Идентификация белковых комплексов с количественной протеомики в CEREVISIAE С.

Эта процедура начинается с культивирования штамма приманки в средах, содержащих нормальные аминокислоты в контрольном штамме SLAC и тяжелые изотопные лизин и аргинин. Равные количества обоих штаммов смешиваются и лизируются путем измельчения и жидкого азота сырых лизатов, сначала гранулируются центрифугой, а затем очищаются путем связывания с шариками сфероса. Затем лизат клеток связывается с шариками IgG.

Белки, связанные с гранулами IgG, обозначаются протеазой, расщеплением и осаждением. Теперь образец готов к анализу с помощью масс-спектрометрии. Здравствуйте, я Джесси Чао из Одинокой лаборатории на кафедре клеточной биологии окружающей среды Института наук о жизни Университета Британской Колумбии.

Сегодня покажем вам процедуру количественного протеомного анализа, которая называется силак. В сочетании с аффинити-очисткой. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения белковых комплексов.

Итак, давайте начнем В этой процедуре штамм приманки содержит нормальные аминокислоты, в то время как контрольный штамм SLAC содержит тяжелые изотопы, лизин и аргинин. Для начала сначала вырастите один литр, каждый из штаммов приманки и контрольный штамм отдельно до значения, указанного на вашем экране. Далее высыпаем культуру в 500-миллилитровые центрифужные пробирки Nalgene.

Сбалансируйте нагрузку в грануляторах на уровне 2 580 RCF сцеживайте среду и повторно суспендируйте гранулу. С 50 миллилитрами холодного D H2O при одновременном переносе ячеек до 50 миллилитров, центрифугируйте пробирки, центрифугируйте пробирки для гранулирования клеток при 3000 RCF. На этом этапе вы можете заморозить гранулы при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Важно помнить о том, что культура контрольного штамма должна быть сопоставлена с культурой штамма приманки в соотношении один к одному по весу сухих гранул. Ресуспендируйте каждую клеточную гранулу в 10 миллилитров буфера NP 40 с коктейлем ингибиторов протеазы от одного до 2000. Смешайте две клеточные культуры, сцеживая одну пробирку непосредственно в другую.

Чтобы начать измельчение ячеек, сначала налейте жидкий азот в предварительно охлажденный раствор и дайте ему полностью испариться. Далее добавляем в раствор два миллилитра ячеек. Влейте немного жидкого азота, чтобы заморозить ячейки.

Измельчите ячейки до тех пор, пока ячейки не станут мелкими. Порошок. Повторяйте процесс до тех пор, пока все ячейки не будут измельчены. Обязательно не допускайте оттаивания клеток.

При необходимости добавляйте жидкий азот. Далее переложите порошок в ледяной стакан и разморозьте комнатной температуры. Когда края начнут оттаивать, добавьте 20 миллилитров буфера NP 40 с одним к 200 PIC после того, как он оттает.

Перенесите сырой лизат в 40-миллилитровые пробирки Nalgene и вращайте со скоростью 16 000 об/мин в роторе Sovos SA 600 в течение 30 минут. Пока ждете, возьмите 300 микролитров СРО двух бусин Б и промойте бусины в 300 микролитрах буфера NP 40 три раза. Далее суспензируйте шарики в буферах объемом 300 микролитров так, чтобы они оказались в кашице один к одному.

Следующим этапом является предварительная очистка клеточного лизата. Чтобы сделать это в первую очередь, переложите супер натин в новую пробирку и добавьте две бусины Spheros. Инкубировать на вращающейся платформе в холодном помещении в течение 30 минут.

Во время инкубации возьмите 300 микролитров IgG СРО из шести шариков и промойте шарики в 300 микролитрах буфера NP 40 три раза. Затем повторно суспендируйте шарики в буферах объемом 300 микролитров так, чтобы они оказались в кашице один к одному. После инкубации гранулируйте СРО.

Две бусины в. Переложите надосадочную жидкость в новую трубку. Не забудьте сохранить аликвоту клеточного лизата для вестерн-блоттинга позже.

Затем добавьте бусины IgG. Разделите содержимое на две пробирки для более эффективного связывания, выдержите на вращающейся платформе в холодном помещении в течение двух часов. После инкубации соберите шарики в хроматографическую колонку при температуре четыре градуса Цельсия.

