Name: Vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 1 (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Изучите метод инфицирования клеток HeLa вирусом вакцинии и анализа экспрессии генов. Этот протокол позволяет исследовать динамику вирусно-хозяйственных взаимодействий в реальном времени.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Уайтхед Институт стипендиаты фондов

Часть 1: Настройка инфекции <ol><li> Расти HeLa клеток в колбах и ждать, пока клетки приблизительно на 80% вырожденная. </li><li> Подготовка достаточно вирусных питательную среду для эксперимента: регулярные DMEM с 2% ЭТС и без добавления антибиотиков. </li><li> Инфекция может быть выполнена либо с сырой запасов вируса коровьей оспы с известным титром, или сахароза очищенный вирус с известным титром, если вы беспокоитесь о хост экспрессии генов. </li><li> Если вы используете сахарозы очищенный вирус, переходите к части 2. </li><li> Если вы используете сырой вируса коровьей оспы акций, непосредственно перед инфекцией, разрушать ультразвуком аликвоты вируса в чашку sonicator с ванной в основном из льда и небольшого количества воды. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Разрушать ультразвуком около 30 Вт в течение 20 секунд. </li><li> Вихревые трубки и повторить обработку ультразвуком в 3 раза, добавляя больше льда, если это необходимо держать чашку упакован со льдом и охлажденным. </li><li> Vortex между каждым шагом обработки ультразвуком. </li><li> Приступить к части 2. </li></ul></li><li> Или же, если вы не обладаете чашку sonicator, смешать равные объемы сырой запас вируса и 0.25mg/mL трипсина. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Vortex энергично. </li><li> Инкубируйте вирус запасов / трипсин смеси в 37 ° С водяной бане в течение 30 минут. </li><li> Vortex на 5-10 минутным интервалом. </li><li> Приступить к части 2. </li></ul></li></ol> Часть 2: Заражение клетки <ol><li> Рассчитать количество вирусных частиц необходимо, чтобы заразить монослоя на желаемом множественности заражения (МВД). Как правило, высокие МВД (между 5 и 10) используется для инфекции timecourses. </li><li> Добавить необходимое количество сахарозы очищенный вирус или вирус трипсином сырой до 37 ° C вирусных питательной среды и хорошо перемешать. Вы должны использовать достаточно средств массовой информации, чтобы только покрыть дно колбы. Например, 10 мл среды для Т-175 колбу. </li><li> Удаление информации из ячеек и промойте комнатной температуре PBS. </li><li> Добавить вирус / вирусный питательной среды для каждой колбе. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Swirl мягко, наклона пластин и инкубировать при температуре 37 ° С в 5% СО2-инкубатора в течение 1 часа. </li><li> Наклон и вихревые пластин каждые 15 минут распространение вируса равномерно и сохранить клетки влажным. </li><li> Для момента времени 0hr/Mock, добавить вирусные медиа роста только, без каких-либо вирус, добавленный. </li></ul></li><li> После 1 часа инкубации удалить средах, содержащих вирус, и полоскать в три раза при комнатной температуре PBS. </li><li> Добавить максимальное количество вирусных питательную среду для каждого флакона. Например, 30 мл среды для Т-175 колбу. Начало подсчета этом качестве точки 0 раз в час. </li></ol> Часть 3: Уборочная клетки <ol><li> Проверьте клетки под микроскопом и отметить любые цитопатический эффект (ЦПЭ). </li><li> Выньте материал и промойте клетки с 30 мл комнатной температуре PBS. </li><li> Добавьте 15 мл трипсина в клетки и инкубировать в течение 2-5мин при температуре 37 ° C. </li><li> Проверьте под микроскоп для мобильного отряда и нажмите колбе осторожно, чтобы выбить клеток. </li><li> Передача клеток с стерильных серологические пипетки в 50 мл коническую трубку. </li><li> Промыть колбу с равным объемом средств массовой информации роста клеток, а также добавлять СМИ трипсинизировали клеток в конической трубе. </li><li> Центрифуга клетки при 300 х г в течение 5 минут при комнатной температуре. </li><li> Удалить трипсина / СМИ от осадок клеток. </li><li> Ресуспендируют осадок клеток в любом TRIzol реагента или лизис буфера от желаемого комплект изоляции РНК. </li><li> Если вы используете TRIzol, разделить образца в 1 мл аликвоты в 1,5 мл меченых труб Эппендорф и