Name: Vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 2 (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-10T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Узнайте метод анализа экспрессии генов вируса вакцинии в клетках HeLa с использованием обратной транскрипции и амплификации РНК. Этот протокол позволяет исследовать изменения экспрессии генов хозяина и вируса.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Уайтхед Институт стипендиаты фондов

Часть 1: синтеза кДНК из РНК <ol><li> Перед использованием Амбион Amino Аллил MessageAmp II комплекта, добавьте рекомендуемый объем в размере 100% этанола, мыть буферов. </li><li> В трубке реакции ПЦР, добавьте между 100ng к 5 мкг тотальной РНК и 1 мкл Т7 олиго (дТ) грунт. Довести объем до 12μl с нуклеазы без воды. </li><li> Инкубируйте образцы при температуре 70 ° С в течение 10 мин в амплификаторе. </li><li> Удалить РНК образцов от 70 ° С и центрифуги кратко. Место на льду. </li><li> Подготовка 1-й Strand Синтез мастер перемешать и хранить при комнатной температуре (с 10% превышения для пипетирования ошибка). (Таблица 1) </li><li> Аккуратно пипетки Mix Master или фильм перемешать, а затем центрифуги кратко. </li><li> Передача 8μl из Master Mix к каждой пробе РНК. Смешать с помощью пипетки вверх и вниз по 3-4 раза. </li><li> Инкубировать при 42 ° С в течение 2 часов в амплификаторе. </li><li> Центрифуга образцы на короткое время и место на льду. Сразу же переходите к следующему шагу синтеза двухцепочечной ДНК. </li><li> Подготовка 2-й Strand Синтез мастер смеси на льду (с 10% превышения для пипетирования ошибка). (Табл. 2) </li><li> Аккуратно пипетки Mix Master или фильм перемешать, а затем центрифуги кратко. </li><li> Передача 80μl к каждому образцу и осторожно перемешать с помощью пипетки вверх-вниз 3-4 раза. </li><li> Инкубировать при 16 ° С в течение 2 часов в амплификаторе. </li><li> После 2 часов инкубации, приступить к кДНК очистке шаг или немедленно заморозить при -20 ° C. </li></ol> Часть 2: двухцепочечной кДНК очистке <ol><li> Удалить кДНК Чистый из холодильника и дайте ему, чтобы уравновесить до комнатной температуры в течение 30 минут перед использованием. Встряхните бутылку, чтобы полностью ресуспендирования магнитного кДНК обязательным бисер перед использованием. </li><li> Алиготе нуклеазы без воды в 1,5 мл трубки и инкубировать при 50-60 ° С в течение минимум 10 минут в течение предыдущего 2hr инкубации. </li><li> Добавить 180μl кДНК Чистая для каждого образца, и тщательно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Передача образцов для 96-луночного круглым дном тарелку. </li><li> Продолжайте смешивать образцы, осторожно покачивая пластину на орбитальном шейкере в течение 2 минут. </li><li> Перемещение пластины для магнитного стоять, чтобы захватить магнитных бус. Оставьте пластину на стенде в течение приблизительно 6 минут, или пока смесь не станет прозрачной и обязательным бисера гранулированный. </li><li> Тщательно аспирата супернатанта с вакуумным аспиратором, не нарушая магнитных бус. Кроме того, осторожно удалите супернатант с пипеткой и отбросить супернатант. </li><li> Удалите пластину из магнитного стенда. </li><li> Добавить 150 мкл кДНК промывочного буфера в каждую лунку и