Долгосрочные изображений клетках млекопитающих использованием широкого поля микроскопии

На самом деле, что я собираюсь сделать, сначала вмонтируйте его сюда, а затем поменяйте местами Вас. Так что теперь я собираюсь сделать аспирацию и стараться быть как можно более нежной. Хорошо. Несколько секунд просто удержание. Ладно. Хорошо.

Итак, важные особенности нашей сетки визуализации образа жизни заключаются в том, что это инвертированный прицел, что означает, что объектив, образцы здесь, в объективе, находятся внизу. Итак, объектив направлен вверх, и весь прицел, или практически весь, практически весь прицел, включая объективы и образец, находится под углом 37 градусов. Так что все в этой пластиковой коробке находится при 37 градусах.

И прямо на сцене у нас есть смесь воздуха и CO2. Это 5% CO2. Идея заключается в том, что образец на самом деле находится в клетке, это как клеточный инкубатор.

Итак, у нас есть смеситель для воздуха и CO2, и он увлажняется, нагревается, а затем подается по трубопроводу на образец на сцене. Хорошо. И сегодня мы просто будем проводить флуоресценцию GFP флуоресценции в одном канале. Это шланг, в который поступает CO2 и 5% CO2, и он просто помещается в держатель предметного стола.

Это важно. Затем мы можем закрыть их, снять эти, а затем перейти к нашей первой позиции. И что я собираюсь сделать, так это перейти к первому полю, которое является моим контрольным образцом, и выбрать позиции на основе того, что я вижу на экране.

Так что я просто слежу за тем, чтобы смотреть в микроскоп в каждой новой лунке, потому что фокальная плоскость для каждой из лунок разная, чашка не идеально плоская на дне. Поэтому вам нужно будет внести тонкие коррективы при переходе от скважины к скважине. Итак, сейчас я нахожусь на первом, ну, что я сфокусируюсь, так что я просто ударил, я только что сказал, я просто включил свет, проходящий свет для микроскопа.

И я должен убедиться, что весь свет поступает к окулярам. И поэтому я просто смотрю внутрь, чтобы убедиться, что у меня есть хорошее чистое поле. И затем я выключу этот свет, включим флуоресцентный свет, убедюсь, что клетки, на которые я смотрю, выглядят здоровыми и они не являются апоптотическими.

И я выключаю это. И что я делаю дальше, так это отправляю, так что теперь я собираюсь начать выбирать позиции, что означает, что мне нужно направить путь света в камеру. Вот эта камера прямо здесь.

Поэтому я говорю микроскопу, чтобы они отправили всю камеру, они ничего не видят в окулярах. Что я делаю, так это в программном обеспечении, управляющем микроскопом, я выбираю правильный набор фильтров, который для наших целей является psy. А затем установите время экспозиции.

И я очень хорошо знаю эти клетки, и я знаю, что они выдерживают воздействие 0,2 секунды. Поэтому я говорю, что это то, что я говорю программному обеспечению. И что я сделаю, так это нажму на фокус.

Это так, и это в основном просто живое. Включится свет, и вы сможете, о, я не знаю, сможете ли вы увидеть клетки, но причина, по которой это хорошее поле, заключается в том, что все клетки, даже с точки зрения их флуоресценции, не имеют апоптотических клеток. Апоптотические клетки, как правило, очень яркие, и в поле нет грязи или мусора.

И вы можете видеть, что на самом деле это метафазная клетка, а это метафазная клетка, это клетка, которая, вероятно, только что вышла из митоза. И я могу сказать это, потому что похоже, что эти два набора хроматина очень хорошо ориентированы друг на друга. Как будто они только что вышли из лица.