заморозить при -80 ° C. </li><li> Повторите эти действия для всех временных точках, сбор урожая в одном флаконе момент времени. </li></ol> Часть 4: РНК добыча образцов в TRIzol <ol><li> На данный момент, ваши образцы должны быть ресуспендировали в TRIzol реагента и готовы к обработке. </li><li> Добавить 200 мкл реагента Разделение фаз BCP на каждый 1 мл TRIzol в каждой трубке. Возможно, вам придется перенести образец больше трубку, если вы начинаете с большим количеством TRIzol. </li><li> Vortex или энергично встряхивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 2-3 минут. </li><li> Центрифуга образца при 12 000 мкг в течение 15 минут. </li><li> Передача водной фазы в новую пробирку. Водную фазу прозрачный слой на самом верху. Вы должны быть в восстановление примерно 600μL на каждый 1 мл TRIzol вы начали с. </li><li> У второго фенол / хлороформ добычи, на этот раз используя 500 мкл хлороформа на 1 мл TRIzol, вместо того, BCP. </li><li> Vortex или энергично встряхивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 2-3 минут. </li><li> Центрифуга образца при 12 000 мкг в течение 15 минут. </li><li> Передача водной фазы в новую пробирку. Водную фазу прозрачный слой на самом верху. </li><li> Добавить 20 мкг линейных акриламида для каждого образца. Линейные акриламида выступает в качестве носителя и помогает осадок РНК. </li><li> Добавить 500-миCRO, L изопропанола на 1 мл TRIzol вы начали с для каждого образца и хорошо перемешать. </li><li> Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 10 минут. </li><li> Центрифуга в микроцентрифужных на максимальной скорости в течение 10-15 минут. </li><li> РНК гранулы будут видны в нижней части трубы. Очень осторожно, удалить супернатант из трубки, либо с вакуумным аспиратором, или вручную с помощью пипетки. Не беспокоить гранул. </li><li> Вымойте гранул с 1 мл 70% этанола. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Добавить 1 мл 70% этанола, пеллет. </li><li> Центрифуга с максимальной скоростью 14 000 г в течение 5-7 минут. </li><li> Очень осторожно, удалить этанола из трубки, либо с вакуумным аспиратором, или вручную с помощью пипетки. Убедитесь, что гранулы видна в нижней части трубы. </li><li> Удалите супернатант. </li></ul></li><li> Повторите мыть шаг. После надосадочную отбрасывается, отметить, где осадок на трубке. </li><li> Воздух сухой шарик на срок не более 5 минут. Не пересушивать или РНК будет трудно восстановить! </li><li> Если вы хотите следовать необязательный лечения ДНКазы для удаления остатков ДНК из образца, ресуспендируют осадок в 17μL нуклеазы без воды. В противном случае, ресуспендируют осадок в 20 мкл нуклеазы без воды и перейдите к шагу 22. </li><li> (Дополнительно лечение ДНКазы) Использование Qiagen РНКазы без ДНКазы установлен, добавить 2μL буфера RDD и 1 мкл РНКазы восстановленный без ДНКазы я к ресуспендировали РНК. Осторожно перемешать. </li><li> (Дополнительно лечение ДНКазы) Инкубировать при 37 ° С в течение 30 минут. </li><li> (Дополнительно лечение ДНКазы) Добавить 2μL в 2,5 мМ ЭДТА и инкубировать при температуре 65 ° С в течение 5 минут для инактивации ДНКазы. Не превышайте время инактивации или температуры как раз больше / более высоких температурах может привести к деградации РНК. </li><li> Проверьте концентрацию РНК спектрофотометр. </li><li> Храните образцы РНК при температуре -80 ° C. </li><li> (Дополнительно КК) Проверьте качество РНК с использованием Agilent BioAnalyzer, или путем запуска образца на денатурирующих гель и проверки OD чтениях. (260nm и 260/280 отношение) </li></ol>

<ol><li>KH, R. ubins, LE, H. ensley, GW, B. ell, Wang, C., EJ, L. efkowitz, PO, B. rown, DA, R. elman <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., JM, G. atell, Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

Критические Шаги Часть 1 и 2 Есть несколько важных шагов для создания синхронной инфекции вакцины, первая из которых осторожны ультразвуком (или trypzinizing) вируса, чтобы разбить вирусных частиц. Vaccinia очень склонны к агрегирования, и нарушение вирусных частиц имеет важное значение для обеспечения даже заражение клеток. Для того чтобы добиться синхронного инфекции, высокая МВД (больше 2) должна быть использована для обеспечения каждой клетки инфицированы. Смесь з...