встряхните пластине в течение 1 минуты на орбитальном шейкере при умеренной скорости. Бисер НЕ разойдутся на этом этапе, в связи с низким поверхностным натяжением из промывочного буфера. </li><li> Перемещение пластины для магнитного стоять, чтобы захватить магнитных бус. </li><li> Тщательно аспирата супернатанта с вакуумным аспиратором, не нарушая магнитных бус. Кроме того, осторожно удалите супернатант с пипеткой и отбросить супернатант. </li><li> Удалите пластину из магнитного стенда. </li><li> Повторите мыть 2-й раз с 150 мкл кДНК промывочного буфера. </li><li> После 2-й вымыть, обсушить бисером встряхиванием пластины в течение 2 минут на орбитальном шейкере при максимальной скорости. Не пересушить! </li><li> Элюировать кДНК из бисера, добавив 18μl из разогретой нуклеазы без воды каждого образца. </li><li> Энергично встряхните пластине в течение 3 минут на орбитальном шейкере, а затем проверить, чтобы убедиться, магнитных шариков полностью рассеялись. Если нет, то продолжать дрожать. </li><li> После магнитных шариков полностью рассеяны, перемещать пластину магнитного стоять, чтобы захватить магнитных шариков. </li><li> Тщательно передачи элюировали кДНК (~ 16μl) для новой пластинкой ПЦР (или ПЦР). </li><li> Перейдем непосредственно к следующему шагу, или заморозить кДНК при температуре -20 ° C. </li></ol> Часть 3: в пробирке транскрипции (ИВТ) <ol><li> Подготовьте смесь IVT мастер при комнатной температуре. (Табл. 3) </li><li> Аккуратно пипетки Mix Master или фильм перемешать, и центрифуга кратко. </li><li> Добавить 24μl для каждого образца, и осторожно перемешать с помощью пипетки вверх-вниз 3-4 раза. </li><li> Инкубировать при 37 ° С в течение 14 часов в амплификаторе, затем, удерживая при 4 ° С до готовности для следующего шага. </li></ol> Часть 4: Арна очистке после IVT <ol><li> Vortex связывание РНК бисером кратко получить даже смесь перед использованием. </li><li> Подготовка Арна Связывание Смешать при комнатной температуре (табл. 4) Это может быть сделано загодя -. Подготовлены обязательным смесь можно хранить при комнатной температуре на срок до одной недели. </li><li> Хорошо перемешайте на вортексе. </li><li> Алиготе буфера Арна Элюирование в 1,5 мл трубки и инкубировать при 50-60 ° С в течение не менее 10 минут. </li><li> Добавить 70μl из Арна обязательным смесидля каждого образца и хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз по 3-4 раза. </li><li> Передача образца от пластины ПЦР для 96-луночного круглым дном тарелку. </li><li> Добавить 50 мкл 100% изопропанола к каждому образцу и хорошо перемешать с помощью пипетки вверх-вниз 3-4 раза. </li><li> Осторожно встряхните пластину на орбитальный шейкер, по крайней мере 2 минуты для тщательного перемешивания образцов. </li><li> Перемещение пластины для магнитного стоять, чтобы захватить магнитных бус. Оставьте пластину на стенде, пока смесь не станет прозрачной и обязательным бисера гранулированный. </li><li> Тщательно аспирата супернатанта с вакуумным аспиратором, не нарушая магнитных бус. Кроме того, осторожно удалите супернатант с пипеткой и отбросить супернатант. </li><li> Удалите пластину из магнитного стенда. </li><li> Добавить 100 мкл Арна промывочного раствора в каждую лунку и встряхните пластине в