Фокусное Ca ^{2 +} Переходные Обнаружение в гладкой мускулатуре

Сначала подготавливают раствор для нагрузки кальцием, который затем нагревают и продувают газом. Мочевой пузырь выделяют путем диссекции, вскрывают, закрепляют булавками в расправленном виде, после чего вырезают полоску детрузора. Полоску детрузора помещают в раствор для нагрузки, инкубируют, промывают и закрепляют булавками в расправленном виде.

Флуоресцентный индикатор кальция в ткани возбуждается лазерным излучением, после чего регистрируется испускаемый свет. Полученные видеозаписи, состоящие из отдельных кадров, анализируются путем сравнения последовательных кадров. Выполняется вычитание фона.

Порог края клетки определяет область поиска событий, после чего вычисляется соотношение между последовательными образцами мозга. Если оставшиеся события соответствуют заданным критериям, они выделяются и маркируются. Здравствуйте, меня зовут Джон Янг, я представляю лаборатории Кита Брейна и Тома Кинана кафедры фармакологии Оксфордского университета.

Я Роб Амос, также из лабораторий Брейна и Кэнн, а меня зовут Кит Брейн. Сегодня Джон и Роб продемонстрируют вам метод кальциевого имиджинга в гладких мышцах. Мы используем этот метод в нашей лаборатории для изучения высвобождения нейромедиаторов из вегетативных нервов и их воздействия на гладкие мышцы.

Итак, приступим. Индикатор кальция Organ Green 488 BAPTA-1 поставляется во флаконах объемом 500 µL, содержащих 50 µg порошка. Чтобы приготовить индикатор кальция, добавьте 40 µL раствора Onic F1 27 к порошку и осторожно встряхивайте в течение 30 секунд; после этого добавьте 460 µL физиологического раствора (PSS) и снова осторожно встряхивайте в течение 30 секунд.

Конечный раствор Organ Green 488 Plus в концентрации 10 µM разделяют на четыре аликвоты по 125 µL каждая. Избегайте воздействия света и храните раствор при температуре -20 °C до начала препарирования исследуемой ткани.

Извлеките индикатор кальция из морозильной камеры и разморозьте при комнатной температуре до достижения нужной консистенции. Поместите один миллилитр PSS в пробирку и установите ее в водяную баню при температуре 33 °C. Закрепите барботизатор в пробирке с помощью пробки или используйте перфлюрон, затем проведите барботирование смесью 95% кислорода и 5% углекислого газа со скоростью примерно один пузырек в секунду.

Выделите орган с гладкой мускулатурой из организма животного. В данном случае это мочевой пузырь мыши. Поместите орган примерно в 50 миллилитров PSS для промывки; после тщательного промывания ткани аккуратно удалите окружающую жировую и соединительную ткани.

Выполните вскрытие согласно типу гладких мышц для мочевого пузыря. Сделайте продольный разрез от шейки мочевого пузыря и каудального конца до вершины купола. На краниальном конце подготовьте четыре полоски длиной 6–8 мм и шириной 1–2 мм вдоль дорсальной поверхности, производя разрез в направлении доминирующих мышечных пучков.

Поместите препарированную ткань и предварительно прогретый и продутый PSS для загрузки индикатора кальция (125 мкл 10 мкМ Organ Green 488) в пробирку к ткани и слегка встряхните ее вручную для перемешивания. Верните пробирку в водяную баню. Снова начните продувку и накройте водяную баню листом фольги.

Время, необходимое для поглощения индикатора кальция достаточным количеством ткани, варьируется в зависимости от размера ткани и толщины слоя гладких мышц. Например, для детрузора мыши и oxs крысы это время составляет 70 минут. В то время как для детрузора крысы и VAs deens мыши инкубация проводится в течение 120 минут.

После насыщения ткани индикатором кальция ее можно подготовить к микроскопии. Сначала промойте ткань в аэрированном PSS в течение 10 минут. Затем поместите ткань в чашку для препаратов, выстланную S-guard.

Слегка растяните ткань, чтобы она приняла форму плоского листа. Закрепите ткань с помощью коротких отрезков, например, двухмиллиметровых серебряных проволок диаметром от 25 до 50 µm, вставляя их под углом.

