Объективы трансплантации в данио рерио и его применение в анализе глаз Мутанты

Для начала трансплантации хрусталика у трансгенных доноров данио-рерио, экспрессирующих GFP, и реципиентов дикого типа, рыб сначала инкубируют в течение 30 минут в отдельных чашках Петри с безкальциевым раствором Рингера для данио-рерио. Затем личинок рыб встраивают в две параллельные линии в низкоплавкий агароз. Одна линия (А) предназначена для доноров, другая (Б) — для реципиентов. У реципиентов удаляется весь глаз донора, в то время как у доноров удаляется только хрусталик.

Ткани, окружающие донорский хрусталик, удаляют перед помещением хрусталика в глаз реципиента. После трансплантации рыб хранят в промаркированных 96-луночных планшетах. Трансплантированный хрусталик в глазу реципиента должен проявлять флуоресценцию GFP.

Разумеется, контралатеральный глаз хозяина не подвергался операции и не экспрессирует GFP. Здравствуйте, я Yj. А я Кайя Маккалоу, мы из лаборатории доктора Yma Maki на кафедре офтальмологии Гарвардской медицинской школы. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру трансплантации хрусталика у дикого типа zebrafish Daniel Rio.

В нашей лаборатории мы используем данную процедуру для пересадки хрусталиков от животных дикого типа мутантным животным и наоборот. Это позволяет нам определить, функционируют ли мутантные гены в хрусталике автономно или неавтономно. Итак, приступим.

Линии zebrafish содержат в стандартных условиях рыбоводного комплекса при температуре 28.5 °C с 14-часовым световым и 10-часовым темным циклом. Накануне запланированного эксперимента помещают самцов и самок в аквариум с разделителем, чтобы изолировать их друг от друга. Генотип этих рыб должен обеспечивать получение потомства с экспрессией GFP и любой интересующей мутацией. Параллельно по той же процедуре в течение одного часа подготавливают скрещивания между нетрансгенными животными дикого типа.

После включения света утром удалите разделители, чтобы дать рыбам возможность произвести нерест. Через 15–30 минут перелейте воду из аквариума через сито, чтобы собрать эмбрионы, а затем промойте их струей воды для икры из промывочной бутылки в чашку Петри размером 100 × 15 мм. Затем очистите икру, удаляя пипеткой неоплодотворенные эмбрионы и любой мусор.

Замените старую яичную воду на новую. До начала трансплантации хрусталика эмбрионы можно хранить в инкубаторе при температуре 28.5 °C. Когда вы будете готовы приступить к трансплантации, подготовьте эмбрионы, удалив хорион вручную.

С помощью металлического зонда и пинцета эмбрионы с удаленным хорионом необходимо инкубировать в 0,2% EDTA в безкальциевом ZFR в течение 30 минут. Во время инкубации можно подготовить иглы, необходимые для диссекции. Процедура трансплантации требует заточенной иглы для разрезания тканей вокруг хрусталика и эмбрионов Woolies из агрозов.

Также потребуется тупая игла для перемещения донорской линзы и ее введения в реципиент; для изготовления каждой иглы сначала отсекают кончик пастеровской пипетки с помощью алмазного ножа. Затем в кончик пастеровской пипетки вставляют стеклянный капилляр так, чтобы примерно половина его длины находилась внутри. С помощью пламени аккуратно вводят тонкую вольфрамовую проволоку в открытый конец капилляра.

Расплавьте стекло над проволокой с помощью пинцета, при этом одним концом удерживайте стекло металлической проволокой, одновременно закручивая другой конец иглы. Размягченное стекло должно закрутиться вокруг металла, надежно зафиксировав его. Таким образом из тупой иглы изготавливается острая игла.

Держите вольфрамовую проволоку над пламенем от 1 до 1,5 минут, чтобы выжечь металл. Таким образом создается очень тонкий кончик. Проверьте качество кончика с помощью микроскопии.

Кончик иглы должен быть ровным, без изгибов, и плавно сужаться к острому концу диаметром не более 50 µm. Стерилизуйте обе иглы в пламени в течение нескольких секунд и дайте им остыть перед началом процедуры. В пластиковой центрифужной пробирке подготовьте 1,2% низкоплавкий agarose и безкальциевый ZFR, предварительно нагретые до 40 °C на водяной бане. На нужном этапе соберите эмбрионы-доноры в пастеровскую пипетку и медленно перенесите их в центрифужную пробирку с agarose. Инкубируйте яйца в agarose около пяти секунд.

Извлеките эмбрионы с помощью пипетки и медленно и осторожно перенесите их в один ряд в полистирольную чашку Петри диаметром 100 мм; большинство эмбрионов будут лежать на боку глазом вверх. Теперь повторите этот процесс с яйцами реципиентов и расположите их в ряд параллельно яйцам доноров до затвердевания агарозы. Используйте тупоконечную иглу, чтобы повернуть неправильно ориентированные эмбрионы так, чтобы после затвердевания агарозы глаз был обращен вверх.

Накройте образец 0,2% раствором низкоплавящегося агарозы. Используя заточенную иглу, удалите агарозу вокруг глаз и очень осторожно вырежьте весь донорский глаз, который всплывет. Затем извлеките хрусталик из глаза.

Это выполняется путем протягивания иглы через ткани глаза снизу вверх. Только для донора. Хрусталик вырезают короткими движениями заостренной иглы, стараясь сделать разрез максимально близко к хрусталику, не разрывая его.

Избегайте чрезмерного удаления тканей из остальной части глаза реципиента. После освобождения хрусталики будут плавать в среде. С помощью тупой иглы осторожно переместите донорский хрусталик непосредственно над местом расположения хрусталика реципиента, затем с помощью тупой иглы протолкните его вниз в нужное положение.

Хрусталик реципиента можно удалить. Оставьте эмбрионы донора и реципиента в 1,2% Aros на 30–60 минут. Среда для эмбрионов способствует заживлению ран.

Затем извлеките их из агарозы с помощью заточенной металлической иглы. Перенесите эмбрионы в 24-луночный планшет с питательной средой для эмбрионов. Каждый эмбрион должен находиться в отдельной лунке.

Не забудьте правильно промаркировать лунки, чтобы после завершения переноса хрусталика было понятно, какой реципиент соответствует конкретному донору. Оставьте эмбрионы развиваться при температуре 28.5 °C до нужного момента. Для фенотипического наблюдения мы обычно изучаем дифференцировку хрусталика в течение одного-двух дней.

Хрусталик, полученный от донора, должен сохранять экспрессию GFP после трансплантации в глаз реципиента. Если мутантный фенотип не восстанавливается в условиях дикого типа, это указывает на автономность фенотипа. Однако, если восстановление происходит, фенотип считается неавтономным.

И это имеет важные последствия для функционирования соответствующего гена. Мы только что продемонстрировали вам, как выполнить трансплантацию хрусталика в эмбрионе данио-рерио. При выполнении этой процедуры крайне важно очень осторожно формировать иглы и проводить препарирование самого хрусталика.

Кроме того, после завершения трансплантации эмбрионы следует быстро расположить так, чтобы яйцо не перекатывалось. Не забудьте добавить среду для эмбрионов в восьмое лучевое окно. Вот и всё.

Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.