Визуализация антиген Конкретные CD4 + Т-клеток с использованием МНС класс II тетрамеров

Что действительно уникально в тесте Тира — он позволяет напрямую визуализировать специфические к антигену Т-клетки. Te, teer — это главный уникальный аспект нашего анализа. Это сочетается с шагом усиления, который мы делаем.

Мы изолируем Т-клетки и выращиваем их в среде, которая обогащает образец для тех Т-клеток, которые нас интересуют. Затем мы можем специально маркировать только эти клетки и визуализировать их на проточном цитометре. Итак, с предыдущими анализами, такими как CSFE или пролиферационные анализы, которые существуют уже десятилетиями, мы получаем как бы общий объём измерений того, что происходит во всей популяции Т-клеток.

Но в организме миллионы Т-клеток, и они видят целый набор различных закономерностей. Если повезёт, может быть, одна из двух до 300 000 клеток образца будет именно той, на которую вы смотрите. И именно поэтому этот анализ выполняет эти шаги обогащения.

А с помощью тестового номера, и поскольку вы напрямую окрашиваетесь, вы можете визуализировать вдали от фона популяцию, которая составляет менее 1% от общего числа ячеек. Вы можете увидеть очень, очень небольшие различия и получить довольно точный подсчёт количества Т-клеток в образце крови, которые находятся у этого человека и распознают ваш интересующий паттерн. Но на этом всё не заканчивается, потому что тетеры позволяют не только маркировать эти Т-клетки, но и изолировать их для дальнейшего анализа.

И тетеры, которые вы используете, на самом деле производятся здесь, в BRI, верно? Да. Мы одна из немногих лабораторий в стране, которые успешно создали тетеры второго класса. Наша цель — распространять эти реагенты по стоимости среди лабораторий, заинтересованных в импорте этой технологии.

Какие, по вашему мнению, самые сложные или сложные аспекты этого анализа при повторении его в других лабораториях? Ну, если подумать, на самом деле их два — рост Т-клеток. Это действительно что-то вроде искусства.

У вас почти ежедневные решения о том, нужны ли клетки дополнительные питательные вещества или дополнительное пространство для роста. А вторая часть, которая, на мой взгляд, самая сложная для неопытного человека — это анализ данных. Я как бы определил, какая часть сигнала действительно является положительным откликом, а какая — просто неотъемлемой частью физики и притяжения.

И тот факт, что всё имеет определённую степень липкости, требует много опыта, особенно в контексте, когда общая реакция будет немного слабой. Как информация, которую вы получите с помощью этого анализа, может принести пользу пациентам на данный момент? Одним из первых признаков, которые проявляются у любого аутоиммунного пациента, является своего рода созвездие антител, специфичных для этого заболевания.

Мы знаем из фундаментальных основ иммунологии, что там, где есть ответ антител, всегда сначала происходит ответ Т-клеток. Если бы мы могли посмотреть на людей с группой риска и увидеть скачок активности Т-клеток, который предшествовал бы формированию антител, это помогло бы определить действительно новый уровень риска, или люди движутся к появлению аутоантител, что, надеюсь, откроет окно для интервентивной терапии. Эта процедура очищает и расширяет антигеноспецифические CD 4 положительные Т-клетки и визуализирует их с помощью тетер-реагентов и оборудования класса 2 ламинарных биобезопасности.

Это будет основное рабочее пространство для процедуры. 50-миллилитровые конические лампы — первичная трубка для изоляции PBMC, одна XPBS. Это должен быть пакет без кальция и магния, обёрнутый в фольгу для защиты от лёгкой барабанной пипетки CoStar 10-миллиметровые аэрозольные контейнеры с 50-миллиметровыми вставками, используемые для предотвращения заражения крови центрифугой.

GS шесть центрифугных трансферных пипеток, гемолитический буфер Пастера, содержащий 8,3 грамма на литр. Хлорид аммония 1,0 грамма на литр. Бикарбонат натрия 0,04 грамма на литр, DI натрий EDTA триан-синий раствор 0,2% в PBS гемо CYTOMETER 15 миллилитров конической трубки, содержащей PBS, дополненный двумя миллимолярными EDTA плюс пять граммов на литр.

Изоляторный набор BSA max CD four, приобретённый у Milin biotech EP магнитного блока, приобретённого у Stem Cell Technologies. Другие платформы для обогащения магнитных элементов могут использоваться с такой же эффективностью. Полипропиленовая трубка объемом 5 миллилитров RPMI 1640, дополненная 25-миллимолярными хиппи, используемая для изготовления T-клеточной среды в пуле человеческой сыворотки, применяемой для дополнительной T-клеточной среды, используемой для дополнительной T-клеточной среды 500 миллилитров, 0,22 микрона с фильтром с верхней бутылкой, стерильной 48-колодцевой пластиной, используемой для экспансионной культуры in vitro, ступень 37 градусов CO2, раствор синтетического пептида объемом 20 миллиграмм на миллилитр, содержащий интересующий эпитоп.