течение 1 минуты на орбитальном шейкере при умеренной скорости. Бусины могут не расходиться на этот шаг. </li><li> Перемещение пластины для магнитного стоять, чтобы захватить магнитных бус. </li><li> Тщательно аспирата супернатанта с вакуумным аспиратором, не нарушая магнитных бус. Кроме того, осторожно удалите супернатант с пипеткой и отбросить супернатант. </li><li> Удалите пластину из магнитного стенда. </li><li> Повторите мыть 2-й раз с 100 мкл промывочного раствора Арна. </li><li> После 2-й вымыть, обсушить бисером встряхиванием пластины в течение 1 минуты на орбитальном шейкере при максимальной скорости. Не пересушить образцы! </li><li> Элюировать Арна из бисера, добавив 40μl разогретой Элюирование Арна буфера для каждого образца. </li><li> Энергично встряхните пластину на орбитальном шейкере в течение 3 минут, а затем проверить, чтобы убедиться, магнитных шариков полностью рассеялись. Если нет, то продолжать дрожать. </li><li> После магнитных шариков полностью рассеяны, перемещать пластину магнитного стоять, чтобы захватить магнитных шариков. Супернатант содержит очищенный амино-аллил включены Арна. </li><li> Тщательно передачи элюировали Арна к новой пластинкой ПЦР (или ПЦР). </li><li> (Необязательный шаг) Проверьте концентрацию РНК образцов путем измерения 1.5μl на NanoDrop спектрофотометр. </li><li> Сразу же продолжать на следующий шаг, и не храните Арна при температуре -80 ° C. </li></ol> Таблица 1: 1-й кДНК Strand Синтез Master Mix <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Реагент </td><td> Сумма за 1 реакция </td></tr><tr><td> 10X первый буфер Strand </td><td> 2 мкл </td></tr><tr><td> дНТФ Mix </td><td> 4 мкл </td></tr><tr><td> Ингибитор рибонуклеазы </td><td> 1 мкл </td></tr><tr><td> Массив сценарий </td><td> 1 мкл </td></tr></tbody></table> Таблица 2: 2-й кДНК Strand Синтез Master Mix <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Реагент </td><td> Сумма за 1 реакция </td></tr><tr><td> Нуклеазы свободной воды </td><td> 63 мкл </td></tr><tr><td> Второй 10X буфера Strand </td><td> 10 мкл </td></tr><tr><td> дНТФ Mix </td><td> 4 мкл </td></tr><tr><td> ДНК-полимераза </td><td> 2 мкл </td></tr><tr><td> РНКазы Н </td><td> 1 мкл </td></tr></tbody></table> Таблица 3: IVT Master Mix <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Реагент </td><td> Сумма за 1 реакция </td></tr><tr><td> aaUTP решение (75 мм) </td><td> 2 мкл </td></tr><tr><td> АТФ, CTP, GTP смеси (25 мМ) </td><td> 12 мкл </td></tr><tr><td> T7 UTP решение (75 мм) </td><td> 2 мкл </td></tr><tr><td> T7 10X буфера реакции </td><td> 4 мкл </td></tr><tr><td> T7 ферментов Mix </td><td> 4 мкл </td></tr></tbody></table> Таблица 4: Связывание Арна Mix <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Реагент </td><td> Сумма за 1 реакция </td></tr><tr><td> Связывание РНК бисер * </td><td> 10 мкл </td></tr><tr><td> Бусы ресуспендирования Решение * </td><td> 4 мкл </td></tr><tr><td> 100% изопропанола ** </td><td> 6 мкл </td></tr><tr><td> Арна Связывание Концентрат буфера </td><td> 50 мкл </td></tr></tbody></table> * Смешать связывание РНК бисер с борта решение ресуспендирования в первую очередь. ** Добавьте изопропанола и хорошо перемешать перед добавлением Арна обязательным концентрат буфера.

