Большой Вставить экологического производства геномной библиотеки

Здравствуйте, я Маркус из лаборатории Стивена Хельма с кафедры микробиологии и иммунологии Университета Британской Колумбии. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру создания библиотеки с крупными вставками из образцов окружающей среды. В сегодняшней процедуре мне помогают Сан Ли, которая будет проводить упаковку фагов и инфицирование хозяина библиотеки E. coli, а также Элис Хоули и Чин Янг, которые займутся отбором колоний.

В нашей лаборатории мы используем данную процедуру для изучения структуры и метаболизма микробных сообществ в морских и наземных средах. Итак, приступим. Этот протокол создания фосмидной библиотеки ДНК выполняется после выделения и фрагментации геномной ДНК из образцов биомассы — процедур, которые подробно описаны в сопутствующих статьях JoVE.

Следующие несколько этапов включают подготовку ДНК SHE для лигирования в вектор SMID PCC one. Первым шагом является восстановление концов фрагментов ДНК SHE и их фосфорилирование. 5'-концы; все реагенты, необходимые для этого этапа, входят в комплект для создания библиотеки PCC one SMID от компании Epicentre. Для постановки реакции восстановления концов разморозьте все реагенты на льду, затем смешайте буфер для восстановления концов, dNTP, до 20 µg вставки ДНК SHE в концентрации 0.5 µg/µL, смесь ферментов и воду до достижения общего объема 80 µL. Кратковременно центрифугируйте пробирку, чтобы весь жидкий объем собрался на дне.

Инкубируйте смесь для восстановления концов при комнатной температуре от 45 минут до одного часа. Затем нагрейте смесь до 70 °C в течение 10 минут для инактивации ферментов. Во время инкубации для восстановления концов можно подготовить гель для следующего этапа.

При проведении пульс-гель-электрофореза (PFGE) ваша цель — изолировать молекулы ДНК размером от 30 до 60 kb. PFGE представляет собой электрофоретический метод разделения таких крупных фрагментов, которые сливаются при стандартном электрофорезе. Для начала приготовьте 1% гель, используя низкоплавящий агарозу в 150 мл 1X TAE рабочего буфера.

Выберите гребенки, которые позволят загрузить весь образец ДНК с восстановленными концами объемом 80 µL вместе с буфером для нанесения в одну или две лунки. Будьте особенно осторожны при работе с гелем, так как низкоплавящие агарозные гели очень легко ломаются в процессе затвердевания.

Подготовьте электрофорезную камеру. Налейте в камеру 2,2 литра 1X TAE буфера и включите аппарат для циркуляции рабочего буфера. Установите температуру охлаждающего устройства на 14 °C, а скорость насоса — на 70 RPM.

Добавьте также маркер PFG среднего диапазона от NEB. Чтобы не вырезать слишком высокую часть геля, выдавите немного agarose из шприца для геля и скальпелем срежьте небольшой фрагмент с конца. Поместите этот фрагмент перед лункой и запечатайте расплавленным agarose.

Перед нанесением образцов на гель убедитесь, что электрофоретический буфер остыл до 14 °C. В первую лунку нанесите 5 µL продукта рестрикции Lambda Hindi III от New England Biolabs. Во вторую лунку нанесите 1 µL маркера размеров Smid control, разведенного в 10 µL стерильной воды с добавлением буфера для нанесения.

Затем внесите смесь с восстановленными концами и инактивированным теплом белком, смешанную с буфером для нанесения образцов. Закройте крышку и настройте параметры прибора. Электрофорез будет проводиться в течение ночи или 12 часов.

После завершения электрофореза используйте краситель Cyber Gold для визуализации ДНК. Разведите Cyber Gold в 250 миллилитрах 1X TAE. Поместите гель в раствор и окрашивайте в течение одного часа в темноте, так как Cyber Gold чувствителен к свету. Пока гель окрашивается, подготовьте водяные бани при 70 °C и 45 °C для последующего этапа выделения ДНК из геля.

Следующий этап — вырезание и выделение фрагментов из геля. Очистите ДНК в нужном вам диапазоне размеров от 30 до 60 килобаз. Возьмите окрашенный гель, пустую промаркированную микроцентрифужную пробирку и стерильный скальпель, затем перенесите их на трансиллюминатор с синим светом.

Застелите трансиллюминатор пищевой пленкой, чтобы избежать перекрестного загрязнения геля. Наденьте защитные очки и включите синий свет. Теперь вы можете видеть восстановленную геномную ДНК и маркер размера контрольного фрагмента FO smid. С помощью скальпеля вырежьте полоску геля шириной от 5 до 7 мм, которая мигрировала на одном уровне и чуть выше маркера размера контрольного фрагмента smid.