Пептидная трубка с полистиролом объемом 5 миллилитров, загруженная пептидом класса два, используется для визуализации антигенспецифических Т-клеток, анти-CD-3, анти-CD-4 и анти-CD-25, используемых для покрытия антигенспецифических Т-клеток. Перед началом процедуры отправьте факс с циркуляционным цитометром или его аналогом. Соберите все материалы и оборудование в вашем рабочем месте.

Следующая демонстрация охватывает следующие шаги. Изоляция PBMC, отделение CD четырёх положительных Т-клеток in vitro экспансионная культура, визуализация Т-клеток с помощью теема или окрашивания. Шаг первый — изоляция PBMC.

Возьмите образец крови. Кровь следует собирать в шприцы или трубки и антикоагулярно с гепарином в соотношении один к 50, чтобы предотвратить свертывания, ожидайте выход около 1 миллиона PBMC на миллилитр крови. Около 40% из них будут CD4 положительными Т-клетками.

Аликвот кровь в 50-миллилитровые конические трубки. 25 миллилитров крови в пробирке. Аккуратно перемешайте кровь перед свертыванием ALI, чтобы плазма распределилась.

Добавьте PBS, увеличив общий объём до 40 миллилитров, и подслой, высушив 11 миллилитров фиала, вставив в кровяную трубку и аккуратно убрав помощник для пипетки из пипетки. Фиал постепенно стекает на дно трубки. Когда уровень выравнивается, медленно вынимите пипетку из кровяной трубки, снимите крышку и переместите их в аэрозоль баллончиков.

Плотно закройте баллончики и центрифугуйте при 900 раз G в течение 20 минут без перерыва. Крайне важно, чтобы разрыв не применялся в конце этого спина, так как сила разрыва нарушает слой клеток после спина. ПБМК должен образовывать отчетливый белый слой между жёлтой плазмой сверху и прозрачным фиалом снизу.

Аккуратно снимите слой лейкоцитов с помощью трансферной пипетки и перенесите в новую трубку. Часть плазмы и фиала могут быть получены с помощью ПБМК, но избегайте выделения эритроцитного слоя. Обычно на этом этапе две кровяные трубки могут быть объединены в одну клеточную трубку.

Чтобы увеличить размер гранулы, добавьте PBS, увеличив общий объём до 15 миллилитров, и центрифугуйте при 500 G в течение 15 минут при низком перерыве, а аэрозоль баллончиков аспирирует жидкость с помощью пастовой пипетки, стараясь не потревожить гранулу. Обрабатывайте гемолитическим буфером, добавляя пять-шесть миллилитров в каждую трубку и аккуратно перемешивайте, чтобы удалить комки. Инкубировать не более пяти минут.

Добавьте PBS, увеличив общий объём до 50 миллилитров, и центрифугуйте при 230 G в течение 10 минут. При низком разрыве аэрозольные баллоны больше не нужны для этих медленных вращений. Дважды аспирируйте жидкость с помощью трубки, заполненной пастбищной пипеткой, с PBS, и центрифугите при 230 G в течение 10 минут перед финальной промывкой, удалите аликвот восстановленных клеток, разведите триан-синим и подсчитывайте с помощью гемоцитометра.

Это количество ячеек определяет объёмы реагентов, используемых при разделении Т-ячеек. Шаг второй — отделение положительных Т-клеток CD 4, аспирация жидкости и добавление буфера для увеличения общего объёма до 40 микролитров на 10 миллионов клеток. Обычно для этого требуется 30 микролитров буфера плюс остаточный объём гранул.

Перенесите этот объём в 15-миллилитровую коническую трубку. Добавьте коктейль с антителами из наборов CD четыре изоляции, 10 микролитров на 10 миллионов клеток и поставьте на лед на 10 минут. Удалите трубку из льда, снимите крышку и добавьте 30 микролитров буфера на каждые 10 миллионов клеток.

Добавьте магнитные бусины из комплекта CD 4. 20 микролитров на 10 миллионов клеток закрывают трубку и ставят на лёд на 15 минут. Добавьте 10 объёмов буфера для промывания и центрифугирования при 230 раз на G в течение 10 минут.

Во время закрутки установите магнит и полипропиленовую трубку объёмом 5 миллилитров в рабочем месте. Аспирировать жидкость из клеточных гранул. Добавьте два миллилитра буфера и удалите комки с помощью трансферной пипетки.

