Поколение прав CD40 активированных В-клеток

Здравствуйте, меня зовут Александр Шику Ван Хаген. Я являюсь сотрудником Лаборатории иммунологии и транспортной иммунологии при Университетской клинике Кёльна. В этом видео мы продемонстрируем вам, как получить активированные через CD40 B-клетки человека из мононуклеарных клеток периферической крови.

Одним из основных направлений работы нашей лаборатории является изучение антителонезависимых функций B-клеток. Помимо своей роли в качестве продуцентов антител, B-клетки играют важную роль как антигенпрезентирующие клетки как в физиологических условиях, так и при аутоиммунных заболеваниях. После активации B-клетки могут приобретать мощные антигенпрезентирующие и иммуностимулирующие способности, особенно при активации через CD 40.

CD 40. Активированные B-клетки обладают несколькими преимуществами по сравнению с дендритными клетками. Их можно легко экспандировать при относительно низких затратах из небольших объемов периферической крови, даже полученной от пациентов с онкологическими заболеваниями.

Сейчас наш аспирант Таня Лейк и наш техник ЛЕР представят вам пошаговое руководство по получению активированных CD 40 B-клеток человека из периферической крови. Здравствуйте, меня зовут Таня Ливи. Я аспирант, и я хочу продемонстрировать вам, как получить активированные CD 40 B-клетки человека.

Эта процедура была оптимизирована в нашей лаборатории. Основные этапы включают, прежде всего, подготовку фидерных клеток. Для этого мы используем клетки N IH 33, трансфицированные лигандом CD 40 человека, которые подвергаются облучению дозой 78 gray и высеваются в планшеты на шесть лунок.

Во-вторых, мы приступаем к культивированию активированных B-клеток человека CD 40 из очищенных PBMC, которые подвергаются воздействию интерлейкина 4 человека и циклоспорина A; затем эти клетки высевают в лунки шестилуночных планшетов. Эту процедуру повторяют на седьмой день, а затем каждые три-четыре дня до 14-го дня культивирования клеток. Чтобы получить высокочистые активированные B-клетки человека CD 40, мы начинаем генерацию активированных B-клеток CD 40 с использованием свежеочищенных или надлежащим образом размороженных PBMC человека.

Сначала мы дважды промываем PBMC, ресуспендируя клетки в 50 мл PBS. Центрифугируют PBMC в течение семи минут при 1300 об/мин, что соответствует 260 ×g. После этого супернатант удаляют и снова суспендируют клетки в 50 мл PBS, затем повторно центрифугируют в течение семи минут при 1100 об/мин, что соответствует 190 ×g. После этого супернатант снова удаляют для определения количества клеток.

Суспендируйте PBMC в 20 миллилитрах PBS, тщательно перемешайте клетки с помощью вортекса и определите количество клеток. Центрифугируйте необходимое количество PBMC для культуры CD 40 B в течение пяти минут при 1200 об/мин, что соответствует 220 5G. Для шестилуночного планшета вам потребуется 4 × 10⁶ клеток на лунку, что составляет 24 × 10⁶ клеток на планшет.

Затем ресуспендируйте PBMC в концентрации 1×10⁶ клеток/мл в культуральной среде CD 40 B. Добавьте в клеточную суспензию свежий человеческий IL-4 в концентрации 50 units/мл для стимуляции и циклоспорин А в концентрации 0,63 µg/мл для ингибирования пролиферации T-клеток. Теперь суспензия PBMC готова к стимуляции с помощью лиганда CD 40.

Насколько нам известно, в настоящее время функциональный лиганд CD 40 производства SOMAL стандарта GMP недоступен. Поэтому для стимуляции выживания, дифференцировки и пролиферации клеток мы используем клетки NIH 3T3, трансфицированные человеческим лигандом CD 40, поскольку клеточная линия NIH 3T3 может сохраняться в культуре в течение нескольких месяцев. Отсутствие экспрессии лиганда CD 40 необходимо регулярно исключать с помощью ПЦР.

Клеточная линия NIH 3T3, трансфецированная лигандом CD 40, представляет собой адгезивная линия, которую культивируют при 37 °C с 5% CO2 в селекционной среде, дополненной G 4 1 8 в концентрации 0,7 mg/mL. Эта адгезивная фибробластная линия не должна достигать полной конфлюэнтности; пересев следует проводить дважды в неделю. Для пересева адгезивных клеток аспирируют среду, один раз промывают 10 mL PBS и осторожно встряхивают флакон. Снова аспирируют среду и добавляют 4 mL трипсин-EDTA в флакон объемом 75 cm².