Так что это хорошее поле. Итак, теперь, когда я знаю, что время экспозиции и набор фильтров правильные, и это будет зависеть от программного обеспечения, я пойду и займу позиции, и теперь программа запомнила положение X, Y, Z этого поля. И затем, когда я выбираю другое поле, это, и я, так что, когда я выбираю, когда я выбираю новые поля, но в том же самом, ну, я использую это, я перемещаю i'll, я поворачиваю затвор, я открываю затвор и смотрю, чтобы увидеть, что я вижу на экране, и я выбираю поля, основываясь на этом, а не смотрю в поле.

Так что я не вижу там никаких своих тоников. Но опять же, даже красиво отцентрированные, эти ячейки будут проходить через мой PS Продолжаю, вот хороший пример. Вот хороший пример того, чего бы я избежал, посмотрите, насколько это ярко?

Это очень ярко. Вероятно, это остатки апоптотической ячейки. И причина, по которой я бы этого избегал, заключается в том, что поскольку он такой яркий, когда программное обеспечение автоматически фокусируется, оно будет автоматически фокусироваться только на этом, и оно не будет находиться в той же плоскости, что и все эти другие ячейки.

И поэтому я не буду получать никакой информации из этого поля. Выглядит неплохо. Вот здесь есть метафаза за , это метафаза.

Итак, и я возьму три позиции на лунку. Итак, это было три позиции, и теперь я перейду к следующей Ну, чтобы вы могли, так что я, вероятно, буду делать снимки каждые 10 минут. Так что это компромисс.

Визуализация образа жизни — это всегда компромисс, не так ли? Вы должны визуализировать, вы должны поддерживать клетки здоровыми, особенно если вас интересует митоз. Поэтому вы должны свести к минимуму их воздействие флуоресцентной линии.

И, но вы хотите получить информацию. Так что вы должны делать снимки, вы должны это делать, поэтому вы должны идти на компромисс, вы должны делать выбор о том, что вы хотите запечатлеть, какую информацию вы хотите запечатлеть. Для наших целей митоз, как правило, занимает около часа.

Так что, если мы берем 10-минутные интервалы, это довольно хорошо. Мы видим профазу, мы видим метафазу, мы видим анафазу, и мы можем, мы можем видеть, когда есть методы лечения, лекарства или миРНК, которые влияют на эти конкретные стадии клеточного цикла. Так что для наших целей этого достаточно, но мы всегда хотим большего.

Мы всегда хотим больше позиций или более точное время и интервал или что-то в этом роде. Так что это компромисс. Итак, а затем я нажму «Старт».

И так наше программное обеспечение, оно делает проход автофокусировки с первого прохода. Итак, как только я нажму «Пуск», он должен запустить автофокусировку, и вы увидите, как затвор открывается, открывается и закрывается между автоматической фокусировкой. Итак, я нажму «Старт».

Итак, это открытие и закрытие затвора. Z-мотор привлекателен и на самом деле пытается найти самолет с наибольшим контрастом, который будет наиболее сфокусирован. На самом деле вы можете видеть, как вы входите и выходите из поиска лучшей плоскости фокусировки, что может вызывать беспокойство.

Так что он делает это, он приводит в движение Z-мотор, чтобы найти лучшее, самое лучшее в фокусе в плоскости фокусировки, ну, самое большое в изображении. И тогда он получает изображение там, а затем узнает, что Z-положение. А затем мы будем использовать эту Z-позицию для следующих 12 проходов.

А затем мы снова сделаем проход автоматической фокусировки. Какие эксперименты они проводят? Итак, наша лаборатория в основном заинтересована в понимании того, что регулирует прогрессирование митиков, или, по крайней мере, мне больше всего интересно понять это.

Таким образом, с помощью визуализации живых клеток и, в частности, нашего многопозиционного долговременного эндоскопа, вы можете снимать, вы можете снимать клетки в течение двух или трех дней, вступая в митоз, и вы можете визуализировать несколько раундов митоза, чтобы вы могли понять. И тогда вы можете вводить лекарства или РНК или любые другие возмущения на клетки, которые вы хотели бы изучить. Таким образом, вы можете понять, как эти препараты или гены играют важную роль в регулировании митотической прогрессии.

