В естественных условиях Са ^{2 +} - Съемка Гриб Нейроны тела во время обучения в обонятельной Honey Bee

Пчелы могут быть обусловлены в аппетит обонятельных парадигмы обучения (PER кондиционирования). Использование запахов в качестве стимула, мы создали метод, в котором поведение записывается одновременно Кальций изображений используется для измерения запаха вызванную активность нейронов в грибном теле

Эта процедура начинается с фиксации пчелы в записывающей камере. Из капсулы головки удаляется кусочек кутикулы, чтобы окрасить выбранные структуры в мозге. Сигналы кальция в окрашенных нейронах регистрируются in vivo с использованием широкоугольной визуализации.

Во время визуализации пчелу можно стимулировать запахами или доставкой сахарозы к антенне. Таким образом, пчела может быть приучена удлинять хоботок в ответ на запах. Реакция на разгибание хоботка контролируется с помощью записи электромиограммы из мышцы М 17.

После эксперимента с визуализацией мозг препарируют для более тщательного изучения окрашенных структур с помощью конфокального микроскопа. Привет, я Мелани из лаборатории рдо Мансела. Привет, я Аня, тоже из Mansel Lab.

Сегодня мы покажем вам процедуру визуализации кальция in vivo и тело гриба медоносной пчелы. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения обонятельного кодирования и обучения, связанной с пластичностью в мозге медоносной пчелы. Итак, приступим.

Начните с того, что поймайте фуражира медоносных пчел у входа в улей, а затем обездвижьте его, охладив на льду. Затем установите пчелу на записывающую камеру из плексигласа. Используйте твердый воск с низкой температурой плавления, чтобы закрепить глаза и грудную клетку на стене.

Все разбиваем стеклянный капилляр на кончике до получения диаметра 10 мкм. Покройте кончик капилляра d-пастой, состоящей из смеси URA в соотношении 10 к одному, двух декстринов и фиксируемого декстрина Родена. Подготовленный капилляр будет использоваться для окрашивания.

Чтобы начать процедуру окрашивания, сначала обездвижите усики с помощью коана. Откройте капсулу головки над мозгом, удалив кусочек кутикулы и раздвинув железы и трахею в стороны, открывая доступ к телу гриба. С помощью листа бумаги впитайте гемолимфу внутри капсулы головы.

Чтобы окрасить нейроны грибовидного тела, введите капилляр либо в сому, либо в дендритную область нейронов. Затем восстановите кусочек кутикулы на головной капсуле и ослабьте усики. Наконец, накормите пчелу 30% раствором сахарозы и храните ее в пенопластовой коробке, накрытой влажным кухонным полотенцем, не менее четырех часов или на ночь при температуре 20 градусов Цельсия.

После того, как подготовка к В завершена, мы можем приступить к визуализации in vivo. Для начала используйте губку, которая прикреплена к записывающей камере, чтобы пчела не могла пройти мимо, прижимая ее к брюшку. Теперь зафиксируйте антенны пчелы с помощью иоана, чтобы предотвратить движение мозга из-за прокачки пищевода.

Сделайте небольшой надрез на кутикуле над губой и аккуратно вытащите пищевод и окружающие его твердые структуры и покройте их двумя компонентами силиконом. Далее с помощью иглы проделывают отверстия для вставки проволочных электродов, используемых для записи электрограмм из транспортирной мышцы половой губы. Удалите кусочек кутикулы, трахею и железы над мозгом.

С помощью листа бумаги поглотите гемо внутри капсулы головы, чтобы записать электрограммы от М 17. Введите медную проволоку в мышцу, расположенную ближе к ротовым частям. Введите в глаз заземляющий электрод.

Теперь наполните головную капсулу двухкомпонентным силиконом. Убедитесь, что мозг полностью покрыт. Поставьте пчелу на предметный столик микроскопа и капните каплю воды на поверхность силикона.

Погрузите объектив погружения микроскопа в каплю, а затем сосредоточьтесь на нейронах сцены. Теперь, когда подготовка к визуализации in vivo завершена, мы можем описать стимуляцию запахов и регистрацию сигналов. Чтобы доставить вредитель к пчеле, мы используем специально изготовленный ольфактометр с компьютерным управлением, чтобы разбавить одоранты в постоянный поток воздуха.

Направленная на антенну стимуляция запаха состоит из трехсекундного импульса насыщенного запахом воздуха. Для визуализации кальция мы используем фотонную установку для визуализации, установленную на флуоресцентном микроскопе zes, для записи изображений при комнатной температуре с частотой дискретизации пять герц. Сигналы кальция записываются с помощью объектива X 60 0,9 Вт Olympus dip с ПЗС-камерой Ango, каждое измерение длится 10 секунд.

Мышечные потенциалы усиливаются с помощью усилителя травы, а также записываются и оцифровываются с помощью аналогового цифрового преобразователя. Записи с М 17 используются для мониторинга поведенческих реакций, связанных с обучением, после чего запись сигнала завершена, теперь мы можем перейти к морфологическому анализу и реконструкции. Потому что оба красителя, используемые при засыпке, имеют одинаковую молекулярную массу.

Они расположены в нейронах совместно. Широкопольная визуализация имеет ограниченное пространственное разрешение, поэтому для исследования окрашенных структур мы используем конфокальную сканирующую микроскопию. После эксперимента сначала препарируйте мозг и закрепите его на ночь в 4% формальдегиде при четырех градусах Цельсия на следующий день, промойте его в PBS, а затем обезвоживайте этанолом с шагом 10 минут в 50%70%90%99% и два раза по 10 минут в 100%Поместите мозг на предметное стекло с рифлением с каплей метилсалицилатного покрытия, Наденьте его, а затем поместите на предметный столик конфокального сканирующего микроскопа.

Отсканируйте мозг с помощью линзы воздушного объектива и цифрового зума от 1,1 до 1,2 с оптическим сечением четыре микрометра. Здесь мы видим реакцию внешних нейронов грибовидного тела на стимуляцию запаха антенн, записанную с помощью объектива в 60 раз и визуализированную в ложных цветах. Красный квадрат слева обозначает постоянство раздражителя запаха.

После эксперимента мозг препарируется и структуры окрашивания более подробно исследуются с помощью конфокального микроскопа с 20-кратным увеличением. Итак, мы только что показали вам, как визуализировать нейроны тела гриба у медоносной пчелы во время обонятельного обучения. При выполнении этой процедуры важно помнить, что эксперименты со светочувствительными красителями должны проводиться в темноте.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах. Пока.