Пакетный Иммуноокрашивание крупномасштабных белка Обнаружение в весь мозг обезьяны

Эта процедура начинается с момента получения 4%-ного перфузийного, экстернализованного и криозащищенного мозга, который был отправлен сотрудникам нейронауки для встраивания с использованием ориентиров выравнивания, встроенных в окружающую матрицу. Мозг может быть разрезан в корональной плоскости для получения серийных срезов желаемой толщины, которые будут представлять всю переднюю заднюю часть мозга с помощью специализированных корзин и контейнеров. Пакетная иммунопроцессинг может быть выполнена для определения пространственного паттерна экспрессии белка во всем мозге.

Здравствуйте, я доктор Шахин Зур из Лаборатории визуальных нейронаук Школы оптометрии Монреальского университета. Здравствуйте, я доктор Марк Берк, также из лаборатории визуальных нейронаук в Школе оптометрии Монреальского университета. Здравствуйте, меня зовут Dr.Mo Петто, я директор Лаборатории визуальной нейробиологии в Школе оптометрии Монреальского университета.

Сегодня мы покажем вам процедуру периодического иммуноокрашивания для крупномасштабного обнаружения белка в мозге целой обезьяны. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения паттернов экспрессии белков-мишеней во всем мозге, а также для сравнения и сопоставления экспрессии этих белков в одном и том же мозге. Итак, приступим.

Перед гистологической обработкой получают мозг примата, который был сохранен с помощью системной перфузии и постфиксации и криозащищен с помощью градуированных растворов сахарозы. На этом этапе мозг направляется коллегам-нейробиологам для встраивания и свободного разделения с использованием их запатентованной технологии. По возвращении можно будет увидеть, что семь ориентиров выравнивания размещены в матрице встраивания, чтобы срезы могли быть правильно ориентированы и повторно выровнены после завершения гистологической обработки.

Во время выполнения секционирования делаются цифровые изображения, которые в дальнейшем могут быть использованы для 3D-реконструкции анатомических карт. Нейробиолог связывает обработку наших тканей, чтобы получить последовательные свободно плавающие корональные участки толщиной 50 микрометров по всему мозгу. После этого можно приступать к гистологической обработке срезов.

Когда мы начинаем гистологическую обработку, у нас обычно есть около 140 срезов для обработки одного антитела или окрашивания. Здесь мы продемонстрируем эту методику на меньшей выборке срезов, обработанных антителом SMI 32, которое представляет собой моноклональное антитело против белков нейрофиламентов, не содержащих фосфорилированных. На протяжении всей процедуры используются специализированные тарелки и корзины, что позволяет одновременно и эффективно обрабатывать большое количество свободно плавающих секций.

Это гарантирует, что полученное пятно будет равномерным на всех участках. Первым шагом является инкубация участков в растворе на основе PBS, содержащем TRITTON X 100 и обычную лошадиную сыворотку, в течение 60 минут. Это уменьшит неспецифическое связывание молекул антител, что приводит к фоновому окрашиванию.

Далее секции инкубируются в течение ночи. В растворе антител SMI 32 на основе PBS, дополненном триттоном X 100 и обычной лошадиной сывороткой на следующий день, срезы промывают в течение трех 10-минутных периодов в промывном растворе, а затем инкубируют в течение двух часов при комнатной температуре. В биотинилированном растворе Muse на основе PBS вторичного антитела, содержащем Triton X 100 и обычную лошадиную сыворотку.

После набора из трех дополнительных 10-минутных промываний срезы помещают в раствор конъюгированного комплекса пероксидазы хрена биотина авадон на один час при комнатной температуре. Наконец, после еще одного набора промываний, срезы помещают в реакцию D-аминобензина на 10 минут, которая приводит к появлению коричневого пятна внутри иммунореактивных нейронов. Затем реакцию останавливают путем извлечения корзины для окрашивания и погружения срезов в PBS.

После двух-трех-пятиминутных полосканий секции PBS готовы к установке по отдельности на стеклянные предметные стекла, чтобы начать процесс монтажа с помощью большой чашки Петри и очень мягких кистей для рисования. Секции поднимаются из буферного контейнера PBS и по отдельности устанавливаются на стеклянные стекла с желатиновым покрытием. Затем образцы высыхают на воздухе в течение ночи в вытяжном шкафу на следующий день.

Секции промываются путем погружения их в диионизированную воду, чтобы смыть любые кристаллы соли, которые могут остаться в процессе монтажа. Затем слайды обезвоживаются на ступенях из сортированного этанола, очищаются в ксилоле и накрываются монтажной средой для каждого монтажа. На этом этапе предметные стекла следует хранить от недели до 10 дней в горизонтальном положении, чтобы монтажная среда затвердела.

После этого слайды можно хранить в слайдовой коробке или подвергать визуализации с помощью микроскопии. Этот метод позволяет получить полный профиль экспрессии целевого белка, представляющего интерес, по всему мозгу обезьяны. Здесь мы показываем репрезентативные корональные сечения, которые обеспечивают моментальный снимок FMRP, нового n и экспрессии SMI 32.

В том же обезьяньем мозгу. Мы только что показали вам, как выполнить пакетное иммуноокрашивание для целевого белка, представляющего интерес, по всему мозгу. При выполнении этой процедуры важно убедиться, что все секции подвергаются умеренному перемешиванию во время инкубации в различных растворах и что они всегда остаются полностью погруженными.

Кроме того, не торопитесь при монтаже стекла для рассечений и удалите как можно больше морщин и складок, не повреждая целостность тканей. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.