Поскольку это не работа фиксированной клетки, а работа живой клетки, вы можете понять, что, когда вам нужно иметь возмущение, чтобы повлиять на митоз, или на какую стадию митоза это влияет. Так что это действительно мощно в этом отношении. Какие, каковы основные технические элементы этих экспериментов?

Какие возможны проблемы? Ну, самая большая проблема, помимо настройки буровой установки, не является тривиальной задачей. У многих людей есть эта установка, но просто убедитесь, что она хорошо подходит для вашего приложения.

Финансовая составляющая не является, знаете ли, не маленькой. Итак, есть настройка устройства, а затем, как только вы собираете данные, возникает реальная проблема анализа данных. Если вы собираете 40 фильмов с 30 ячейками в каждом, то есть у вас есть 40 в 40 полях, которые вы только что сняли, и в каждом из этих полей по 30 клеток, тогда вам нужно сесть с каждым из этих фильмов и посмотреть на каждую из этих клеток в этом фильме.

Так что анализ данных занимает очень много времени. Таким образом, на анализ данных уходит неделя, на сбор которых у вас ушло два дня. Так что это очень большое препятствие с точки зрения сбора большого количества данных.

Так что это не так, хотя это сбор данных с высокой пропускной способностью, это не анализ с высокой пропускной способностью. Итак, что бы вы сделали, чтобы сделать этот эксперимент действительно высокопроизводительным? Поэтому наша лаборатория находится в процессе разработки программы, которая автоматически выполняет анализ данных.

И это довольно приличная программа. Он не идеален. Человеческий глаз всегда лучше, но он к этому стремится.

Итак, в чем же интересное применение этого эксперимента? Может быть, вы можете упомянуть и другие области? Кроме деления клеток?

Вы имеете в виду, о, для визуализации живых клеток? Да.Ну, вы можете провести анализ подвижности клеток. Вы можете, в зависимости от микроскопии, вы можете, знаете, посмотреть, как клетки развиваются, вы можете посмотреть на развитие опухоли, если вы действительно захотите.

Но если у вас есть правильная настройка изображения, вы практически не ограничены в чем-либо. Наша область применения — это просто широкое поле, и мы используем объектив 20 на 20. Так что это довольно низкое разрешение, но этого достаточно для того, что нам нужно увидеть.

Так что есть, но их точно нет, вы не будете ограничены. Все, что имеет какой-либо динамический вид эксперимента, то есть биология, действительно выиграет от визуализации образа жизни. Итак, визуализация кальция, хотя вы не можете сделать это на нашем аппарате, это живая клетка.

Для этого вам определенно нужна визуализация живых клеток. Как я уже сказал, анализы на пациента, анализы моторики и тому подобное действительно выиграет от визуализации живых клеток. Хотели бы Вы рассказать несколько слов о своем предыдущем опыте?

Как долго вы работаете над этими техниками? Над чем вы работали раньше? Wow.So в аспирантуре я не работал.

Я много делала конфокальную микроскопию, но не делала визуализацию образа жизни. И во время моей постдокторантуры я помог доктору Кингу получить этот аппарат, который мы только что использовали для настройки этого фрагмента, чтобы он заработал. И во время работы над докторской диссертацией у меня был большой опыт работы как с широкоугольной визуализацией с TimeLapse на нашем эндоскопе, так и с TimeLapse с конфокальной микроскопией.

И я бы сказал, что это действительно мощно. Вы получаете много информации, но не так просто наладить идеальную работу. Так что это действительно требует много внимания и внимания к деталям на каждом маленьком этапе процесса.

И, а потом у вас все равно остаются проблемы. Так что это сложное приложение, но вы действительно можете получить, если это то, что вам нужно, изучить вашу проблему, вашу научную проблему, тогда это, это бесценно в этом отношении, но это сложно. Так что найдите кого-то, кто знает, что делает, и используйте его.

Это мой совет. Так хорошо.