Используйте маркер PFG в качестве верхней границы вашей фракции. Перенесите фракцию в пробирку с обрезанным кончиком. Фракции можно хранить при температуре -20 °C до одного года перед дальнейшим использованием.

Теперь приступаем к электрофорезу. Очистите ДНК из вырезанного фрагмента геля. Взвесьте пробирку с фрагментом геля и вычислите массу самого фрагмента, вычтя массу пустой пробирки.

Затем расплавьте фрагмент геля на водяной бане при 70 °C в течение 10–15 минут. После полного расплавления фрагмента геля быстро перенесите пробирку на водяную баню при 45 °C. Учитывайте, что один миллиграмм твердого геля после расплавления имеет объем один µL.

Добавьте одну единицу или один µL препарата фермента Jase на каждые 100 µL расплавленного aros. Инкубируйте при 45 °C в течение одного часа. Затем добавьте еще от двух до четырех µL les и повторно инкубируйте при 45 °C в течение одного часа.

Деактивируйте гель при 70 °C в течение 10 минут путем нагревания. После инактивации фермента поместите пробирку на лед на 10 минут, затем центрифугируйте на максимальной скорости 13 000 RPM в течение 15 минут для осаждения нерастворимых частиц.

Осторожно, не задевая осадок, удалите верхний супернатант, содержащий очищенную ДНК, и перенесите его в пробирку Falcon объемом 15 мл. Затем разбавьте его тремя миллилитрами стерильной воды, чтобы промыть и сконцентрировать ДНК.

Перенесите раствор из 15-мл пробирки Falcon в центрифужный фильтрующий блок Ancon Ultra four с мембраной Ultra Cell 10. Поместите фильтрующий блок в ротор с поворотными стаканами, используя 50-мл пробирку Falcon в качестве адаптера, и центрифугируйте при 4,000 ×g в течение шести-восьми минут. Центрифугируйте до тех пор, пока в фильтре не останется примерно 100–500 µL раствора.

Оставьте осадок на фильтре, а фильтрат удалите. Затем добавьте еще три миллилитра стерильной воды в пустую пробирку Falcon. Перенесите раствор в пробирку Амона и повторите этап центрифугирования.

Промойте пробирку Falcon в третий раз и уменьшите конечный объем жидкости, собранной с фильтра, до 50–100 µL. Не беспокойтесь о возможной потере образца. Фильтр удерживает 50 µL жидкости даже после длительного центрифугирования.

Перенесите оставшийся раствор ДНК из пробирки AmCon в предварительно промытый центрифужный фильтр-насадку MicroCon YM 50 и промойте пробирку AmCon дополнительными 50 µL стерильной воды, чтобы извлечь всю ДНК. Центрифугируйте фильтр-насадку MicroCon YM 50 в микроцентрифуге при 10 000 ×g до тех пор, пока фильтр не будет лишь слегка покрыт жидкостью. Проверяйте каждую минуту.

Если на фильтре осталось лишь небольшое количество жидкости, переверните фильтр и соберите раствор ДНК путем второго этапа центрифугирования при 1000 GS в течение трех минут в новую микроцентрифужную пробирку. Итоговый объем не должен превышать 10–15 µL.

В противном случае концентрация ДНК может оказаться слишком низкой для лигации. Проверьте концентрацию полученного раствора ДНК с помощью NanoDrop или анализа Pico Green. Восстановлено и исправлено.

Теперь ДНК готова к лигированию с клонирующим вектором PCC one FO SMID; для проведения лигирования разморозьте все реагенты на льду. Затем объедините их в указанном здесь порядке, перемешивая после каждого добавления. Сначала добавьте стерильную воду, чтобы общий объем реакции составил 10 µL.

Затем добавьте 10x буфер для лигирования FastLink, 10 мМ A-T-P-P-C-C, одну единицу вектора SMID и вставку в молярном соотношении 10:1. В завершение добавьте ДНК-лигазу FastLink. Кратковременно центрифугируйте пробирку, чтобы собрать всю жидкость на дне.

Постучите по пробирке и снова центрифугируйте. Инкубируйте реакционную смесь для лигирования при комнатной температуре в течение двух часов, затем инактивируйте фермент при 70 °C в течение 10 минут. На этом этапе реакционную смесь для лигирования можно либо хранить при −20 °C, либо приступить к этапу упаковки фага.