Инкубируйте колбу в течение 5–10 минут при 37 °C в инкубаторе. Снова извлеките колбу. Осторожно постучите по ней, чтобы отделить клетки от пластика.

Затем добавьте 10 мл среды для дикого типа, аккуратно перемешайте и перенесите клетки в пробирку объемом 50 мл. Центрифугируйте клетки NA eight three T three в течение пяти минут при 1200 об/мин, что соответствует 125G. Осторожно ресуспендируйте осадок клеток в 10 мл среды для дикого типа.

Определите количество клеток в третьем пассаже NIH 3T3 и ресуспендируйте 1,5 × 10⁶ фидерных клеток в 10 мл среды дикого типа. Перенесите их в флакон площадью 75 см² и добавьте G 418 в концентрации 0,7 мг/мл для селекции трансфицированных клеток, несущих гены устойчивости к неомицину. В завершение инкубируйте фидерные клетки при 37 °C в 5% CO2 для стимуляции CD 40 B.

Оставшиеся клетки NI 8 3 3 подвергнут летальному облучению дозой 78 Гр, чтобы остановить их пролиферацию. Разведите облученные фидерные клетки в среде соответствующего типа до плотности клеток 0,1 × 10⁶ клеток/мл; высейте по 2 мл в каждую лунку 6-луночного планшета. Перед использованием в качестве фидерных клеток для стимуляции B-лимфоцитов с помощью лиганда CD 40 дайте клеткам в 6-луночных планшетах снова прикрепиться, инкубируя их в течение 24 часов при 37 °C и 5% CO2.

Проверьте под микроскопом, прикрепились ли фидерные клетки, высеянные за день до этого. Если фидерные клетки прикрепились, удалите SUP natin из каждой лунки и быстро промойте их дважды. Сначала промойте каждую лунку двумя миллилитрами PBS, затем еще двумя миллилитрами.

Промывочная среда CD 40 B для стимуляции суспензии PBMC. Подготовьте непосредственно перед использованием суспензию с плотностью клеток 1×10⁶ клеток/мл для фидерных клеток. Для этого осторожно перенесите по 4 мл клеточной суспензии в каждую лунку.

Инкубируйте планшет при 37 °C в среде с 5% CO2 на седьмой день. B-клетки CD 40 можно подвергать субкультивированию; первый пассаж активированных B-клеток CD 40 проводится на седьмой день, последующие субкультуры — каждые три-четыре дня.

Осторожно соберите скопления клеток из 6-луночного планшета с помощью ресуспензии, используя 10-миллилитровую пипетку. Перенесите CD40 B-клетки в пробирку объемом 50 мл. Центрифугируйте CD40 B-клетки в течение семи минут при 1200 RPM, что соответствует 220 ×g.

Замените среду на промывочную среду для B-клеток, активированных CD40, и определите количество таких клеток. Ресуспендируйте B-клетки, активированные CD40, в культуральной среде для B-клеток CD40 в концентрации 1×10⁶ клеток/мл.

Затем снова дополните клеточную суспензию свежим человеческим IL-4 в концентрации 50 units/mL и циклоспорином A в концентрации 0,63 µg/mL для стимуляции. Добавьте облученные фидерные клетки, подготовленные за один день до этого. Разумеется, непосредственно перед использованием необходимо снова проверить адгезию облученных фидерных клеток под микроскопом.

Если клетки прилипли, быстро промойте фидерные клетки дважды: первый раз с помощью PBS, второй раз — промывочной средой CD 40 B, после чего осторожно внесите по 4 мл суспензии CD 40 B с концентрацией 1×10⁶ клеток/мл в каждую лунку 6-луночного планшета. Субкультивирование повторяют аналогичным образом каждые три-четыре дня дважды в неделю, чтобы к 14-му дню культивирования получить клеточные кластеры высокой чистоты из активированных CD 40 B-клеток человека.

На данном этапе B-клетки, активированные через CD 40, экспрессируют костимулирующие молекулы, такие как CD 80, CD 86, CD 83, молекулы MHC, а также так называемую триаду хоминга в лимфатические узлы, состоящую из лиганда CD 62, CCR seven и LFA one; экспрессию которых можно проверить с помощью проточной цитометрии. Для поиска и устранения неисправностей, пожалуйста, обратитесь к текстовой версии данного протокола. Мы надеемся, что в будущем CD 40-активированные B-клетки станут важным инструментом для иммунотерапии рака.

Удачи в проведении ваших экспериментов.