<ol><li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

Авторы не заявляют о наличии конфликта интересов.

Критические Шаги Второй тур усиления не рекомендуется в качестве смещения в массиве данных не наблюдалось. Смешивание тщательно на каждом шагу ферментативной (1-й и 2-й цепи кДНК синтеза, IVT) имеет решающее значение для получения хороших урожаев усиления, как инкубационный каждого ферментативного шаг при соответствующей температуре. Циклер ПЦР с регулируемым подогревом крышкой предпочтительнее - даже отклонения как малые, как 2-3 градуса в течение IVT в печь воздуха гибр...

<table><tbody><tr><td>Набор для амплификации aRNA Amino Allyl MessageAmp II</td><td>Реагент</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1753</td><td>На 20 реакций</td></tr><tr><td>Набор для амплификации aRNA Amino Allyl MessageAmp II</td><td>Реагент</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1821</td><td>На 100 реакций, в 96-луночном формате</td></tr><tr><td>УФ-видимый спектрофотометр NanoDrop ND-1000</td><td>Прочее</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>Или эквивалентный спектрофотометр</td></tr></tbody></table>

vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Семья<em&gt; Poxviridae</em&gt; Состоит из больших двухцепочечной ДНК, содержащие вирусы, которые копируют только в цитоплазме инфицированных клеток. Члены<em&gt; Orthopox</em&gt; Рода включают натуральной оспы, возбудитель человеческого оспа, обезьяньей, и вакцины (VAC), прототипных член вирус семьи. В течение относительно большого (~ 200 кб) вакцины генома, три класса гены закодированы: ранние, средние и поздние. Хотя все три класса транскрибируются вирусно-закодированных РНК-полимеразы, каждый класс выполняет различные функции в жизненном цикле вируса. Poxviruses использовать несколько стратегий для модуляции хост клеточного окружения во время инфекции. Для того чтобы понять регулирования хозяина и выражение гена вируса, мы использовали генома подходы к анализу стенограммы изобилии от обоих вирусов и клеток-хозяев. Здесь мы демонстрируем время курс инфекции клеток HeLa с вирус коровьей оспы и отбора проб РНК в нескольких точках времени после заражения. Оба хозяина и вирусных общей РНК выделяют и усиливаются для гибридизации микрочипов для анализа экспрессии генов.

Протокол Vaccinia заражения клеток HeLa и анализ хозяина и вирусных экспрессии генов. Часть 2 из 3.

Vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 2

Семейство Poxviridae состоит из крупных вирусов, содержащих двухцепочечную ДНК, которые реплицируются исключительно в цитоплазме инфицированных клеток. Представители...

