Генерация одноклеточных суспензий от мыши нервной ткани

Диссоциирующего клетки определенных типов ткани требует специфических параметров для ткани aggitation получить большой объем жизнеспособной, culturable клеток. Miltenyi gentleMACS диссоциатор оптимизирует эту задачу с простым, практичным протокола. В этой публикации использование этого аппарата на nerual тканей объясняется.

В нервной системе. Были описаны сотни типов нейрональных глиальных клеток. Каждый конкретный тип клеток в головном или спинном мозге имеет набор молекул клеточной поверхности или молекулярных детерминант, с помощью которых он может быть идентифицирован и охарактеризован.

В настоящее время надежные технологии идентификации и разделения клеток требуют получения одноклеточных препаратов при одновременном ограничении гибели клеток и разрушения характерного поверхностного белка. Мягкий ассоциатор max при использовании в сочетании с наборами для диссоциации на основе трипсина или пепана может эффективно и мягко диссоциировать ткань мозга, сохраняя при этом эпитопы антигенов, ограничивая потерю клеток. После получения суспензии одиночных клеток можно обрабатывать моноклональными конъюгатами, такими как анти-выдающиеся микрогранулы, которые идентифицируют нейропредшественников, или дополнительно очищать с помощью гранул для удаления миелина.

Здравствуйте, меня зовут Сандра ПеНАТ. Я являюсь менеджером проекта по нейробиологическим продуктам в Mil Biotech здесь, в Багаже, Габерт, Германия. Сегодня я покажу вам, как приготовить одноклеточную суспензию из ткани мозга мыши с помощью диссоциатора genix.

Диссоциатор genix — это устройство, которое может диссоциировать различные типы тканей в закрытой стерильной среде, что устраняет необходимость в утомительной ручной механической диссоциации. Итак, приступим. В зависимости от интересующего эпитопа антигена в последующих применениях используют либо набор для диссоциации нервной ткани на основе папаина, либо набор для диссоциации нервной ткани на основе трипсина.

Для сегодняшнего эксперимента мы предпочитаем набор для диссоциации нейротканей P, так как мы хотели бы изолировать выдающиеся положительные клетки с помощью микрогранул анти-выделяющейся. Выдающийся из них не чувствителен ни к пепану, ни к трипсину, и в таком случае набор для диссоциации нервной ткани P является лучшим выбором. Прежде чем начать разработку протокола, необходимо подготовить реагенты и растворы для этого набора.

Имейте под рукой собственный запас солевого раствора баланса Хэнка HBSS без ионов кальция и ионов магния HBSS с ионами кальция и магния и просвечивайте мне капто. Этанол начинают с приготовления раствора два раствора четыре и затем смешивают ферменты один. Сначала добавьте бета ме капто этанол во второй раствор до конечной концентрации 0,067 миллимоляра.

Теперь раствор стабилен в течение одного месяца при хранении при температуре четыре градуса Цельсия. Далее растворите лиофилизированный порошок и флакон с меченным раствором. Четыре. Используя 0,7 миллилитра буфера для хранения, перемешайте аккуратно и не делайте вихрей.

Теперь приготовьте фермент, смешайте один путем пипетирования 1900 микролитров раствора два и 50 микролитров раствора по одному в С-образную пробирку. Этого раствора достаточно для диссоциации 400 миллиграммов ткани, поэтому если будет диссоциировано больше, приготовьте дополнительно ферментную смесь по одному. Максимум 1600 миллиграммов мозговой ткани может быть переработано в С-трубке.

Затем ферментную смесь в С-трубке инкубируют при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10-15 минут. Для начала диссоциации пипеткой введите в пробирку один миллилитр HBSS без ионов кальция и магния. Установите трубку на весы, добавьте мозговую ткань и запишите ее массу.

Мозг этой мыши P four весит около 0,2 грамма. Мозг взрослого человека будет весить около 0,4 грамма для всех образцов тканей менее 400 миллиграммов. Объемы решений, которые мы будем использовать сегодня, достаточны.

Если ваша ткань весит более 400 миллиграммов, то соответственно увеличьте все объемы реагентов, в одной С-пробирке можно обработать до 1600 миллиграммов ткани. Перенесите мозг мыши в подготовленную С-трубку, содержащую 1 950 микролитров предварительно нагретого и фермента. Смешайте один и плотно закройте крышку.

