Использование Подкова Краб, Limulus Полифема, В Vision Research

Здравствуйте, я Крис Палья, директор Лаборатории обработки визуальной информации на кафедре биомедицинской инженерии Бостонского университета. Здравствуйте, я Жак Лю, аспирант в лаборатории доктора Пальи. Исследовательская работа нашей лаборатории направлена на изучение нейронных вычислений, которые позволяют животным видеть.

Для данного исследования мы используем одно из древнейших существ на Земле — американского this horseshoe crab. Эти животные могут считаться живыми ископаемыми, и они по-прежнему играют незаменимую роль в биомедицинских исследованиях.

Их кровь не только содержит специальные клетки, которые ученые используют для обнаружения бактериальных токсинов в наших лекарствах, но и их глаза обладают нейронной сетью, которая позволила глубже понять принципы работы нашей зрительной системы. Клеточная основа таких процессов, как адаптация к свету и латеральное торможение, была впервые выявлена в исследованиях фасеточных боковых глаз этого животного, и за эту новаторскую работу доктор Кеффер Хартлайн в 1967 году был удостоен Нобелевской премии. Мечехвост остается привлекательной моделью для исследований зрения, поскольку это животное крупное и выносливое для беспозвоночного, а нейроны его сетчатки большие и легкодоступные.

Их зрительная система компактна и детально изучена, а зрительное поведение четко определено. Более того, структура и функции глаз ежедневно модулируются циркадными часами в головном мозге животного. Одним словом, зрительная система хеиреокрабов достаточно проста для понимания, но при этом достаточно сложна, чтобы представлять интерес.

В этом видео мы продемонстрируем три экспериментальные парадигмы для исследования нейронных основ зрения, которые можно реализовать in vivo на этой классической животной модели. Для исследований зрения используются запись электроретинограммы, запись с оптического нерва и интраретинальная запись. Хелониды содержатся в резервуаре с аэрируемой соленой водой в помещении с регулируемым циклом свет-темнота.

Перед началом применения любой из этих методик регистрации животных охлаждали в ведре со льдом в течение примерно 10 минут, после чего фиксировали на деревянной платформе, вкручивая по два винта из нержавеющей стали в просому и эписому. Платформа утяжелена снизу гранитом для того, чтобы она погружалась в воду. Для мониторинга чувствительности глаз с течением времени используется электроретинограмма (ЭРГ).

Этот метод позволяет измерить суммарный электрический ответ всех клеток глаза. Для проведения этой процедуры со вспышкой света потребуются следующие инструменты: отвертка, вазелин, раствор Рингера, пипетка, светодиод, регистрирующая камера, винты из нержавеющей стали и ватная палочка. Для измерения ЭРГ мы используем регистрирующую камеру собственного изготовления.

Корпус предназначен для удержания резервуара с физиологическим раствором в контакте с глазом. Крышка содержит проволоку из хлорида серебра для подключения проводящего раствора к усилителю и небольшое отверстие подходящего размера для установки светодиода перед креплением. Нижняя часть камеры покрыта вазелином.

Затем камеры закрепляют над глазом Horseshoe crab двумя винтами, заполняют физиологическим раствором и закрывают крышками. Животное помещают в светонепроницаемую клетку в резервуар с морской водой так, чтобы жабры были погружены в воду. Кабель светодиода вставляют в крышку камеры.

Сигнальный провод закрепляется зажимом на проволоке камеры, а референсный провод — к одному из имплантированных винтов; оба провода подключаются к головному блоку дифференциального усилителя с высоким входным сопротивлением для усиления сигнала и фильтрации шумов. Затем клетка закрывается, чтобы предотвратить попадание комнатного света на животное. Блок АЦП подключается к усилителю, а фильтры усилителя настраиваются на пропускание частот ниже примерно 10 hertz.

Затем сигнал поступает на осциллограф для визуализации и на плату сбора данных для компьютерного анализа и хранения. Для подачи световых стимулов от светодиода (LED) и записи сигнала ЭРГ мы используем специально разработанную программу, написанную в LabVIEW. Светодиод активируется импульсом напряжением 5 V длительностью 100 millisecond каждые 10 минут. Слева отображена форма волны ЭРГ для каждой световой вспышки, а справа построен график размах амплитуды последовательных вспышек для отслеживания изменений чувствительности глаза с течением времени.

С помощью регистрации ЭРГ можно изучать эффекты световой адаптации и циркадной нейронной модуляции. Глаз передает зрительные сообщения в мозг посредством спайковых ответов волокон зрительного нерва. Кодированные сообщения можно изучать путем внеклеточной регистрации активности одиночных нервных волокон.

С помощью данного метода также можно изучать сигналы циркадных часов, передаваемые обратно в глаз. Инструменты, необходимые для этой процедуры, включают отвертку, раствор для промывания, ножницы, регистрирующую камеру, изогнутый пинцет, тонкий игольчатый зонд, тупой скальпель, хирургические ножницы и секционный электрод. Регистрирующие камеры сконструированы с выступом для размещения нерва; чтобы удалить 20 milliliters крови из организма лошади или краба, следует ввести иглу 16 gauge между мышцами шарнира и направить ее к сердцу.

Обескровливание не является обязательным, но облегчает диссекцию зрительного нерва при фиксации животного на платформе. Расположение зрительного нерва определяют путем проведения слегка изогнутой линии на карапаксе между латеральным и медиальным глазами. Затем в карапаксе с помощью рефина делают круглое отверстие.

Диаметр отверстия совпадает с диаметром дна камеры. Центр отверстия расположен примерно в двух сантиметрах кпереди от латерального глаза и немного дорсальнее линии, чтобы нерв проходил вдоль вентральной части камеры; вышележащая соединительная ткань удаляется до тех пор, пока не станет виден нерв на всем протяжении, после чего обнаженный нерв освобождают от окружающих и подлежащих тканей. Нить обводят вокруг нерва и затягивают в камеру через полукруглое отверстие в дне.