<table><tbody><tr><td>Реагент TRIzol</td><td>Реагент</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>Также подойдут аналогичные реагенты, такие как TriPure от Roche.</td></tr><tr><td>Реагент для разделения фаз BCP</td><td>Реагент</td><td>Molecular Research Center</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Набор DNase, не содержащий РНказ</td><td>Реагент</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>Обработка DNase является дополнительным этапом.</td></tr></tbody></table>

vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 1

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Семья<em&gt; Poxviridae</em&gt; Состоит из больших двухцепочечной ДНК, содержащие вирусы, которые копируют только в цитоплазме инфицированных клеток. Члены<em&gt; Orthopox</em&gt; Рода включают натуральной оспы, возбудитель человеческого оспа, обезьяньей, и вакцины (VAC), прототипных член вирус семьи. В течение относительно большого (~ 200 кб) вакцины генома, три класса гены закодированы: ранние, средние и поздние. Хотя все три класса транскрибируются вирусно-закодированных РНК-полимеразы, каждый класс выполняет различные функции в жизненном цикле вируса. Poxviruses использовать несколько стратегий для модуляции хост клеточного окружения во время инфекции. Для того чтобы понять регулирования хозяина и выражение гена вируса, мы использовали генома подходы к анализу стенограммы изобилии от обоих вирусов и клеток-хозяев. Здесь мы демонстрируем время курс инфекции клеток HeLa с вирус коровьей оспы и отбора проб РНК в нескольких точках времени после заражения. Оба хозяина и вирусных общей РНК выделяют и усиливаются для гибридизации микрочипов для анализа экспрессии генов.

Протокол Vaccinia заражения клеток HeLa и анализ хозяина и вирусных экспрессии генов. Часть 1 из 3.

Vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 1

Семейство Poxviridae состоит из крупных вирусов, содержащих двухцепочечную ДНК, которые реплицируются исключительно в цитоплазме инфицированных клеток. Представители...