Здравствуйте, я Джуди Йен из лаборатории Кейт Рубинс в Институте биомедицинских исследований Уайтхед. После заражения клеток HeLa вирусом вакцинии и выделения тотальной РНК, что было показано в предыдущем видеопротоколе JoVE, вирусную РНК можно выделить и амплифицировать с помощью обратной транскрипции и транскрипции in vitro; амплифицированная РНК будет использована далее для микроматричного анализа экспрессии вирусных генов и генов хозяина. Итак, приступим.Для начала синтеза кДНК из РНК добавьте рекомендуемый объем 100% этанола в буферы для промывки перед использованием набора Ambient Amino Allele Message AMP 2. В пробирку для ПЦР добавьте от 100 нг до 5 мкг общей РНК и 1 µL олигопраймера T7. Доведите объем до 12 µL водой, свободной от нуклеаз. Инкубируйте образцы в термоциклере при 70 °C в течение 10 минут.Затем извлеките образцы РНК из термостата при 70 °C и поместите в центрифугу. Кратковременно после центрифугирования поместите образцы на лед. Приготовьте мастер-микс для синтеза первой цепи с избытком объема 10%, чтобы компенсировать возможные потери при пипетировании.Оставьте смесь при комнатной температуре, аккуратно перемешайте мастер-микс с помощью пипетки или легким постукиванием по пробирке, а затем кратковременно центрифугируйте. После центрифугирования перенесите 8 µL мастер-микса в каждый образец РНК, перемешайте путем пипетирования вверх-вниз три-четыре раза, затем инкубируйте при 42 °C в течение двух часов в термоциклере. После инкубации кратковременно центрифугируйте образцы и поместите их на лед. Немедленно переходите к следующему этапу синтеза цДНК.Подготовьте мастер-микс для синтеза второй цепи на льду с 10%-ным избытком объема для компенсации погрешности пипетирования; аккуратно перемешайте мастер-микс пипетированием или легким постукиванием, после чего кратковременно центрифугируйте. Перенесите по 80 µL в каждый образец и осторожно перемешайте, выполнив три-четыре цикла всасывания и вытеснения жидкости. Инкубируйте в термоциклере при 16 °C в течение двух часов.После двухчасовой инкубации перейдите к этапу очистки кДНК или немедленно заморозьте образец при температуре -20 °C. Чтобы начать очистку двухцепочечной кДНК, сначала достаньте cDNA pure из холодильника и дайте ей выстояться при комнатной температуре в течение 30 минут перед использованием; перед применением встряхните флакон, чтобы полностью ресуспендировать магнитные hạt для связывания кДНК; отмерьте порцию воды, свободной от нуклеаз, в пробирку объемом 1,5 мл и инкубируйте при температуре от 50 до 60 °C в течение не менее 10 минут.В течение предыдущих двух часов инкубации добавьте 180 µL CD NA pure в каждый образец и тщательно перемешайте путем пипетирования. Перенесите образцы в 96-луночный планшет с круглым дном. После переноса образцов в планшет продолжите их перемешивание, осторожно встряхивая планшет на орбитальном шейкере в течение не менее двух минут.Перенесите планшет на магнитный штатив для осаждения магнитных бусин. Оставьте планшет на штативе примерно на шесть минут или до тех пор, пока смесь не станет прозрачной, а связывающие бусины не образуют осадок. Осторожно удалите супернатант с помощью вакуумного аспиратора, не затрагивая магнитные бусины.В качестве альтернативы осторожно удалите супернатант с помощью пипетки и утилизируйте его. После удаления супернатанта снимите планшет с магнитной подставки. Добавьте по 150 µL буфера для промывки cDNA в каждую лунку и встряхивайте планшет в течение одной минуты на орбитальном шейкере при умеренной скорости.На этом этапе гранулы не будут диспергировать из-за низкого поверхностного натяжения промывочного буфера. После встряхивания верните планшет на магнитную подставку. Чтобы зафиксировать магнитные гранулы, осторожно удалите супернатант с помощью вакуумного аспиратора, не затрагивая магнитные гранулы.Либо аккуратно удалите супернатант с помощью пипетки и утилизируйте его. Снимите планшет с магнитного сепаратора. Повторите промывку второй раз, используя 150 µL буфера для промывки кДНК.После второй промывки высушите гранулы, встряхивая планшет в течение двух минут на орбитальном шейкере на максимальной скорости. Важно не допустить пересушивания гранул. Затем элюируйте кДНК с гранул, энергично добавив в каждый образец 18 µL предварительно нагретой воды, свободной от нуклеаз.Встряхивайте планшет в течение трех минут на орбитальном шейкере. Затем убедитесь, что магнитные частицы полностью диспергированы. Если это не так, продолжайте встряхивание.После полного диспергирования магнитных шариков переместите планшет на магнитный штатив. Чтобы собрать магнитные шарики, осторожно перенесите элюированную кд НК в новый ПЦР-планшет или ПЦР-пробирки. Объем восстанавливаемого элюата должен составлять примерно 16 µL на образец.