Vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 3
13 апреля 2009 г.
Протокол Vaccinia заражения клеток HeLa и анализ хозяина и вирусных экспрессии генов. Часть 3 описывает процесс флуоресцентно маркировки усиливается РНК из хозяина и вирусных образцов аминокислот аллилового связи красителей. Часть 3 из 3.
Привет, я Джуди Y из лаборатории Кейт Рубинс в Институте биомедицинских исследований Уайтхеда. Здесь мы демонстрируем, как маркировать образцы антисмысловой РНК, собранные как из инфицированных вирусом коровьей оспы клеток Hela, так и из вируса с помощью амино-LEO-связывания красителей. Затем мы покажем, как очистить меченую РНК А и подготовить ее к гибридизации для микрочипового анализа экспрессии генов.
В предыдущих видео Джо рассказывается о том, как выполнять этапы полного выделения РНК вирусных инфекций и амплификации и амплификации РНК. Итак, приступим. Чтобы начать мечение РНК, сначала добавьте один микрограмм образцов А-РНК в 1,5-миллилитровые микроцентрифужные пробирки.
Высушите образцы в вакууме при слабом нагреве или без него, пока они полностью не высохнут. Закройте крышкой каждую трубку, как только она высохнет. Важно не пересушивать образцы после того, как они высохли.
Добавьте девять микролитров буфера для связи в каждую пробирку и ресуспендируйте РНК А, осторожно поворачивая центрифугу в течение одной минуты, чтобы собрать образец на дне пробирки, а затем дайте образцу посидеть на льду. Далее добавьте 22 микролитра высококачественного ДМСО в каждую пробирку с тремя или S пятью красителями, одного тюбика красителя хватит на два образца. Три матрицы S SI предназначены для маркировки эталонных образцов, а пять красителей SCI предназначены для маркировки тестовых образцов.
Вихревые красители тщательно перемешать. Не забывайте хранить красители в темноте до тех пор, пока они не будут готовы к использованию. Не готовьте краситель раньше, чем за час до использования, и следите за тем, чтобы вода ни в коем случае не попала в смесь красителя DMSO.
Теперь по 11 микролитров приготовленной смеси красителя D-M-S-O-S к каждому образцу хорошо перемешиваем путем вортексирования. Аккуратно инкубируйте от 30 до 45 минут при комнатной температуре. Накройте образцы фольгой или храните их в ящике, чтобы свести к минимуму воздействие света.
После инкубации по 4,5 мкл гидроксиламин в каждый образец для гашения реакции хорошо перемешан путем вортексирования. Аккуратно выдержать еще 15 минут до температуры веника. Накройте образцы фольгой или храните их в ящике, чтобы свести к минимуму воздействие света.
Чтобы очистить этикетку, они представляют собой РНК-вихрь, связывающие шарики РНК. Кратко, чтобы получить однородную смесь перед использованием, приготовьте смесь для связывания A RNA при комнатной температуре. Хорошо перемешайте связующую смесь, вортексировав аликвоту буфера для элюирования A РНК в пробирку объемом 1,5 миллилитра и инкубируя при температуре от 50 до 60 градусов Цельсия в течение не менее 10 минут.
Добавьте 70 микролитров смеси, связывающей A RNA, в каждый образец и хорошо перемешайте с помощью трубки, добавляя вверх и вниз три-четыре раза после смешивания, перенесите образцы с ПЦР-планшета на 96-луночный круглый нижний планшет. Затем добавьте 50 микролитров стопроцентного изопропанола в каждый образец и хорошо перемешайте, пипетируя вверх и вниз три-четыре раза. Аккуратно встряхните пластину на орбитальном шейкере не менее двух минут.
Тщательно перемешайте образцы. Переместите пластину на магнитную подставку. Для захвата магнитных шариков.
Оставьте тарелку на подставке до тех пор, пока смесь не станет прозрачной, а связующие бусины не закапываются. Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость с помощью вакуумного аспиратора, не нарушая магнитные шарики. В качестве альтернативы осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки и выбросьте надосадочную жидкость.
На этом этапе надосадочная жидкость должна быть либо ярко-розовой, либо ярко-синей из-за неинкорпорированных молекул красителя. После того, как надосадочная жидкость будет удалена, снимите пластину с магнитной подставки. Теперь добавьте в каждую лунку сотню микролитров, раствор для промывки РНК и встряхивайте пластину в течение одной минуты на орбитальном шейкере с умеренной скоростью.
Бусины могут не полностью разойтись на этом этапе, верните пластину на магнитную подставку. Для захвата магнитных шариков. Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость с помощью вакуумного аспиратора, не нарушая магнитные шарики.
В качестве альтернативы осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки и выбросьте надосадочную жидкость. Снимите пластину с магнитной подставки. Повторите промывку второй раз с 100 микролитрами раствора для промывки РНК.
После второй стирки. Высушите бусины, встряхивая пластину в течение одной минуты на орбитальном шейкере на максимальной скорости. Не пересушивайте образцы, вымывайте А-РНК из шариков, добавляя 20 микролитров предварительно подогретого буфера для элюирования А-РНК.
Чтобы каждый образец энергично встряхивали пластину на орбитальном шейкере в течение трех минут. Затем убедитесь, что магнитные шарики полностью диспергированы. Если нет, продолжайте встряхивать.
Как только магнитные шарики полностью диспергируются, переместите пластину на магнитную подставку, чтобы захватить магнитные шарики. Надосадочная жидкость содержит очищенные меченые образцы РНК А и должна быть либо бледно-розовой, либо бледно-голубой. Далее осторожно перенесите упомянутую РНК на новую ПЦР-планшет или ПЦР-пробирки.