Изучение временного курса инфицирования клеток HeLa вирусом вакцинии начинается с подготовки вирусной инфекции, заражения клеток и последующего выделения РНК из инфицированных клеток в несколько временных точек после заражения. Полученная РНК может быть впоследствии амплифицирована для гибридизации с микрочипами с целью анализа экспрессии генов. Здравствуйте, я Джуди Энн из лаборатории Кейт Ирвинс в Институте биомедицинских исследований Уайтхеда.Сегодня мы продемонстрируем процедуру инфицирования клеток млекопитающих вирусом вакцины с анализом временнóго курса, а также последующее выделение РНК из инфицированных клеток в разные моменты времени после заражения. Данная методика является начальным этапом более широкого протокола, направленного на выделение и амплификацию РНК для оценки экспрессии генов вируса в процессе инфекции; этот процесс будет завершен в двух других видео JoVE. Итак, приступим. Для подготовки к инфицированию вырастите клетки HeLa в колбах и дождитесь, пока плотность монослоя клеток достигнет примерно 80%.Далее обязательно подготовьте достаточное количество среды для культивирования вируса для проведения эксперимента. С использованием стандартной среды DMEM с 2% FBS без добавления антибиотиков инфицирование можно проводить либо с использованием имеющегося в наличии стока вируса вакцинии с известным титром, либо с использованием вируса, очищенного методом градиентного осаждения в сахарозе, с известным титром. Если вас беспокоит экспрессия генов хозяина и вы используете вирус, очищенный в сахарозе, перейдите к следующему разделу.Если вы используете неочищенный вирус вакцинии, перед заражением подвергните стоковый раствор вируса воздействию ультразвука и разлейте его по аликвотам; для этого поместите пробирку в стакан с водяной баней, состоящей преимущественно из льда и небольшого количества воды, и обрабатывайте ультразвуком при мощности около 30 W в течение 20 секунд. Перемешайте содержимое пробирки на вортексе и повторите процедуру соникации трижды, при необходимости добавляя лед, чтобы стакан оставался заполненным и охлажденным; обязательно используйте вортекс между каждым этапом соникации. Если у вас нет соникатора, смешайте равный объем стока неочищенного вируса в концентрации 0,25 mg/mL.Интенсивно перемешайте сток вируса с трипсином на вортексе, затем инкубируйте смесь в водяной бане при 37 °C в течение 30 минут. Каждые 5–10 минут используйте вортекс до момента инфицирования клеток. Сначала рассчитайте количество вирусных частиц, необходимое для инфицирования монослоя при заданной множественности заражения.Или MOI. Обычно для изучения кинетики инфекции используют высокую MOI в диапазоне от 5 до 10. Затем добавьте необходимое количество вируса, очищенного сахарозой, или неочищенного вируса в среду для культивирования вирусов при 37 °C и тщательно перемешайте.Необходимо использовать достаточное количество среды, чтобы она только покрывала дно флакона. Для флакона T 1 75 будет достаточно 10 milliliters среды. Удалите среду из флакона с клетками и промойте их PBS комнатной температуры.Добавьте вирус или среду для культивирования вируса в каждую колбу для контрольной точки «ноль часов». В колбы для имитации (mock) добавьте только среду для культивирования вируса без самого вируса; аккуратно перемешайте круговыми движениями и наклоните планшеты, после чего инкубируйте их при 37 °C в инкубаторе с 5% CO2 в течение одного часа. Обязательно наклоняйте и перемешивайте планшеты каждые 15 минут для равномерного распределения вируса и поддержания увлажненности клеток.После инкубации удалите среду, содержащую вирус, и трижды промойте флаконы PBS комнатной температуры. Добавьте в каждый флакон максимально возможный объем среды для культивирования вируса.Например, 30 мл среды для флакона T 1 75. Вы можете начать отсчет времени от нулевой точки в желаемый момент времени после инфицирования. Осмотрите клетки под микроскопом и отметьте любые цитопатические эффекты или ЦПЭ.Удалите среду и промойте клетки 30 миллилитрами PBS комнатной температуры. Затем добавьте к клеткам 15 миллилитров трипсина и инкубируйте в течение двух-пяти минут. При 37 °C проверьте под микроскопом открепление клеток и осторожно постучите по флакону, чтобы способствовать их отделению.Перенесите клетки с помощью стерильной серологической пипетки в коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Промойте колбу равным объемом среды для роста клеток и добавьте эту среду к клеткам, обработанным трипсином, в конической пробирке. Центрифугируйте клетки при 500 Gs в течение пяти минут при комнатной температуре.После центрифугирования удалите культуральную среду, ресуспендируйте осадок клеток в реагенте TRIzol или в лизирующем буфере из выбранного вами набора для выделения РНК. Если вы используете TRIzol, разделите образец по 1 мл в маркированные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и заморозьте при температуре -80 °C. Повторите процедуру для всех временных точек.Сбор образцов из одной колбы для каждой временной точки. На данном этапе образец должен быть ресуспендирован в триольном реагенте и готов к дальнейшей обработке. Добавьте 200 µL реагента для разделения фаз BCP.