Используя ту же трансферную пипетку, ячейки переноса в пятимиллилитровую трубку и инкубируют в магните 15 минут. Аккуратно декантуйте положительную фракцию CD четыре Т-клетки в маркированную трубку диаметром 15 мил, инвертируя магнит и опустошая все, кроме последней капли. Добавьте ещё два миллилитра буфера в пятимиллилитровую трубку и удалите из магнита.

Аккуратно смойте четыре отрицательные клетки CD с боков трубки и перенесите их в маркированную трубку длиной 15 миллиметров. Добавьте два миллилитра Т-клеточной среды в каждую трубку. Удалите аликвоты для подсчёта клеток и центрифугите при 230 раз на G в течение 10 минут.

Разведите аликвоты клеток с триан-синим и подсчитайте с помощью гемоцитометра. Эти ячейки определяют количество колодцев, используемых для культуры расширения. Шаг третий.

Экспансионная культура in vitro аспирирует жидкость из CD 4 положительных и CD 4 отрицательных клеток на основе количества клеток. Добавьте среду в четыре положительные клетки CD, чтобы увеличить объем до 3 миллионов клеток на миллиметр. Добавьте среду к CD четыре отрицательные ячейки, чтобы отрегулировать объём до 10 миллионов клеток на миллиметр.

Для расширения культуры требуется 3 миллиона CD четырёх отрицательных клеток на скважину и от двух до 3 миллионов CD четырёх положительных клеток на скважину. Обычно CD-4-положительные клетки являются ограничивающей популяцией. Aliquot CD четыре отрицательных ячейки в нужное количество колодец на пластине с 48 колодцами.

Добавив 300 микролитров в каждую порцию, поместите тарелку в инкубатор с температурой 37 градусов на один час. Снимите пластину, инкубатор, промыйте колодцы, добавив 500 микролитров свежего материала и аккуратно протяните пипеткой вверх и вниз 12–20 раз с помощью трансферной пипетки и удалите всю жидкость. Этот промыв оставляет после себя слой клеток, представляющих антигены.

Когда стирка закончится, добавьте ровно столько материала, чтобы смочить дно каждого — примерно 100 микролитров. Иначе клеящие элементы A высохнут. При необходимости добавьте от двух до трёх миллионов CD-4 положительных клеток в каждую яму.

Добавьте дополнительные материалы, чтобы увеличить общий объём в каждой скважине до одного миллилитра. Добавьте нужный пептид в каждую из них. Колодец. Типичная концентрация стимуляции составляет 10 микрограмм на миллилитр.

Финальная тарелка в инкубаторе с температурой 37 градусов на семь дней. Через семь дней. Добавляйте по 50 микролитров гемо ИЛ по два в каждую скважину в каждый следующий день.

Мониторинг роста клеток с помощью микроскопа подаёт колодцы, которые ещё не слились, удаляя половину среды, добавляя свежую среду и 50 микролитров IL двух разделённых соединяющихся колодцев путём реанимации и перемещения клетки половины клеток в пустую яму. Добавление свежей среды и 50 микролитров IL двух возвратных клеток в инкубатор. Расширяющиеся клетки будут готовы к окрашиванию через 13–15 дней культуры.

Шаг четвёртый — визуализация Т-клеток с помощью окрашивания, покупки или сборки тетеров, соответствующих пептиду. Комбинации MHC, используемые для стимуляции CD четырёх положительных Т-клеток. Убери тарелку из инкубатора.

Аккуратно отнимите половину материала из каждого. Скважина перенесёт аликвот клеток из каждой скважины, обычно 75 микролитров или около 50 000 клеток в пятимиллилитровую полистироловую факс-трубку, добавь обычно один микролитр на 50 микролитров общего объёма и поместить в инкубатор под температурой 37 градусов на один час. Также рекомендуется окрашивать по второму аликвоту каждой колодцы с несовпадающим тиром в качестве отрицательного контрольных клеток с антителами к CD 3, анти CD 4 и анти CD 25.

Могут использоваться дополнительные или альтернативные маркеры антител. Однако не используйте антитела с маркировкой ПЭ, так как этот канал должен быть зарезервирован для темов в данный момент. Также помечайте любой отдельный цвет или изотип с помощью дополнительных ячейок.

Инкубировать клетки, маркированные антителами, в течение 15–30 минут при температуре четыре градуса. Промой каждую трубку с 0,5–1 миллилитром буфера и центрифугой при 230 раз G в течение 10 минут. Аккуратно декантуйте жидкость из факсовых трубок, калибруйте проточный цитометр с помощью эталонных бусин, трубок с одноцветным контролем, контроля изотипов и так далее.

Анализируйте каждую трубку с помощью потокового цитометра. Тетраположительные клетки должны быть отдельной популяцией среди расширенных CD четырёх положительных Т-клеток. Тетра-положительные клетки обычно положительны на CD 25 и часто CD 4 высоко.