Живая съемка данио рерио Эмбриональные мозга с помощью конфокальной микроскопии

Эта процедура начинается с инъекции эмбриона зебры с одной клеткой, помещаемого в инъекционную форму так, чтобы клетка была ориентирована в сторону от инъекционного аппарата. Затем эмбрионам вводят МРНК, при этом игла проходит через желток и попадает в клетку. На следующий день.

Пластиковый монтажный затвор заполнен аросексуалами. Затем анестезированный эмбрион помещается в отверстие в арос, что проводится с помощью конфокальной микроскопии. Здравствуйте, я Грэбэм из лаборатории доктора Хейзел Сив в Институте биомедицинских исследований Уайтхеда и биологического отделения MIT.

Сегодня мы покажем вам процедуру инъекции эмбрионов данио-рерио-рыбы на одной клеточной стадии и последующую живую визуализацию мозга с помощью конфокальной микроскопии. В нашей лаборатории мы используем эту процедуру для изучения морфогенеза мозга позвоночных с разрешением одной клетки. Давайте начнём.

Используемая в этой процедуре мРНК транскрибирается из плазмиды, кодирующей C-A-X-E-G-F-P-R-N-A-A-A мембранно-связанную ГФП. Сначала линеаризируйте плазмиду путём расщепления не одной из них, затем транскрипцируйте мембранную ГФП-мРНК с линеаризованной плазмиды с помощью набора сообщений и машины M после транскрибации мРНК, количественно разбавляя полученную мРНК и воду до одного микрограмма на один микролитр, Элоква и храните при минус 80 градусах Цельсия до необходимости. За день до инъекции устанавливают брачные клетки, отделяя самцов от самок в день инъекции. Используйте прибор установки с микропипетой полярной формой для вытягивания капиллярных игл для инъекции.

Подготовьте инъекционную форму из 1% розы AGA с полосами шириной эмбрионов на одной клеточной стадии в день инъекции, разморозите аликвот мембранной ГФП мРНК с концентрацией одного микрограмма на микролитр на льду. Разведите мРНК с разъёмом от одного до пяти в воде до конечной концентрации 200 нанограммов на микролитр и храните на льду. Загрузите в капиллярную иглу один микролитр подготовленной мембраны, GFP мРНК при 200 нанограммах на микролитр.

Здесь мы добавляем 0,05% фенол-красного вещества в мРНК, чтобы сделать её видимой для инъекций. Поместите заряженную иглу в микроманипулятор, прикреплённый к бензиновому микроинжектору. Отрегулируйте объём инжекции до одного нанолитра.

Далее потяните перегородки на диких рыб, установленных в клетках для спаривания с предыдущего дня. Собирайте эмбрионы сразу после их откладки. Заполните форму для инжекционной формы розы AGA эмбриональной средой и ориентируйте эмбрионы внутри формы с одной ячейкой на стороне, вдали от микроманипулятора.

Вводите через корион и желтки так, чтобы мРНК относилась непосредственно в одну клетку. Вводите примерно 50 эмбрионов за один эксперимент. Однако, если клетка делилась, не делать инъекции после инъекции эмбрионов, а инкубировать их при 28 градусах Цельсия ночью в эмбриональной среде.

После ночной инкубации введённые эмбрионы готовы к установке и визуализации. Для начала этой процедуры удаляйте корион из эмбрионов щипцами под стереомикроскопом за час до точки интереса, подготовьте слайд для установки до четырёх эмбрионов. Затем заполните затвор 0,7% аро прямо до верхней части затвора и подождите около 20 минут или пока аро не затвердеет.

Когда аро затвердеет, сделайте небольшое отверстие в аэросе с помощью наконечника пипетки объемом 200 микролитров, чтобы создать цилиндрические отверстия для установки каждого эмбриона. Перед установкой снимите пробки Aros щипцем. Поместите эмбрионы на аэрозаполненное стекло под микроскопом.

Добавьте 50 микролитров трика для анестезии. Эмбрионы. Используйте щипцы, чтобы ориентировать эмбрионы, перевернутые в цилиндрических отверстиях в арозе, а мозг или интересующая область приближаются к подлежащему покрытию.

Эмбрионы в AGA поднимались с помощью ещё одного покрытия и закреплялись силиконовой вакуумной смазкой. Эмбрионы теперь готовы к визуализации. Сфотографируйте эмбрион с помощью инвертированного люминесцентного лазерного сканирующего конфокального микроскопа, как показано здесь, или с вращающимся дисковым конфокальным микроскопом с частотой 63 раза и выше, чтобы собрать высококачественные изображения отдельных клеток внутри нейроэпителия.

Изображения экспортируются в формате TIF-файлов из программы LSM и анализируются с помощью Photoshop. Это репрезентативное конфокальное изображение 24-часового эмбриона данио-рерио, нейроэпителий между средним и задним желудочками. M обозначает средний мозг, желудочек, а H — желудочек заднего мозга.

Каждая клетка маркируется мембранно-связанным GFPE. Мы только что продемонстрировали технику, позволяющую анализировать развивающийся мозг данио-рерио-рерио-ревиора с разрешением одной клетки. Эта техника позволила нам изучить новый тип изменения формы клеток, называемый базальной констрикцией БА.

Его также можно использовать для анализа других типов явлений и для значительного расширения нашего понимания органогенеза позвонков, а также их клеточной биологии. Вот и всё. Спасибо за просмотр и удачи в экспериментах.