На каждый один миллилитр триола в каждой пробирке вместо фенола используют BCP или 1-бром-3-хлорпропан. Для снижения загрязнения геномной ДНК может потребоваться перенести образец в пробирку большего объема. Если вы начинаете работу с большим количеством триола, перемешайте его на вортексе или интенсивно встряхните и инкубируйте при комнатной температуре в течение двух-трех минут; после инкубации центрифугируйте образец при 12 000 ×g в течение 15 минут.Водная фаза должна быть видна в виде прозрачного слоя сверху. Перенесите водную фазу в чистую пробирку. Вы должны получить примерно 600 µL на каждый миллилитр триазола, использованного изначально.Выполните повторную фенол-хлороформную экстракцию. В этот раз используйте 500 µL хлороформа на 1 mL триазола вместо BCP. Вторая экстракция хлороформом проводится для удаления любых следов органического растворителя, так как даже минимальные количества могут ингибировать последующие этапы амплификации.Интенсивно перемешайте на вортексе или встряхните, затем инкубируйте при комнатной температуре в течение двух-трех минут. Центрифугируйте образец при 12,000 GS в течение 15 минут. После центрифугирования перенесите водную фазу в новую пробирку.Помните, что водная фаза представляет собой прозрачный верхний слой. Затем добавьте по 20 µg линейного акриламида в каждый образец. Линейный акриламид выполняет роль носителя и способствует осаждению РНК.Добавьте в каждый образец 500 µL изопропанола на каждый 1 мл исходного триола и перемешайте. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 10 минут, после чего центрифугируйте в микроцентрифуге на максимальной скорости от 10 до 15 минут. После центрифугирования на дне пробирки будет виден осадок РНК.Очень осторожно удалите супернатант из пробирки с помощью вакуумного аспиратора или вручную пипеткой. Не заденьте осадок. Промойте осадок одним миллилитром 70% ethanol и центрифугируйте на максимальной скорости в течение пяти-семи минут.Действуйте очень осторожно. Удалите этанол из пробирки с помощью вакуумного аспиратора или вручную с помощью пипетки. Удалите супернатант.Убедитесь, что на дне пробирки виден осадок. Повторите этот этап промывки после удаления супернатанта. Отметьте на пробирке местоположение осадка.Высушите осадок на воздухе не более пяти минут. Не пересушивайте его, иначе РНК будет трудно реконструировать. Затем, если планируется обработка ДНК, суспендируйте осадок в 17 µL воды, свободной от нуклеаз.Если обработка D'S не планируется, ресуспендируйте осадок в 20 µL. Для обработки D'S используйте набор KaiGen RNA free DNA. Добавьте 2 µL буфера RDD и 1 µL реконструированной RNA free.Смешайте ДНКазу I с ресуспендированной РНК, осторожно перемешайте и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут. Затем добавьте 2 µL 2,5 мМ EDTA и инкубируйте при 65 °C в течение пяти минут для инактивации ДНКазы. Не превышайте время или температуру инактивации, так как более длительное воздействие и более высокие температуры могут привести к деградации РНК.Теперь, когда обработка ДНК завершена, проверьте концентрацию РНК с помощью спектрофотометра. Следы фенола или BCP могут проявляться в виде пика на 270 нм помимо стандартного пика на 260 нм.При измерении абсорбции суммарной РНК после экстракции, если обнаруживается подобное загрязнение, проведите очистку РНК с помощью метода экстракции на фильтре или колонке перед тем, как переходить к амплификации. Образец РНК можно хранить при температуре -80 °C. При необходимости вы можете проверить качество РНК с помощью биоанализатора Agilent, путем электрофореза образца в денатурирующем геле или путем анализа показателей оптической плотности (OD) на биоанализаторе.О качестве РНК свидетельствует показатель целостности РНК или RIN. Система RIN основана на шкале от 1 до 10, где 1 соответствует наиболее деградировавшему профилю, а 10 — наиболее сохранному. Мы только что продемонстрировали вам, как провести инфицирование вакцинированным вирусом с анализом временного ряда и как выделить РНК из инфицированных клеток в различные моменты времени после заражения.При выполнении данной процедуры важно помнить, что организация синхронного заражения вакцинией включает несколько критических этапов. Во-первых, это тщательная соникация или трипсинизация вируса. Необходимо дезагрегировать вирусные частицы, так как вакциния сильно склонна к агрегации, что может препятствовать равномерному заражению клеток.Во-вторых, для достижения асинхронности инфекции следует использовать высокую множественность заражения (MOI) более двух, чтобы гарантировать инфицирование каждой клетки. Смесь инфицированных и неинфицированных клеток приведет к нескольким раундам заражения, возникновению неоднородных смесей временных точек, а также к асинхронным транскрипционным ответам вируса и хозяина. В-третьих, инфицирование следует проводить в минимальном объеме среды для обеспечения максимальной адсорбции вируса на клетках.Кроме того, регулярное встряхивание колбы или чашек с культурой каждые 10 минут позволяет равномерно распределить вирус по колбе и предотвращает высыхание клеток. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.Обязательно посмотрите другие видео из этой серии, в которых демонстрируется процедура линейной амплификации образцов РНК, а также подготовка и очистка флуоресцентно меченных РНК.