Следующим этапом является получение бактериофагов, которые будут использоваться для введения вашей библиотеки FO SMID в e coli. За два или три дня до планируемого этапа упаковки фагов проведите посев предоставленного резистентного штамма для пластирования EPI 300 T1 на обычный чашку с LB-агаром и инкубируйте в течение ночи при 37 °C для получения одиночных колоний. Эту чашку можно герметизировать и хранить при 4 °C для последующего использования. За день до проведения реакций упаковки инокулируйте 50 мл LB-бульона с добавлением 10 мМ сульфата магния одной колонией с чашки с Epi 300. Инкубируйте в течение ночи при 37 °C и перемешивании со скоростью 225 RPM.

В день проведения реакций упаковки инокулируйте свежий бульон LB объемом 50 миллилитров с добавлением 10 миллимолярного сульфата магния пятью миллилитрами ночной культуры. Культивируйте бактерии при 37 градусах Цельсия до достижения OD 600 от 0,8 до 1,0. Не превышайте значение OD 600 равное 1,0.

Разбавьте образец перед измерением на спектрофотометре, чтобы получить точный результат. Храните на льду или при температуре 4 °C до начала работы или в течение 72 часов. Теперь, когда бактерии готовы к инфицированию, следует подготовить разморозку фагов.

Экстракты max plaques Lambda Packaging размораживают на льду. При использовании одной пробирки для каждой реакции лигирования размораживание займет примерно 10–15 минут. Тем временем снова охладите на льду пустую пробирку объемом 1,5 миллилитра, используя одну пробирку на каждую реакцию.

После размораживания экстрактов для упаковки Lambda немедленно перенесите по 25 µL каждого экстракта в предварительно охлажденные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и поместите их на лед. Остатки экстракта для упаковки верните при температуре -80 °C. Слишком длительное пребывание размороженных экстрактов для упаковки на льду снизит эффективность инфицирования.

Затем добавьте 10 µL смеси для лигирования к каждой порции размороженных экстрактов объемом 25 µL на льду, перемешивая раствор путем нескольких раз pipetting, не допуская образования пузырьков воздуха. Кратковременно центрифугируйте пробы, чтобы собрать всю жидкость на дне пробирок, и инкубируйте смеси для упаковки в водяной бане при 30 °C в течение 90 минут. Через 80 минут инкубации разморозьте оставшийся экстракт для упаковки на льду.

По завершении 90-минутной реакции упаковки добавьте оставшиеся 25 µL экстракта упаковки в каждую пробирку с реакционной смесью. Инкубируйте реакции еще 90 минут при 30 °C. После второй инкубации добавьте в каждую пробирку для упаковки по 100 µL подготовленного буфера для разведения фагов, осторожно перемешайте и добавьте по 5 µL хлороформа в каждую пробирку.

Теперь общий объем в пробирке должен составлять 165 µL. После добавления хлороформа может образоваться вязкий осадок. При пипетировании частиц фага избегайте попадания этого осадка, а также органической фазы хлороформа.

На данном этапе, при необходимости, упакованные частицы фага можно хранить при температуре four degrees в течение нескольких дней, однако для достижения наилучших результатов рекомендуется использовать свежеприготовленный фаг. Теперь можно приступить к инфицированию фагом клеток-хозяев, которые вы выращивали на протяжении всех этапов упаковки фага. Добавьте упакованный фаг к резистентным клеткам-хозяевам EPI 300 T one с OD 600.8–1.0 в соотношении 400 µL резистентных клеток EPI 300 T one на каждые 10 µL частиц фага.

Чтобы избежать попадания хлороформа со дна пробирки с упакованными фагами, мы берем 125 µL частиц упакованного фага и 5 mL подготовленных устойчивых клеток-хозяев epi 300 T one, осторожно перемешиваем их, а затем инкубируем при 37 °C в течение 30 минут. Следующим шагом является определение титра упакованного фага. Для этого инфицированные бактерии высевают на среду для селекции инфицированных клеток.

Затем подсчитайте количество образовавшихся колоний и разделите его на объем фага, добавленного к бактериям, которые вы высеяли. Вектор C one SMID содержит ген устойчивости к хлорамфениколу. Поэтому для селекции инфицированных клонов высейте бактерии на чашки с LB-средой, содержащей хлорамфеникол.

Рассейте дважды по 50 µL и дважды по 10 µL клеток штамма EPI 300 T one, резистентных к фагу, на четыре отдельные чашки, после чего поместите чашки в перевернутом виде в инкубатор при 37 °C на период от 16 до 24 часов (но не более 48 часов) до образования колоний. Тем временем соберите остаток резистентных клеток EPI 300 T one из 5 mL инфекционной смеси путем центрифугирования при 3 500 ×g в течение 10 минут при 4 °C. Супернатант удалите.