Избегайте использования булавок длиной более нескольких миллиметров, так как они могут поцарапать объектив. Тщательное закрепление ткани с помощью булавок важно для минимизации спонтанного смещения ткани и для облегчения поиска подходящего участка для визуализации. После закрепления ткани поместите чашку с препаратом на предметный столик микроскопа.

Следите за тем, чтобы PSS не вытекал за пределы области чашки, ограниченной силиконовым барьером, так как это может привести к покрытию PSS большой площади поверхности. Когда суперфузия начнется в демонстрационных целях, следующие шаги будут выполняться при освещении.

Обратите внимание, что эти эксперименты обычно проводятся в темноте. Включите насос для перфузии препарата. При использовании PSS часто применяется скорость 100 milliliters per hour.

Включите нагревательный блок, поместите входную и выходную трубки, а также температурный датчик на чашку для препарата, закрепив каждую из них магнитом на основании к металлической полосе. Высота кончика выходной трубки будет определять глубину PSS. Убедитесь, что через выходную трубку действительно отводится PSS, так как иногда этого не происходит.

Сначала установите на нагревательном устройстве температуру, чтобы достичь желаемого значения в диапазоне от 33 до 35 °C. Дайте ткани прийти в равновесие в течение как минимум 10 минут, используя объектив с малой кратностью увеличения — 10х или 20х.

Используйте эпифлуоресцентную микроскопию или возбуждение синим светом для визуализации гладких мышц и выбора подходящего участка для мониторинга. Поскольку воздействие возбуждающего освещения вызывает фотовыцветание индикатора, избегайте использования освещения более чем на несколько секунд за один раз.

Избегайте участков с ярко выраженными структурами, так как они могут привести к большому количеству ложноположительных результатов в алгоритме обнаружения объектов на изображении. Старайтесь выбрать участок с минимальной подвижностью и большим количеством гладкомышечных клеток в поле зрения. После выбора участка для съемки переключитесь на объектив с большим увеличением, например 40 x.

Поверните предметный столик или оптическую ось так, чтобы гладкомышечная клетка или клетки располагались горизонтально, то есть параллельно оси быстрого сканирования. Теперь гладкомышечные клетки готовы к визуализации с помощью конфокальной микроскопии.

В данном протоколе используется вертикальный конфокальный микроскоп Leica SP2. Установите диафрагму (pinhole) на один диск Эйри. Настраиваемый фильтр Custo Optic установите на мощность лазера от 25 до 35%.

Это значение представляет собой компромисс между яркостью и фотообесцвечиванием. Для подготовки к анализу данных скачайте и установите ImageJ. Скачайте версию для вашей операционной системы, а затем обновите ее до последней версии, скачав актуальный jar-файл ImageJ для замены старого файла. Затем скачайте jar-файл Excel writer и установите его в директорию plugins jar.

Скопируйте эти файлы в каталог плагинов. Установите каждый из этих скриптов с помощью макросов плагинов. Используйте функцию установки в ImageJ. Программное обеспечение для используемого нами конфокального микроскопа Leica SP2 называется Leica.

LCS сохраняет отдельные кадры каждой серии в виде отдельных файлов. Чтобы реконструировать серию, убедитесь, что все кадры, подлежащие реконструкции, находятся в одной папке.

Например, папка с tiff-файлами с данными. Затем в меню «Plugins» → «Macros» выберите макрос «Leica SP two stacker». Выберите корневой каталог, в данном случае — папку с данными.

Выберите нужную папку из раскрывающегося списка. В данном случае выберите выходной каталог для tiffs или создайте новый. Например, папку data folder stacks.

Затем скрипт реконструирует серии из отдельных кадров для коррекции смещения. Мы используем общедоступный алгоритм, который выравнивает или сопоставляет кадры внутри серии: downloads stack, rig и turbo reg. Скопируйте соответствующие файлы в папку stacks.

Загрузите стек для обработки, затем перейдите к кадру, на котором четко видна интересующая область. Остальные кадры будут выровнены по этому эталонному кадру. После этого перейдите в меню Plugins → Stacks.