vaccinia-virus-infection-temporal-analysis-virus-gene-expression-part

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Протокол Vaccinia заражения клеток HeLa и анализ хозяина и вирусных экспрессии генов. Часть 2 из 3.

Vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 2

Протокол Vaccinia заражения клеток HeLa и анализ хозяина и вирусных экспрессии генов. Часть 3 описывает процесс флуоресцентно маркировки усиливается РНК из хозяина и вирусных образцов аминокислот аллилового связи красителей. Часть 3 из 3.

Vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 3

Новый хозяин факторов, связанных с вирусной инфекцией, могут быть идентифицированы с помощью клеточной генома потери функция экранирования RNAi.

RNAi Скрининг на хост факторов, участвующих в Vaccinia Вирусной инфекции использованием Drosophila Ячейки

Онколитических вирусы являются перспективными для рака терапии. Возможность установить infectability живых образцов ткани, полученных от пациентов до начала лечения является уникальным преимуществом этого терапевтического подхода. Этот протокол описывает процесс тканей...

Экс Vivo Заражение живой ткани с онколитических Вирусы

Мы описываем протокол определить ключевые роли принимающей сигнальных молекул в литическая репликация вируса герпеса модели, гамма-герпесвирусов 68 (γHV68). Использование генетически модифицированных мышей штамма эмбриональных фибробластов и для γHV68 литической репликации, протокол позволяет как фенотипическая характеристика и молекулярно допроса вирус-хозяин взаимодействий в вирусную литической репликации.

Пройдя Host-вирус Взаимодействие в Литические репликации Модель Herpesvirus

Метод трассировки синаптически связанных нейронов описано. Мы используем TVA специфику вверх клетки, чтобы исследовать, является ли клетка интерес населения получает синаптические вход из генетически определены типы клеток.

Вирусный отслеживание генетически определенных нервной системы

Быстрый и модульный протокол для генерации рекомбинантных вирусов вакцины, выражаюющих флуоресцентно помеченные белки одновременно с использованием метода преходящее доминирующее отбора описано здесь.

Методология эффективного поколения флуоресцентно помеченных вирусных белков Vaccinia

Мы описываем использование флуоресцентного репортера вируса коровьей оспы, который позволяет в режиме реального времени измерения вирусной инфекционной и экспрессии генов через выражение стадии конкретных спектрально различных репортеров флуорофорами. Мы подробно метод пластина основе для точного определения стадии, на которой репликация вируса поражается в ответ на небольшой торможения молекулы.

Коровьей оспы Reporter Вирусы для Количественная Вирусный функции на всех этапах экспрессии генов

Вирус коровьей оспы (VV) широко используется в медико-биологических исследований и улучшения здоровья человека. В данной статье описывается простой, очень эффективный метод для редактирования В.В. генома с использованием системы CRISPR-cas9.

Простой и эффективный подход к Construct Mutant осповакцины вирусного вектора

Здесь мы представляем протоколы для идентификации 1) вирус кодировке иммунокорректоров, которые способствуют арбовирусных репликации и 2) эукариотических хост факторы, которые ограничивают арбовирусных репликации. Эти методы на основе флуоресценции и люминесценции позволяют исследователям быстро получить количественные отсчетов арбовирусных репликации в упрощенческой анализов с низкого соотношения сигнал шум.

Арбовирусных инфекций как скрининг инструменты для выявления вирусной иммуномодуляторов и принимающих противовирусное факторов

ICP0 подвергается ядерной и цитоплазматических транслокации во время инфекции HSV-1. Молекулярный механизм этого события не известна. Здесь мы описываем использование Конфокальный микроскоп как инструмент для количественной оценки ICP0 движения в инфекции HSV-1, которая закладывает основу для количественного анализа ICP0 транслокации в механистической будущих исследований.

Временной анализ ядерных и цитоплазматических транслокации герпеса вирус 1 белок, Immunofluorescent конфокальная микроскопия

Изучите метод инфицирования клеток HeLa вирусом вакцинии и анализа экспрессии генов. Этот протокол позволяет исследовать динамику вирусно-хозяйственных взаимодействий в реальном времени.

Vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 1

Больше видео