Через то же самое отверстие нерв осторожно заправляют в камеру, потягивая за нить. По мере вхождения нерва в камеру ее дно прижимают к отверстию, чтобы минимизировать растяжение нерва. Затем камеру закрепляют двумя винтами и заполняют раствором Рингера.

После фиксации камеры животное помещают в легкую сетчатую клетку в резервуар, заполненный морской водой выше уровня жабр. Внутреннее пространство камеры осматривают под стереомикроскопом, а вокруг отверстия в нижней части прокладывают ватный тампон, чтобы предотвратить попадание крови внутрь камеры и вытекание раствора Рингера из нее. Камеру снова заполняют свежим раствором Рингера.

Остатки тканей удаляют с помощью тонких изогнутых ножниц и пинцета. В оболочке, инкапсулирующей нерв, делают небольшой разрез, после чего нерв отделяют от оболочки тонким игольчатым зондом. Оболочку постепенно разматывают и удаляют, разрезая ее вдоль нерва.

Затем с помощью зонда от нерва отделяют небольшой пучок волокон и делают разрез на конце, наиболее удаленном от глаза, для регистрации афферентных волокон, и на конце, ближайшем к глазу, для регистрации эфферентных волокон. Для регистрации мы используем секционный электрод системы AM, заполненный раствором Спрингера, который соединен трубкой с шприцем Гилмана для создания вакуума. Кончик электрода изготавливают путем огневой полировки конца боросиликатной стеклянной капилляри с диаметром 1 мм. Соединения A, B и C обеспечивают сигнальный и референсный выводы; в качестве референсного вывода используется проволока с покрытием из хлорида серебра, обернутая вокруг электрода для снижения уровня шума.

Кончик электрода помещают в регистрирующую камеру, а срезанный конец нервного пучка втягивают в стеклянный наконечник с помощью вакуумного всасывания. Сигнальный и референсный выводы подключают к головному блоку дифференциального усилителя для усиления сигнала и фильтрации шумов. Выход усилителя направляется на осциллограф для визуального контроля и на карту сбора данных для компьютерного анализа и хранения.

Для управления световыми стимулами мы используем специально разработанную программу на языке LabVIEW, а для записи последовательностей спайков — цифровой дискриминатор спайков. Для освещения отдельной клетки применяется волоконно-оптический световод, в то время как для стимуляции паттернами при записи с Each зрительного нерва используется управляемый компьютером видеодисплей; таким образом можно изучать передачу сигнала между глазами и мозгом внутри сетчатки. Регистрация данных включает в себя введение микроэлектрода непосредственно в клетки глаза и запись внутриклеточных колебаний напряжения, индуцированных светом.

Инструменты, необходимые для данной процедуры, включают отвертку и L-образную прозрачную платформу. Резьбовые отверстия для винтов, микроэлектрод для установки над стеклянным электродом, винты из нержавеющей стали, пинцет и тонкий скальпель. После фиксации панциря краба с помощью зажима, деревянной платформы и прозрачной пластины с заранее подготовленными отверстиями под винты, последняя крепится к запястью с помощью двух винтов по бокам и одного сверху.

Животное помещают в светонепроницаемую клетку в резервуаре, заполненном морской водой выше уровня жабр. Моторизованный микропозиционер закрепляется на основании винтами, а рычаг позиционера выравнивается над глазом. Партия стеклянных микропипеток вытягивается из силикатного стекла с внешним диаметром 1 mm, после чего кончики заполняются за счет капиллярного эффекта.

Поместив пипетки в виалу с 3 M раствором хлорида калия на несколько минут, остальную часть пипетки заполняют раствором соли вручную, после чего ее вставляют в держатель микроэлектрода, предварительно заполненный раствором для предотвращения образования пузырьков. Затем держатель электрода вставляют в головную часть внутриклеточного усилителя, закрепленного на микроманипуляторе. Участок сетчатки обнажают, осторожно вырезая крошечный квадратный фрагмент дорсальной части роговицы.

С помощью скальпеля на обнаженную ткань наносится капля раствора Рингера для предотвращения высыхания, после чего микропипетка перемещается к сетчатке. Когда кончик пипетки касается раствора, включается текущий режим инъекции внутриклеточного усилителя и измеряется импеданс электрода; микропипетки с импедансом вне диапазона от 20 до 70 mega ohms отбраковываются. Пипетки, импеданс которых находится в этом диапазоне, продвигаются в сетчатку микроскопическими шагами и вводятся в клетки путем электронной вибрации кончика; для введения в клетки используются световые стимулы, подаваемые через оптоволоконный кабель или видеодисплей.

В глазу рака-подковы могут встретиться три типа клеток: улярные клетки, эксцентрические клетки и пигментные клетки. Улярные клетки демонстрируют выраженный деполяризующий ответ на свет, эксцентрические клетки показывают серию потенциалов действия на фоне деполяризующего ответа, а пигментные клетки вообще не реагируют на свет. Ответ наблюдают на осциллографе и регистрируют на компьютере с помощью внутрисетчаточных записей. Таким образом можно изучить клеточную основу зрения.

В заключение мы продемонстрировали, как проводить регистрацию электроретинограммы, регистрацию сигналов зрительного нерва и интраретинальную регистрацию на живых экземплярах хелицид (in vivo). Эти методы широко используются и позволяют получить уникальные данные о нейронных механизмах обработки визуальной информации у хелицид. Они не только просты в применении в исследовательских лабораториях, но и могут быть легко внедрены в учебный курс по визуальной нейрофизиологии.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.