Визуализация Живая Drosophila Глиальные-нервно-мышечном соединении с флуоресцентными красителями

Данная процедура начинается с подготовки личинки дрозофилы, которую выворачивают наизнанку, чтобы обнажить поверхность мышечных клеток стенки тела, связанные с ними моторные нейроны и глиальные клетки. Это достигается путем сочетания флуоресцентного окрашивания пресинаптических терминалей нейронов, эндогенной экспрессии GFP и DS red, направленной на мембраны глии и постсинаптических мышечных клеток, а также визуализации парасинаптического пространства. С помощью флуоресцентных красителей в живом препарате можно наблюдать четкую картину структурных изменений, происходящих в глиальном нервно-мышечном соединении. Здравствуйте, я Ди Бринк из лаборатории ALS Ванессы на факультете зоологии Университета Британской Колумбии. Сегодня я продемонстрирую вам метод подготовки тканей и две техники маркировки клеток для визуализации живых тканей личинок с помощью конфокальной микроскопии.

Мы используем данную процедуру в лаборатории для изучения глиальных клеток в нервно-мышечном синапсе. Теперь перейдем к совершенно иному методу: подготовка ткани «изнутри наружу» начинается с определения стадии развития личинок. Эта процедура будет продемонстрирована на личинках третьей стадии блуждания, так как они крупные и их легко препарировать; используйте только активно ползающих личинок W3.

Затем очистите поверхность личинок с помощью очень мягкой кисти в чашке Петри с дважды дистиллированной водой. Очистка личинок важна, так как это улучшает качество оптического изображения и снижает количество бактерий. После очистки перенесите личинку в небольшую чашку Петри с 3 mL ледяной среды HL six, содержащей 5 mM глутамата.

Поместите чашку на лед до тех пор, пока животное не перестанет двигаться и не расслабится, что обычно занимает около двух минут. Как только личинка перестанет двигаться, можно приступать к препарированию тканей с помощью диссекционного микроскопа, держа пружинные ножницы в доминирующей руке и очень тонкий пинцет. Другой рукой аккуратно прижмите животное ко дну чашки и сделайте ножницами небольшое отверстие в стенке тела, чтобы выровнять давление по обе стороны стенки.

С помощью пинцета отсеките два задних сегмента и удалите внутренние органы. Вероятно, через разрез из полости тела выйдет часть жирового тела. Также удалите эту ткань.

Продолжайте аккуратно прижимать личинок к дну чашки с помощью тонкого пинцета. Другой рукой возьмите энтомологическую булавку номер ноль с тупым концом и прижмите её к ротовому аппарату личинки. Протолкните ротовой аппарат через полость тела, подобно тому как выворачивают носок наизнанку, надетый на кулак.

Ткань, вывернутая наизнанку, должна выглядеть следующим образом. С помощью ультратонких препарировочных пружинных ножниц отделите жировое тело и трахеи от стенки тела. Удалите как можно больше жирового тела.

Старайтесь не повредить трахеи и не разорвать нервную систему. Разрыв трахей приведет к образованию отверстий в мышцах стенки тела. По завершении диссекции мышцы должны быть полупрозрачными и расслабленными, а не матовыми или сокращенными.

Если поместить мышцу в раствор HL six без глутамата при комнатной температуре, она, скорее всего, будет сокращаться ритмично. Поскольку генераторы моторных паттернов в ЦНС активны, целая вывернутая наизнанку брюшная стенка имеет тенденцию складываться пополам вдоль дорсальной и вентральной срединных линий. Таким образом, препарат позволяет визуализировать левую или правую половину животного.

Наконец, закрепите ткань на предметном стекле, используя метод с мостиком из покровного стекла. Процедуры закрепления ткани будут показаны далее. Чтобы начать маркировку нейрональных батонов, отберите пипеткой 30 µL раствора флуоресцентно-меченого первичного анти-HRP антитела в HL шесть и нанесите каплю в чашку Петри.

Затем погрузите препарат стенки тела, вывернутой наизнанку, в ванночку с красителем. Метка терминалей нейронов может стать заметной примерно через пять минут, однако для получения полного и яркого окрашивания проведите инкубацию в течение 10–20 минут.

Чтобы смыть излишки метки HRP, поместите ткань в 0,5 мл раствора HL six на 10–30 секунд при комнатной температуре. Несвязавшийся краситель смывается быстро, поэтому цикл промывки не должен быть длительным или интенсивным. Теперь маркированная ткань готова к монтированию и визуализации с помощью микроскопии.

