Долгосрочные изображений клетках млекопитающих использованием широкого поля микроскопии

На самом деле я сделаю так: сначала закреплю его здесь, а затем заменю вас. Теперь я приступлю к аспирации, стараясь действовать максимально осторожно. Хорошо. Просто подождем несколько секунд. Хорошо. Готово.

Таким образом, важными особенностями нашей установки для визуализации образа жизни являются следующие: это инвертированный микроскоп, что означает, что объектив и образцы находятся снизу. Таким образом, объектив направлен вверх, и весь микроскоп, или практически весь микроскоп, включая объективы и образцы, находится при температуре 37 °C. То есть все внутри этого пластикового короба поддерживается при 37 °C.

Непосредственно над предметным столиком у нас находится смесь воздуха и CO2. Концентрация CO2 составляет 5%. Таким образом, образец фактически находится в кювете, которая работает по принципу инкубатора для клеток.

Таким образом, перед нами смеситель воздуха и CO2; смесь увлажняется, нагревается и затем по трубке подается к образцу на предметном столике. Хорошо. Сегодня мы будем проводить флуоресцентную микроскопию в одном канале — флуоресценцию GFP. Вот шланг, по которому подается 5% CO2, он просто вставляется в держатель предметного столика.

Это важно. Затем мы можем закрыть их, убрать, и перейти к первой позиции. Я выберу первое поле, которое является моим контрольным образцом, и буду определять позиции на основе того, что вижу на экране.

Таким образом, я обязательно смотрю в микроскоп при переходе к каждой новой лунке, так как фокальная плоскость для каждой из них различается — дно планшета не является идеально плоским. Поэтому при переходе от лунки к лунке потребуется выполнять точную настройку фокуса. Сейчас я нахожусь на первой лунке; первым делом я сфокусируюсь, для чего я просто включу transmitted light микроскопа.

Затем я убеждаюсь, что весь свет поступает в окуляры. Я смотрю в микроскоп, чтобы убедиться в чистоте поля зрения. После этого я выключаю этот свет, включаю флуоресцентный осветитель и проверяю, выглядят ли изучаемые клетки здоровыми и не подверглись ли они апоптозу.

И, и я выключаю это. Далее я нажимаю «send» (отправить), теперь я приступаю к выбору позиций, а значит, мне нужно направить световой путь на камеру. Вот она, камера.

Я настраиваю микроскоп так, чтобы весь световой поток направлялся на камеру, поэтому в окулярах ничего не видно. Далее в программном обеспечении для управления микроскопом я выбираю подходящий набор фильтров, который для наших целей — psy, и устанавливаю время экспозиции.

Я очень хорошо знаю эти клетки и знаю, что для них требуется время экспозиции 0.2 second. Поэтому я задаю именно такое значение в программном обеспечении. Затем я нажму кнопку фокусировки.

Вот оно, и оно, по сути, просто живо. Загорится свет, и вы сможете... о, я не знаю, видно ли клетки, но это хорошее поле зрения, потому что все клетки, даже с точки зрения их флуоресценции, в норме. Здесь нет апоптотических клеток. Апоптотические клетки обычно очень яркие, и в поле зрения нет грязи или посторонних частиц.

И вы видите, что на самом деле, это клетка в метафазе, и вот тоже клетка в метафазе, а эта клетка, вероятно, только что завершила митоз. Я могу определить это по тому, что эти два набора хроматина очень четко ориентированы друг относительно друга, как если бы они только что вышли из анафазы.

Таким образом, это подходящее поле. Теперь, когда я убедился, что время экспозиции и набор фильтров выбраны верно — и этот момент будет зависеть от конкретного программного обеспечения, — я зафиксирую позиции, и теперь программа запомнила координаты X, Y, Z этого поля. Затем, когда я буду выбирать следующее поле, — то есть при выборе новых полей в той же лунке, — я буду открывать затвор, смотреть на изображение на экране и выбирать поля на основе этого, а не глядя непосредственно в окуляр.

Итак, я не вижу там ни одного из своих тонизирующих растворов. Но опять же, даже при хорошем центрировании эти клетки пройдут через мой PS; продолжим, вот подходящий пример. Вот хороший пример того, чего я бы избегал — видите, насколько это ярко?

Это очень яркий объект. Вероятно, это остатки апоптотической клетки. Я бы рекомендовал избегать таких участков, поскольку из-за высокой яркости программа при автоматической фокусировке настроится именно на этот объект, и он окажется не в той же плоскости, что и все остальные клетки.

Таким образом, я не получу никакой информации из этого поля. Выглядит неплохо. Вот здесь видна прометафаза, а здесь — метафаза.

Итак, я сделаю снимки в трех точках каждой лунки. Таким образом, это три позиции, и теперь я перехожу к следующей лунке. Скорее всего, я буду делать снимки каждые 10 минут — это компромиссный вариант.

Визуализация образа жизни — это всегда компромисс, верно? Необходимо проводить съемку, но при этом поддерживать жизнеспособность клеток, особенно если вас интересует митоз. Таким образом, воздействие флуоресцентного излучения должно быть сведено к минимуму.

Однако для получения данных необходимо делать снимки, поэтому приходится идти на компромисс и выбирать, какую именно информацию вы хотите зафиксировать. Для наших целей достаточно того, что митоз обычно занимает около одного часа.

Таким образом, интервалы в 10 минут вполне приемлемы. Мы видим профазу, метафазу, анафазу, и мы можем определить, когда воздействие препаратов, лекарственных средств или siRNAs влияет на эти конкретные стадии клеточного цикла. Для наших целей этого достаточно, но нам всегда хочется большего.

