Измерение экзоцитоза в Нейроны Использование FM-маркировки
30 ноября 2006 г.
Возможность измерения кинетики пузырьков релиз может помочь дать представление о некоторых основах нейротрансмиссии. Здесь мы использовали в режиме реального времени изображения пузырьков помечены красным флуоресцентным красителем FM 4-64 для измерения скорости пресинаптическое высвобождение пузырьков в гиппокампе нейронов культур.
Меня зовут Джимми Линн. Я аспирант программы по молекулярной и клеточной биологии в Гарвардском университете. В настоящее время я работаю в лаборатории Мёрфи, где мы занимаемся изучением нейронов гиппокампа.
Сейчас я покажу вам, как проводить эксперименты с использованием FM-красителей. Для начала мы закрепим покровное стекло с нейронами в этой специально изготовленной камере. Мы используем инвертированный микроскоп с CCD-камерой; убедитесь, что нижняя часть полностью просушена.
Теперь подключим электроды. Теперь система перфузии готова. Я помещу её в один из концов камеры.
Мы используем глину для фиксации. Руководители HBS в каждом эксперименте последовательно добавят все необходимые компоненты. Слияние настроено.
Я предлагаю использовать глину для фиксации этого образца; полагаю, примерно так, в месте расположения тел клеток, поскольку мембраны тел клеток поглотят много красителя и он будет направлен прямо в синапсы. Возможно, в прилегающей области, например здесь, где я сосредоточился непосредственно на этой зоне, и мы продолжаем. Таким образом, начальное фотообесцвечивание произошло в течение первых 10 изображений.
Меня зовут Джамиль Ньютон. Я аспирант программы по молекулярной биологии здесь, в Гарварде. В настоящее время я работаю в нейробиологической лаборатории под руководством моего научного руководителя Винки Мёрфи.
Сегодня я хочу поговорить с вами о проведении экспериментов с использованием FM-красителей. Какова цель вашего эксперимента? Преимущество FM заключается в том, что это флуоресцентный краситель, который позволяет нам отслеживать кинетику экзоцитоза.
Таким образом, сначала мы обеспечиваем поглощение красителя синапсом, подавая нагрузочный стимул. Затем, после периода промывки, мы подаем стимул для вымывания, при котором краситель высвобождается из везикул. Вы работаете с каким-то определенным типом нейронов?
Таким образом, в нашей лаборатории мы применяем этот метод для нейронов гиппокампа, используя его на культивируемых нейронах, а не в лизатах. Какие возможные проблемы могут возникнуть при проведении этого эксперимента? Одним из распространенных проблемных аспектов является использование электрической стимуляции.
Иногда в прошлом по разным причинам возникали проблемы с работой электрической стимуляции. Я знаю, что другие лаборатории также используют раствор с высоким содержанием калия. Таким образом, раствор с высоким содержанием калия может стать подходящей альтернативой использованию электрического стимула в случае возникновения подобных проблем.
Также обычно, по какой-либо причине во время этапа промывки, может показаться, что неспецифическое окрашивание удаляется недостаточно. Я часто обнаруживал, что простое увеличение скорости потока — например, с 0,5 ml до 1,5 ml в минуту — и увеличение времени промывки с 5 до 10 минут значительно улучшают результаты. Каковы возможные области применения этого эксперимента?
Что именно вы хотите изучить? Таким образом, этот метод можно использовать для сравнения контрольных клеток с клетками, подвергнутыми определенным манипуляциям. Например, используя разные линии мышей, вы можете определить, различается ли кинетика высвобождения, или проверить, влияет ли добавление определенного препарата на цитоз.
Спасибо.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Данное исследование посвящено измерению кинетики высвобождения везикул для более глубокого понимания механизмов нейротрансмиссии. С помощью визуализации в реальном времени с использованием красителя FM 4-64 в работе изучается скорость высвобождения пресинаптических везикул в культурах нейронов гиппокампа.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Нейротрансмиссия
Теоретические сведения
- Нейротрансмиссия является критически важным процессом в межнейронном взаимодействии.
- Высвобождение везикул необходимо для передачи сигналов между нейронами.
- Методы визуализации в реальном времени позволяют получить данные о динамике везикул.
- FM 4-64 — это флуоресцентный краситель, который обычно используется для маркировки везикул.