Вариантом только что описанного протокола маркировки антител в живых клетках является использование флуоресцентно-конъюгированного декстрина для визуализации заполненных жидкостью внеклеточных пространств. Для начала этой процедуры разведите флуоресцентно-конъюгированный краситель декстрин в HL six до концентрации 0.001 mg/mL. Вам может потребоваться изменить концентрацию декстрина, если точное время проникновения в внеклеточное пространство не имеет принципиального значения.

Нанесите пипеткой каплю красителя объемом 20 µL на покровное стекло с перемычкой и перенесите препарат ткани в ванночку с красителем. Если перфузия ткани в конфигурации «вывернуто наружу» (inside-out) не требуется или необходимо ограничить объем раствора HL six, препарат можно закрепить на предметном стекле с двойными перемычками. Для этого приклейте на суперклей два квадратных покровных стекла размером 18 мм к тщательно очищенному предметному стеклу.

Оставьте зазор в 2 mm между краями покровных стекол и расположите его по центру, примерно посередине предметного стекла. Дайте клею полностью высохнуть, иначе на водной среде вокруг вашего препарата ткани может образоваться пленка.

Затем поместите каплю раствора HL six объемом 30 µL в зазор между покровными стеклами. Расположите вывернутую наизнанку ткань в капле HL six. Если личинка крупная, а ваша система сбора изображений имеет ограниченную матрицу пикселей, может потребоваться расположить ткань по диагонали.

Нанесите небольшое количество вазелина на края третьего покровного стекла диаметром 18 мм и поместите его жирной стороной вниз на два склеенных покровных стекла над тканью, аккуратно прижмите. Здесь представлены результаты двух наших методов острого флуоресцентного мечения препарата личинки «вывернутого наизнанку» типа, полученные с помощью конфокального микроскопа с вращающимся диском. Первое изображение представляет собой оптический стек синапса глия-нерв-мышца с терминалями бутонов, мечеными живыми антителами к HRP.

На поверхности мышечной клетки видны ярко помеченные терминали нейронных бутинов, выделенные псевдоцветом в синий цвет. В середине стека изображений обнаруживаются помеченные GFP глиальные отростки, показанные зеленым цветом, а также помеченные HRP батоны, окрашенные в синий цвет. Окружая батоны, мы видим поперечные срезы карманообразных SSR (синаптических ретикул), которые окрашены в красный цвет в средней части стека, а в глубоких слоях стека находятся помеченные DS red SSR.

SSR представляют собой специализированные синаптические области мышечной клетки. BNS располагаются в углублениях мышечных клеток, так же как и некоторые части отростков зеленых глиальных клеток. Отростки глиальных клеток интеркалируют вокруг BNS и SSR, но не покрывают поверхность синапса сплошным слоем, как это происходит в самых глубоких слоях стопки.

Мы обнаруживаем зеленые отростки глии и красный SSR, но гораздо меньше терминальных бутонов. Также можно найти поперечные срезы двигательного нерва, иннервирующего мышцу. Глиальные клетки оплетают двигательный нерв, поэтому он также окрашен в зеленый цвет.

Вторым результатом острого флуоресцентного мечения препарата личинки, вывернутого наизнанку, является флуоресцентно меченная декстрином синапса. В данном случае жидкость в парасинаптическом пространстве или синаптической щели окрашена в красный цвет. На поверхностных слоях изображения оптического стека виден слой жидкости с красным красителем декстрином, и можно заметить, где он скапливается в углублениях складок плазматической мембраны мышц.

На более глубоких слоях стека флуоресцентный краситель на основе декстрина проник в синаптические щели; между терминалями нейронов и помеченными синим цветом карманами ССЗ образуются небольшие кольцевидные скопления красителя. Это синаптическая щель, выделенная красителем. Зеленая глиальная ламелла не препятствует проникновению красителя в щель на более глубоких слоях стека изображений.

Наиболее заметными особенностями являются SSR или синаптическая область мышцы, отмеченная синим цветом, и плоские глиальные отростки, отмеченные зеленым. Аналогичным образом, глиальная оболочка вокруг денервированных аксонов, видимая в глубоких слоях, имеет зеленый цвет. По всей видимости, глиальная оболочка препятствует проникновению красителя на основе декстрина.

Я только что продемонстрировал вам новый способ визуализации глиального нервно-мышечного синапса в препарате тканей личинок Drosophila, вывернутом наизнанку. При подготовке ткани важно помнить о необходимости бережного обращения с ней, а также следить за тем, чтобы мышца была расслаблена, а периферические нервы не были повреждены. В заключение я хотел бы привести цитату Маркса.

Время летит как стрела. Страх летит как банан.