Переходите непосредственно к следующему этапу или заморозьте кДНК при -20 °C. Приготовьте основную смесь для IVT при комнатной температуре. Осторожно перемешайте основную смесь с помощью пипетки или легкого встряхивания, затем кратковременно центрифугируйте.После центрифугирования добавьте по 24 µL в каждый образец и аккуратно перемешайте, три или четыре раза пропипетировав содержимое; инкубируйте при 37 °C в течение 14 часов в термоциклере. Затем храните при 4 °C до начала следующего этапа. Перед использованием кратковременно перемешайте магнитные бусины для связывания РНК на вортексе до получения однородной смеси. Приготовьте смесь А для связывания РНК при комнатной температуре.Это можно сделать заранее. Приготовленную смесь для связывания можно хранить при комнатной температуре до одной недели. Тщательно перемешайте путем вортексирования аликвоту буфера для элюции РНК A в пробирке объемом 1,5 мл и инкубируйте при 50–60 °C не менее 10 минут.Теперь добавьте по 70 µL смеси для связывания РНК A в каждый образец и тщательно перемешайте, три или четыре раза пропипетировав содержимое вверх-вниз. Перенесите образцы из ПЦР-планшета в 96-луночный планшет с круглым дном. Затем добавьте по 50 µL стопроцентного изопропанола в каждый образец и тщательно перемешайте, три или четыре раза пропипетировав содержимое вверх-вниз.Осторожно встряхните планшет на орбитальном шейкере в течение не менее двух минут. Для тщательного перемешивания образцов перенесите планшет на магнитную подставку, чтобы собрать магнитные частицы.Оставьте планшет на подставке до тех пор, пока смесь не станет прозрачной, а связывающие магнитосферы не выпадут в осадок. После осаждения магнитосфер осторожно удалите супернатант с помощью вакуумного аспиратора, не затрагивая магнитные частицы. В качестве альтернативы осторожно удалите супернатант пипеткой и утилизируйте его.Снимите планшет с магнитного стенда. Затем добавьте по 100 µL раствора для промывки РНК в каждую лунку и встряхивайте планшет в течение одной минуты на орбитальном шейкере на умеренной скорости; гранулы не обязательно должны полностью диспергировать. На этом этапе перенесите планшет на магнитный стенд.Для захвата магнитных частиц. Осторожно удалите супернатант с помощью вакуумного аспиратора, не задевая магнитные частицы. В качестве альтернативы осторожно удалите супернатант пипеткой и утилизируйте его.После удаления супернатанта снимите планшет с магнитного штатива. Повторите промывку второй раз, используя 100 µL раствора для промывки РНК. После второй промывки высушите гранулы, встряхнув планшет в течение одной минуты на орбитальном шейкере на максимальной скорости.Помните, что образцы нельзя пересушивать. Элюируйте A RNA с магнитных частиц, добавив 40 µL предварительно нагретого буфера для элюции A RNA. Энергично встряхните планшет с каждым образцом на орбитальном шейкере в течение трех минут. Затем убедитесь, что магнитные частицы полностью диспергированы.Если нет, продолжайте встряхивание. Как только магнитные бусины полностью диспергируют, перенесите планшет на магнитную подставку для захвата магнитных бусин. Супернатант содержит очищенный аллель амино, в который встроена RNA.Осторожно перенесите элюированную RNA в новый PCR-планшет или PCR-пробирки. На этом этапе можно проверить концентрацию RNA в образцах, измерив 1.5 µL на спектрофотометре NanoDrop. Немедленно переходите к следующему шагу или храните RNA при температуре -80 °C.Мы только что продемонстрировали вам способ флуоресцентного мечения амплифицированных образцов РНК с включенными иммуноаллелями для микрочиповой гибридизации. При выполнении этой процедуры важно помнить, что повторный раунд амплификации не рекомендуется. Поскольку наблюдались систематические ошибки и искажения данных массива, также важно тщательно перемешивать реакционную смесь на каждом ферментативном этапе синтеза первой и второй цепей.Синтез кДНК или этап IVT имеет решающее значение для получения высокого выхода амплификации, так же как и инкубация на каждом ферментативном этапе при соответствующей температуре. Рекомендуется использовать ПЦР-амплификатор с регулируемой нагреваемой крышкой, поскольку даже отклонения в два-три градуса во время транскрипции in vitro в воздушной гибридизационной печи или водяной бане могут существенно повлиять на выход амплифицированного продукта.На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах. Обязательно посмотрите другие видео из этой серии, в которых мы показываем, как проводить инфекцию вируса вакцинии с временным курсом, экстракцию РНК из образцов, а также подготовку и очистку флуоресцентно меченной РНК.