Теперь поместите С-образную трубку на ассоциатор gen max колпачком вниз и убедитесь, что ткань расположена в области статора. Выберите программу MCO brain O one и запустите программу. Это первая из трех программ, которые вы будете запускать для диссоциации после завершения программы.

Извлеките С-образную трубку и инкубируйте образец в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия при медленном непрерывном вращении. При использовании вращателя трубок max mix режим работы устройства соответствует четырем оборотам в минуту. После первой инкубации поместите трубку обратно на диссоциацию вверх ногами и запустите программу М мозга O2. Во время следующей ассоциации приготовьте 30 микролитров ферментной смеси два на 400 миллиграмм ткани, добавив 20 микролитров раствора, от трех до 10 микролитров раствора четырех.

Когда второй ассоциаторный цикл подойдет к концу на 30 микролитров фермента, смешайте два фермента в С-пробирку непосредственно через перегородку, герметизирующую отверстие в центре колпачка. Чтобы обеспечить стерильность, аккуратно переверните С-образную трубку для перемешивания и не завивайте. Затем установите С-образную трубку обратно на вращатель пробирки для максимального смешивания и инкубируйте образец в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия при смешивании на четырех оборотах в минуту.

Затем CTU возвращается на мягкий максимальный дисассоциатор в третий и последний раз, и запускается программа M brain oh three. Когда третья программа будет завершена, поместите С-трубки на вращатель и инкубируйте еще 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Теперь кратковременно центрифугируйте образец, чтобы собрать клетки на дне пробирки.

Теперь мы готовы к фильтрации ячеек. Выберите сетчатый фильтр в соответствии с размером интересующего вас типа клеток. Если клетки, которые вы хотите собрать, имеют диаметр более 30 микрометров, такие как клетки киндзи, размер пор должен быть достаточно большим, чтобы пройти через тела клеток этого диаметра.

Для выступающих одноположительных клеток подойдет фильтр 30 микрометров. Удалите диссоциированную ткань из С-трубки с помощью наконечников пипетки объемом 1000 микролитров, которые проходят через герметичное отверстие перегородки в крышке С-трубки. Нанесите клеточную суспензию на сепарационный фильтр, помещенный на сборную пробирку объемом 15 миллилитров.

Для больших объемов образцов может потребоваться тюбик объемом 50 миллилитров. Дайте суспензии ячейки пробежать через фильтр. Затем промойте фильтр, добавив 10 миллилитров раствора HBSS с ионами кальция и магния.

При работе с тканями в количествах более 400 мг используйте до 30 миллилитров HBSS с ионами кальция и магния для промывки фильтра. Теперь оденьте клетки в сборной пробирке центрифугированием при давлении 300 G в течение 10 минут при комнатной температуре, полностью отасканируйте супернат и повторно суспендируйте клеточную гранулу в буфере или среде по вашему выбору. На этом этапе вы можете удалить любой мусор миелина, так как он может нарушить изоляцию клеток и окрашивание антител.

Для удаления остатков миелина мы предлагаем использовать шарики для удаления миелина. В остальном клетки готовы к дальнейшему применению. Эта точечная диаграмма, основанная на окрашивании йодидом пропидия, показывает, что 97% клеток, присутствующих в одноклеточной суспензии от растяжения связок домашней мыши, подобной той, что получена в этом видео, являются жизнеспособными.

Эти клетки могут быть дополнительно очищены с использованием антизаметных микрогранул с получением нейрональных предшественников, которые при культивировании в максимальной нейросреде с добавлением B 27 plus могут образовывать нейросферы на этих точечных графиках. Польза от обработки суспензий шариками для удаления миелина прослеживается. Значительно более высокий процент выдающихся предшественников нейронов, экспрессирующих один, получается при максимальном разделении после истощения миелина из суспензии одной клетки.

Я только что показал вам, как получить суспензию одиночных клеток из ткани мозга мыши, используя набор для диссоциации genix и набора для диссоциации нервной ткани. При выполнении этой процедуры важно подготовить все растворы соответствующим образом для правильного выбора набора для диссоциации нервной ткани, T или P. Пожалуйста, обратитесь к указанию по применению NDK или техническому паспорту. Используя этот метод, эмбриональные участки тканей, а также участки тканей D или весь мозг могут быть обработаны в стерильных условиях экономящим время и стандартизированным способом.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.