Регистрация стека. Попробуйте различные варианты трансформации, чтобы определить наиболее эффективный для каждого участка. Факторы изображения, влияющие на детектирование кальциевых транзиентов, будут варьироваться в зависимости от измерения определенных свойств и параметров частиц каждого участка.

Чувствительность и специфичность детектирования повышаются. Таким образом, для каждого участка мы рассчитаем порог вычитания для отношения и порог края клетки. Для начала перейдите в plugins, macros, install и выберите jn CTO dot oh eight release dot IJM JM. Затем перейдите в plugins macros load stack.

Выберите серию и рассчитайте следующие параметры частиц. Для расчета порога вычитания выделите прямоугольную область интереса там, где, по вашему мнению, находится фоновое измерение; запишите среднее значение. Для расчета порога отношения выделите прямоугольную область интереса вокруг оптически плоского участка гладкомышечной клетки или клеток.

Измерьте и запишите среднее значение и стандартное отклонение. Повторите процесс еще дважды или выделите три области одновременно, удерживая клавишу shift. Вычислите и запишите пороговое значение соотношения.

Рассчитайте значение как стандартное отклонение, деленное на среднее значение плюс один, а затем умножьте результат на 32. При усреднении значений трех повторностей множитель 32 необходим для учета алгоритма вычисления отношений, в котором отсутствие изменений по сравнению с предыдущим кадром соответствует целочисленному значению 32. Это обеспечивает достаточный динамический диапазон для обнаружения увеличения и уменьшения отношения.

Для восьмибитного изображения выберите инструмент регулировки порога изображения (image adjust threshold). Выберите черно-белый режим. Определите верхний предел ползунка и запишите соответствующее значение.

Это находится справа от ползунка. Будут учтены только события, происходящие в черных областях. Нажмите «сброс».

Теперь, когда рассчитаны пороговые значения для вычитаемого порога соотношения и порога края клетки, можно приступить к анализу стеков изображений. Определите расположение стеков, которые необходимо проанализировать. На данном этапе выберите только одну серию.

Это первый файл, и последний файл должен быть таким же. Затем выберите местоположение для вывода файлов данных и стеков. Например, папку output данных.

Введите значения порога вычитания, порога соотношения и порога краев клеток. Остальные настройки оставьте по умолчанию. Алгоритм создаст двухпанельное окно, в котором обработанная серия будет отображена слева, а оригинал — справа.

Откройте этот файл из выходной папки и внимательно изучите его, чтобы оценить количество ложноположительных результатов и случаев, когда визуально заметные события не были обнаружены. Для каждой серии алгоритм создает файл Excel, в котором подробно описаны характеристики обнаруженного события, такие как амплитуда, площадь и положение; ложноположительные результаты, выявленные при просмотре выходных файлов изображений алгоритма, можно удалить из этого файла Excel вручную. При этом следует использовать строгие критерии для такого удаления.

На данном видео показана динамика кальциевых транзиентов в гладких мышцах. В этом примере видео состоит из 100 отдельных кадров, полученных с частотой 5 Гц. При исследовании, например, влияния определенного препарата на частоту кальциевых транзиентов, в ходе одного эксперимента регистрируется множество таких видеозаписей.

Здесь мы видим многочисленные спонтанные кальциевые транзиенты в гладкомышечных клетках. Здесь показан результат работы алгоритма детектирования частиц. Для каждой серии алгоритм создает файл Excel, в котором подробно описаны характеристики обнаруженного события, такие как амплитуда, площадь и положение.

Таким образом, мы продемонстрировали метод визуализации транзиентов кальция в гладкомышечных органах, таких как мочевой пузырь, а также способ анализа этих транзиентов кальция с помощью алгоритма, разработанного в нашей лаборатории. Важно помнить о необходимости надлежащей подготовки ткани к визуализации кальция. В случае с тканью, которую мы рассматривали сегодня, это подразумевает удаление соединительной ткани и любого жира, который может закрывать обзор.

Также важно закрепить ткань в расправленном виде. Что ж, желаем удачи в ваших экспериментах и благодарим за просмотр.