Добавьте 1 mL среды LB с 20% глицерином в пробирку для ресуспензии. Ресуспендируйте осадок клеток и разлейте по 100 µL в криопробирки объемом 2 mL; немедленно заморозьте и храните при -80 °C. Для последующего использования на этапе отбора колоний на следующий день подсчитайте количество клонов на четырех чашках в инкубаторе при 37 °C и определите титр упакованного фага, который будет использоваться на следующем этапе.

Замороженный глицериновый сток клеток EPI 300 T one содержит клетки, трансдуцированные всеми различными плазмидами из вашей библиотеки. Далее высейте соответствующее количество клеток, исходя из вирусного титра и размера чашки, для каждого образца. Клонирование проводят на квадратных чашках размером 45 на 45 мм.

Чашки с LB-агаром и хлорамфениколом для биоанализа с использованием стеклянных шариков. Также добавьте на чашку небольшое количество LB-бульона, чтобы равномерно распределить клетки. Имейте в виду, что при приготовлении глицеринового стока концентрация ваших клеток дополнительно увеличивается примерно в пять раз.

Инкубируйте при 37 °C в течение 24 часов. В дни отбора колоний подготовьте 96- или 384-луночные планшеты, заполнив каждую лунку 200 µL или 70 µL бульона LB, дополненного 12,5 µg/mL хлорамфеникола для антибиотического отбора и 10% глицерином для замораживания. Для этого этапа мы используем автоматическую систему наполнения планшетов qfi three.

Следующим этапом является перенос колоний с подготовленных чашек с LB-агаром с ХЛОРАМФЕНИКОЛОМ в подготовленные 96- или 384-луночные планшеты для последующего замораживания. Для этого шага, согласно руководству пользователя, мы используем робот для пикирования клонов qix two, чтобы создать стерильную среду вокруг зоны забора клонов. Включите УФ-лампу на 30 минут; выполняйте последующие действия, пока она включена.

Приготовьте 500 миллилитров 1% раствора гипохлорита натрия, 500 миллилитров стерильной деионизированной воды и 500 миллилитров 80% этанола. После выключения УФ-лампы заполните кюветы в соответствии с маркировкой, двигаясь от задней к передней. В соответствующие кюветы налейте 1% раствор гипохлорита натрия, затем автоклавированную деионизированную воду, а в переднюю кювету — 80% этанол.

Убедитесь, что они заполнены, так как иглы для отбора невозможно качественно промыть без достаточного количества промывочного раствора. После настройки параметров для оптимального отбора снимите крышки с чашек с бактериальными культурами и с 96- или 384-луночных планшетов, заполненных средой LB, и поместите их между стойками в Q picks. Планшеты в рабочей зоне должны плотно прилегать к переднему правому углу, чтобы исключить их смещение в процессе отбора.

Затем закройте переднюю панель. После установки всех параметров можно приступать к процедуре отбора. По завершении всего отбора промойте щетки и кюветы деионизированной водой и оставьте их на столе до высыхания.

Уберите все возможные пролитые вещества и протрите внутреннюю часть CICS 80% ethanol. Убедитесь, что все чашки с глицериновыми стоками промаркированы, и поместите их в инкубатор при 37 degrees Celsius на 24 часа для выращивания культуры из каждой отобранной колонии. Оставьте на инкубаторе записку с указанием даты, количества инкубируемых чашек, времени начала инкубации, времени извлечения и ваших инициалов.

После инкубации вы получите библиотеку. В каждой лунке находится культура одного бактериального клона, содержащего PCC one fo smid, лигированный с одним фрагментом расщепленной ДНК из вашего исходного образца. Заморозьте планшеты при температуре -80 °C для длительного хранения и поздравьте себя с успешно выполненной работой.

В представленном протоколе описывается процедура создания экологической библиотеки smid для захвата генетического содержимого микробного сообщества в данной среде обитания. Данный протокол позволяет создать библиотеку SMID, репрезентативную генетическому содержимому исследуемой среды, и дает возможность оптимизировать критические этапы, если количество полученных в конце всей процедуры клонов FO smid окажется слишком низким.

Мы только что продемонстрировали вам, как сконструировать библиотеку FO SMID из геномной ДНК, выделенной из пробы морской воды. При выполнении данной процедуры важно использовать высококачественную геномную ДНК. Подготовьте все планшеты и реагенты перед началом работы и выделите достаточное количество времени для этого многоэтапного процесса.

На этом все. Спасибо за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.