-core vesicle dysfunction contributes to pathology.
- Enterprise Reuse: Represents a flexible, low-cost imaging capability applicable to multiple organelles (e.g., mitochondria, endosomes) and transferable across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in mechanistic understanding of neuronal organelle dynamics.
- Operational Value: Promotes standardization through reproducible transfection, chamber preparation, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early functional assessment of targets using accessible microscopy infrastructure.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by identifying compounds that modulate vesicle trafficking in validated neuronal models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary neuronal culture, transfection, and live-cell imaging techniques.
- Depends on wide-field fluorescence microscopy with CCD camera, temperature-controlled chamber, and objective heating.
- Necessitates standardization across teams for transfection efficiency, imaging conditions, and kymograph-based analysis.
- Adaptation to other organelles requires validation of GFP-tagged constructs and optimization of expression levels to avoid overexpression artifacts.
- Practical limitations include low transfection rates (~0.5%), which necessitate sufficient culture density for single-cell analysis and longer screening times to capture adequate events.