vaccinia-virus-infection-temporal-analysis-virus-gene-expression-part

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Протокол Vaccinia заражения клеток HeLa и анализ хозяина и вирусных экспрессии генов. Часть 1 из 3.

Vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 1

Протокол Vaccinia заражения клеток HeLa и анализ хозяина и вирусных экспрессии генов. Часть 3 описывает процесс флуоресцентно маркировки усиливается РНК из хозяина и вирусных образцов аминокислот аллилового связи красителей. Часть 3 из 3.

Vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 3

Новый хозяин факторов, связанных с вирусной инфекцией, могут быть идентифицированы с помощью клеточной генома потери функция экранирования RNAi.

RNAi Скрининг на хост факторов, участвующих в Vaccinia Вирусной инфекции использованием Drosophila Ячейки

Онколитических вирусы являются перспективными для рака терапии. Возможность установить infectability живых образцов ткани, полученных от пациентов до начала лечения является уникальным преимуществом этого терапевтического подхода. Этот протокол описывает процесс тканей...

Экс Vivo Заражение живой ткани с онколитических Вирусы

Мы описываем протокол определить ключевые роли принимающей сигнальных молекул в литическая репликация вируса герпеса модели, гамма-герпесвирусов 68 (γHV68). Использование генетически модифицированных мышей штамма эмбриональных фибробластов и для γHV68 литической репликации, протокол позволяет как фенотипическая характеристика и молекулярно допроса вирус-хозяин взаимодействий в вирусную литической репликации.

Пройдя Host-вирус Взаимодействие в Литические репликации Модель Herpesvirus

Метод трассировки синаптически связанных нейронов описано. Мы используем TVA специфику вверх клетки, чтобы исследовать, является ли клетка интерес населения получает синаптические вход из генетически определены типы клеток.

Вирусный отслеживание генетически определенных нервной системы

Быстрый и модульный протокол для генерации рекомбинантных вирусов вакцины, выражаюющих флуоресцентно помеченные белки одновременно с использованием метода преходящее доминирующее отбора описано здесь.

Методология эффективного поколения флуоресцентно помеченных вирусных белков Vaccinia

Мы описываем использование флуоресцентного репортера вируса коровьей оспы, который позволяет в режиме реального времени измерения вирусной инфекционной и экспрессии генов через выражение стадии конкретных спектрально различных репортеров флуорофорами. Мы подробно метод пластина основе для точного определения стадии, на которой репликация вируса поражается в ответ на небольшой торможения молекулы.

Коровьей оспы Reporter Вирусы для Количественная Вирусный функции на всех этапах экспрессии генов

Здесь мы представляем протоколы для идентификации 1) вирус кодировке иммунокорректоров, которые способствуют арбовирусных репликации и 2) эукариотических хост факторы, которые ограничивают арбовирусных репликации. Эти методы на основе флуоресценции и люминесценции позволяют исследователям быстро получить количественные отсчетов арбовирусных репликации в упрощенческой анализов с низкого соотношения сигнал шум.

Арбовирусных инфекций как скрининг инструменты для выявления вирусной иммуномодуляторов и принимающих противовирусное факторов

ICP0 подвергается ядерной и цитоплазматических транслокации во время инфекции HSV-1. Молекулярный механизм этого события не известна. Здесь мы описываем использование Конфокальный микроскоп как инструмент для количественной оценки ICP0 движения в инфекции HSV-1, которая закладывает основу для количественного анализа ICP0 транслокации в механистической будущих исследований.

Временной анализ ядерных и цитоплазматических транслокации герпеса вирус 1 белок, Immunofluorescent конфокальная микроскопия

Узнайте метод анализа экспрессии генов вируса вакцинии в клетках HeLa с использованием обратной транскрипции и амплификации РНК. Этот протокол позволяет исследовать изменения экспрессии генов хозяина и вируса.

Vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 2

Больше видео