Обязательно сохраните аликвоту несвязанной фракции. Вымойте бусины 10 миллилитров. Буфер NP 40.

Далее вымойте бусины с тремя миллилитрами. Буфер TEVC. Опять же, не забудьте сохранить аликвоту бусин.

Это будет отражать эффективность связывания для элюирования бусин. Сначала добавьте пять микролитров A-C-T-E-V к одному миллилитру буфера TEVC. Добавьте к бусинам буфер TEVC и перемешайте.

Перелейте содержимое в две 1,5-миллилитровые пробирки EINOR из более эффективного перемешивания и инкубируйте на вращающейся платформе в холодном помещении на ночь. Далее закрутите бусины вниз и переложите элюат в свежую 1,5-миллилитровую трубку. После промывки промойте шарики дополнительными 0,5 миллилитрами буфера TEVC.

Соедините восьмерку в одной трубке. Всего у вас должно получиться 1,5 миллилитра ELU восемь. Приберегите аликвоту из восьми TEV Elu для осаждения.

Отрегулируйте аликвоты до 25% ТСА со стопроцентным ТСА. Для этого разделите восьмерку объемом 1,5 миллилитра на две пробирки по 750 микролитров каждая. Добавьте в тюбик 250 микролитров 100% ТСА.

Ваш раствор должен стать молочным. Далее поместите его на лед на 30 минут. Периодически вортекс смеси после инкубации.

Вращайте на максимальной скорости в настольной центрифуге в холодном помещении в течение 30 минут. Умойтесь один раз 500 микролитрами ледяного ацетона, содержащего 0,05 нормальной соляной кислоты. Затем вращайтесь в течение пяти минут на максимальной скорости в четыре градуса Цельсия.

Далее умойтесь один раз 500 микролитрами ледяного ацетона и отжимайте в течение пяти минут на максимальной скорости при четырех градусах Цельсия. После отжима аккуратно удалите ацетон и сухую гранулу для окрашивания серебра. Повторно суспендируйте гранулу в 50 микролитрах, что в один раз превышает буфер для образца SDS.

Если вы планируете использовать осажденный белок для анализа, основанного на масс-спектрометрии, то рекомендуется использовать осаждение с использованием этанола. Чтобы сделать это, сначала добавьте 20 микрограммов гликогена, затем разбавьте образцы в пять раз стопроцентным этанолом и доведите до 50 миллимолярных бикарбонатов натрия с 2,5 молярным запасом при pH 5,0. Перемешайте раствор, перевернув трубку.

Дайте постоять два часа при комнатной температуре. Наконец, разделите содержимое на две пробирки эйнора. Гранулируйте осажденный белок центрифугированием в течение 10 минут при 12 000 GS при комнатной температуре.

Аликвота, сохраненная во время процедуры очистки, должна включать в себя предварительно очищенный лизат клеток, связанную фракцию, несвязанную фракцию и ускользающую фракцию. Мы рекомендуем анализировать содержание белка в вышеуказанных аликвотах методом вестерн-блоттинга с использованием антител Antit TAP или окрашивания серебром, чтобы отразить эффективность связывания и элюирования в эксперименте. В этом геле с серебряным пятном очищено два крана SCS при его взаимодействии, партнеры были визуализированы и сравнены с непомеченным контролем в этом западном блоте.

Различные фракции, взятые во время очистки двух кранов SCS, были проанализированы методом вестерн-блоттинга с использованием антител Antit tap. Обратите внимание, что два тапа SCS мигрировали с более низкой молекулярной массой после элюциана при расщеплении протеазы TEV, и после элюирования на шариках IgG не осталось двух краев S SCS. Это подтвердило высокую эффективность очистки.

Мы только что показали вам, как очистить белковые комплексы с помощью аффинной очистки с помощью гранул IgG. При выполнении этой процедуры важно помнить, что перед началом процедуры очистки необходимо убедиться, что базовая деформация и контрольная деформация соответствуют весу сухой пелли. Поскольку LAC обеспечивает нам объективные и точные измерения партнеров по связыванию белков, мы выполняем только первый этап очистки краном, чтобы свести к минимуму потери пробы.

Если вы сталкиваетесь со значительным количеством неспецифических привязок, вы можете захотеть выполнить весь протокол, который можно найти в руководстве по холодной пружинной гавани. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.

Эй, давай, Марк. А, иди.