Цель исследования
- Измерить скорость высвобождения пресинаптических везикул.
- Получить представление о механизмах нейротрансмиссии.
- Использовать визуализацию в реальном времени для наблюдения за динамикой везикул.
Используемые методы
- Визуализация везикул, меченных красителем FM 4-64, в режиме реального времени.
- Использование культур нейронов гиппокампа для проведения экспериментов.
- Специально изготовленная камера для крепления покровных стекол с нейронами.
- Настройка инвертированного микроскопа для получения изображений.
Основные результаты
- Успешное измерение скорости высвобождения пресинаптических везикул.
- Представление о кинетике динамики высвобождения везикул.
- Демонстрация эффективности FM 4-64 в исследованиях с применением визуализации.
- Вклад в понимание процессов нейротрансмиссии.
Выводы
- Визуализация в реальном времени является ценным инструментом для изучения высвобождения везикул.
- Данное исследование расширяет знания о механизмах нейротрансмиссии.
- FM 4-64 обеспечивает надежный метод визуализации везикул.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Количественное измерение экзоцитоза синаптических везикул с помощью маркировки FM-красителями дает ценную информацию о механизмах высвобождения нейромедиаторов, что способствует валидации мишеней на ранних этапах разработки лекарственных препаратов в области нейробиологии. Данный подход позволяет проводить прямое сравнение кинетики высвобождения везикул в генетически или фармакологически модифицированных нейронах и в контрольных группах, что обеспечивает механистическое снижение рисков и повышает прогностическую уверенность на этапе принятия ключевых решений при поиске новых соединений.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет исследовать механизмы синаптического выброса в культурах нейронов, имеющих значение для изучения заболеваний.
- Обеспечивает функциональную валидацию генетических или фармакологических воздействий, влияющих на экзоцитоз.
- Способствует снижению механистических рисков путем количественной оценки изменений пресинаптической функции.
- Обеспечивает прогностическую уверенность при продвижении программ разработки нейроактивных соединений.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает воспроизводимые количественные показатели высвобождения везикул в первичных культурах нейронов.
- Поддерживает стандартизацию анализа для сравнения трансфицированных синапсов с контрольными.
- Позволяет проводить масштабируемую оценку влияния соединений или генетических вмешательств на скорость экзоцитоза.
- Создает валидированные системы для последующего скрининга модуляторов синаптической передачи.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет анализы синаптической функции in vitro с релевантными для заболевания нейрональными моделями.
- Обеспечивает преемственность от механизмов открытия до доклинической валидации синаптических мишеней.
- Поддерживает продвижение кандидатов в нейротерапевтические препараты с поправкой на риски на основе функциональных показателей.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Измерение экзоцитоза с использованием красителей FM интегрируется в континуум от фундаментальных открытий до доклинических исследований, связывая ранние механистические исследования и трансляционную валидацию в нейронных системах.
- Фундаментальная биология: Количественная оценка высвобождения синаптических везикул для проверки гипотез о механизмах нейротрансмиссии.
- Скрининг: Получение воспроизводимых количественных данных для скрининга соединений или генетического скрининга в культурах нейронов.
- Аналитика: Проведение кинетических измерений на основе флуоресценции для надежного статистического сравнения экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: Связь синаптической функции in vitro с фенотипами, релевантными заболеванию, в доклинических моделях.
- Корпоративное использование: Предоставление многократно используемой платформы для оценки различных нейроактивных воздействий в рамках разных программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неоднозначность при валидации синаптических мишеней.
- Операционная ценность: Стандартизирует и масштабирует количественные анализы экзоцитоза для обеспечения сопоставимости результатов между различными исследованиями.
- Стратегическая ценность: Служит основой для принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала в портфелях нейробиологических исследований.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию нейроактивных соединений и генетических мишеней с учетом оценки рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами нейронов и флуоресцентной визуализацией живых клеток.
- Необходим доступ к инвертированному флуоресцентному микроскопу и специализированным перфузионным камерам.
- Для обеспечения воспроизводимости анализа требуются строгие протоколы промывки и стимуляции.
- Необходимо адаптировать скорость потока и продолжительность промывки для оптимизации удаления красителя и специфичности сигнала.
- Практические ограничения включают возможную вариабельность электрической стимуляции и эффективности поглощения красителя.