Мы всегда стремимся к большему количеству позиций, более точному временному разрешению или интервалам, и тому подобному. Поэтому приходится искать компромисс. Итак, теперь я нажму кнопку «старт».

Таким образом, наше программное обеспечение выполняет цикл автофокусировки на первом этапе. После того как я нажму кнопку «Пуск», начнется автоматическая фокусировка, и вы увидите, как затвор открывается и закрывается в процессе настройки фокуса. Итак, я нажимаю «Пуск».

Таким образом, затвор открывается и закрывается. Мотор оси Z задействуется и фактически пытается найти плоскость с наибольшим контрастом, которая будет наиболее четкой. На экране можно увидеть процесс поиска оптимальной плоскости фокусировки, что может вызвать опасения.

Таким образом, система приводит в действие мотор по оси Z для поиска оптимальной, наиболее четкой плоскости фокусировки, обеспечивающей наилучшее изображение. Затем она делает снимок и запоминает данное положение по оси Z, которое в дальнейшем будет использоваться для следующих 12 проходов.

Затем мы снова выполним проход автофокусировки. Какого рода эксперименты они проводят? Итак, наша лаборатория в основном заинтересована в понимании того, что регулирует прогрессию митоза, или, по крайней мере, я больше всего заинтересован в изучении этого процесса.

Благодаря визуализации живых клеток, и особенно нашему микроскопу для многопозиционной долгосрочной съемки, вы можете снимать клетки в течение двух или трех дней, фиксируя вхождение в митоз и его завершение, а также регистрировать несколько циклов митоза для детального анализа. Кроме того, вы можете воздействовать на изучаемые клетки с помощью препаратов, РНК или любых других видов пертурбаций. Это позволяет понять, какую роль данные препараты или гены играют в регуляции протекания митоза.

Поскольку это работа не с фиксированными, а с живыми клетками, вы можете понять, когда именно необходимо воздействие, чтобы повлиять на митоз, или на какой стадии митоза оно сказывается. В этом отношении данный метод очень эффективен. Каковы основные технические элементы этих экспериментов?

Какие могут возникнуть проблемы? Что ж, самая большая проблема, помимо настройки установки — а настройка установки является непростой задачей, — заключается в том, что даже при наличии оборудования необходимо убедиться, что оно работает эффективно для вашей конкретной задачи.

Финансовая составляющая, знаете ли, весьма значительна. Сначала необходимо настроить оборудование, а затем, после сбора данных, возникает серьезная проблема с их анализом. Представьте, что вы записываете 40 видеороликов, и в каждом из 40 снятых полей находится по 30 клеток; в таком случае вам придется просмотреть каждый из этих роликов и проанализировать каждую клетку в каждом видео.

Таким образом, анализ данных занимает очень много времени. Получается, что на анализ данных, сбор которых занял два дня, уходит целая неделя. Это представляет собой серьезное препятствие для сбора больших объемов данных.

Таким образом, несмотря на высокую пропускную способность сбора данных, анализ не является высокопроизводительным. Что бы вы предприняли, чтобы сделать этот эксперимент действительно высокопроизводительным? В настоящее время наша лаборатория разрабатывает программу для автоматического анализа данных.

И это довольно достойная программа. Она не идеальна. Человеческий глаз всегда видит лучше, но программа стремится к этому.

Каковы, таким образом, интересные области применения данного эксперимента? Возможно, вы могли бы упомянуть другие области, помимо клеточного деления?

Вы имеете в виду для, о, для визуализации живых клеток? Да. Ну, можно проводить анализы подвижности клеток. В зависимости от используемого метода микроскопии, вы можете, знаете, наблюдать за тем, как ведут себя клетки; если возникнет необходимость, можно даже изучить развитие опухоли.

Однако при наличии подходящего оборудования для визуализации вы практически не ограничены в возможностях. Наш микроскоп оснащен широкопольным объективом с увеличением 20×. Это установка с довольно низким разрешением, но этого достаточно для наших целей.

Таким образом, они существуют, но определенно нет никаких ограничений. Любой динамический эксперимент, что характерно для биологии, принес бы реальную пользу от визуализации живых объектов. Например, кальциевый имиджинг, хотя его и нельзя провести на нашем аппарате, относится к работе с живыми клетками.

Для этого вам определенно понадобится визуализация живых клеток. Как я уже говорил, анализ проб пациентов, анализ подвижности и подобные исследования получили бы значительную пользу от визуализации живых клеток. Не могли бы вы вкратце рассказать о вашем предыдущем опыте?

Как долго вы осваивали эти методы? Чем вы занимались до этого? Ого. Так значит, в during моей аспирантуры я этим не занимался.

Я много работал с конфокальной микроскопией, но не с прижизненной визуализацией. Поэтому во время постдокторантуры я помогал доктору Кингу приобрести и наладить работу этого аппарата, который мы использовали для подготовки этих фрагментов. Таким образом, за время постдокторантуры я приобрел большой опыт как в широкопольной микроскопии с использованием таймлапс-визуализации на нашем микроскопе, так и в таймлапс-визуализации с помощью конфокальной микроскопии.

Я бы сказал, что этот метод очень эффективен. Он позволяет получить большой объем информации, но добиться его идеальной работы непросто. Поэтому он требует предельной внимательности и строгого соблюдения всех деталей на каждом этапе процесса.

И даже после этого проблемы могут остаться. Таким образом, это сложный метод применения, но если он необходим для изучения вашей научной проблемы, то в этом отношении он неоценим, хотя и труден в реализации. Поэтому найдите специалиста, который знает, что делает, и обратитесь к нему.

Это мой совет. Очень полезно.