На этом этапе можно проверить концентрацию РНК и количество красителя в образцах, измерив 1,5 микролитра на спектрофотометре NanoDrop. С помощью модуля микрочипа немедленно гибридизируйте меченую РНК А с платформой микрочипа по вашему выбору. Или, в качестве альтернативы, вы можете хранить меченую РНК А при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока не будете готовы к гибридизации.
Это репрезентативные показания спектрофотометра и график внешнего диаметра, построенные с помощью спектрофотометра NanoDrop для измерения концентрации образца и включения красителя. Вы можете увидеть пики OD на 260 нанометрах для расчета концентрации образцов, а также два пика около 532 и 635 нанометров, представляющие пять красителей S3 и SCI соответственно. Мы только что показали вам, как флуоресцентно мечить амплифицированные образцы РНК, включенные в иммуноаллель, для микролучевой гибридизации.
При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости ресуспендирования красителя в ДМСО менее чем за час до соединения и следить за тем, чтобы вода не попала в смесь красителя, так как она будет реагировать с активной группой красителя. Также важно помнить, что при необходимости нельзя пересушивать РНК. Образцы могут быть высушены до одного-двух микролитров, а не полностью высушены, а затем хорошо ресуспендированы в буфере для связывания во время реакции связывания.
Держите реакции в темноте с редкими щелчками и при желании поворачивайте вниз. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.
Обязательно посмотрите другие видео из этой серии, в которых мы показываем, как провести временное заражение вирусом коровьей оспы и экстракцию РНК образцов, а также процедуру линейной амплификации образцов РНК.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Этот протокол описывает процесс маркировки образцов антисенсной РНК из клеток HeLa, зараженных вирусом кори оспы, с использованием аминоаллильного связывания красителей. Затем маркированная РНК готовится для микрочипового анализа с целью оценки экспрессии генов.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Вирусология
- Анализ экспрессии генов
- Клеточная биология
Бэкграунд
- Вирус кори оспы является модельным организмом для изучения вирусных инфекций.
- Клетки HeLa широко используются в исследованиях по вирусологии.
- Маркировка РНК необходима для анализа экспрессии генов.
- Микрочиповый анализ позволяет оценивать экспрессию многих генов одновременно.
Цель исследования
- Демонстрация маркировки РНК из зараженных клеток.
- Подготовка образцов для последующего микрочипового анализа.
- Улучшение понимания динамики экспрессии генов хозяина и вируса.
Используемые методы
- Заражение клеток HeLa вирусом кори оспы.
- Изоляция общей РНК из зараженных клеток.
- Аминоаллильное связывание красителей для маркировки РНК.
- Подготовка маркированной РНК для гибридизации на микрочипах.
Основные результаты
- Успешная маркировка образцов антисенсной РНК.
- Подготовка образцов для микрочипового анализа.
- Демонстрация процесса очистки РНК.
- Сведения об профилях экспрессии генов хозяина и вирусной РНК.
Выводы
- Протокол эффективно маркирует РНК для анализа экспрессии генов.
- Этот метод можно применять для исследования других вирусных инфекций.
- Понимание экспрессии генов может информировать терапевтические стратегии.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This protocol enables precise temporal analysis of virus-host gene expression dynamics, supporting mechanistic de-risking in antiviral target validation. By quantifying early, intermediate, and late viral gene expression alongside host responses, it provides predictive confidence for pathway interrogation and therapeutic hypothesis testing. The approach strengthens translational continuity from discovery through preclinical evaluation by generating reproducible, quantitative expression profiles.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of viral gene function and host pathway modulation across infection stages.
- Operational Value: Provides standardized RNA labeling and cleanup for reproducible microarray-based expression profiling.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating viral gene expression kinetics with phenotypic outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, time-resolved expression data essential for assay standardization and biomarker identification.
- Operational Value: Produces labeled RNA compatible with high-throughput microarray platforms for scalable screening.
- Reproducibility Value: Includes rigorous dye-coupling and bead-based cleanup to minimize technical variability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking viral gene expression to host immune and stress responses.
- Operational Value: Enables cross-functional comparison of antiviral compound effects on viral and host transcription.
- Translational Value: Supports biomarker alignment through concurrent host-virus expression profiling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation to preclinical efficacy assessment, enabling iterative refinement of antiviral candidates based on expression dynamics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of viral gene function and host pathway interference through temporal expression mapping.
- Screening: Delivers assay-ready labeled RNA for compound effect analysis on viral gene classes.
- Analytics: yields microarray-compatible readouts for comparing expression thresholds across conditions and time points.
- Translational Research: Connects viral expression patterns to host response biomarkers for risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for profiling any cytoplasmic DNA virus in relevant cell models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in viral life cycle and host interaction studies.
- Operational Value: Ensures standardization across teams via defined dye-coupling, quenching, and bead-based purification steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking target engagement to temporal expression changes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antivirals based on stage-specific gene expression suppression.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling, fluorescent dye chemistry, and microarray workflows.
- Depends on access to NanoDrop spectrophotometry, magnetic separation equipment, and orbital shakers.
- Necessitates cross-team standardization of light protection and timing controls during dye coupling.
- Involves adaptation considerations for different cell lines or virus strains beyond HeLa and vaccinia.
- Includes practical limitations such as RNA degradation risk if over-dried or exposed to ambient light during labeling.
