Большой Вставить экологического производства геномной библиотеки

Здравствуйте, я Маркус из лаборатории Стивена Хелма на факультете микробиологии и иммунологии Университета Британской Колумбии. Сегодня мы покажем вам процедуру построения большой вставки экологической библиотеки. В сегодняшней процедуре мне помогает Сан Ли, который будет выполнять упаковку фагов и заражение библиотечного хозяина кишечной палочкой, а также Элиза Хоули и Чин Янг, которые будут выполнять сбор колоний.

В нашей лаборатории используется эта процедура для изучения структуры микробиосообщества и метаболизма в морской и наземной среде. Итак, приступим. Этот протокол для создания библиотеки ДНК начинается после процедуры выделения и среза геномной ДНК из образцов биомассы, которые мы подробно описали в сопроводительных статьях.

Следующие несколько этапов подготавливают ДНК SHE к лигированию в ДНК вектора SMID PCC. Первым шагом является восстановление концов СТЭ кусочков ДНК и фосфорилат. Пять основных концов, все реагенты, необходимые для этого этапа, включены в производственный набор PCC одной библиотеки SMID от эпицентра для настройки реакции конца, размораживания всех реагентов на льду, затем объединения буфера восстановления конца DNTP, смешивания TP до 20 микрограммов вставки ДНК в 0,5 микрограмма на микролитр смеси ферментов и воды Для достижения 80 микролитров кратко центрифугируйте пробирку, чтобы вся жидкость попала в дно.

Инкубируйте торцевую реакцию при комнатной температуре от 45 минут до часа. Затем нагрейте, он инактивирует ферменты при температуре 70 градусов Цельсия на 10 минут. Во время окончательной ремонтной инкубации вы можете подготовить гель для следующего этапа.

Гель-электрофорез с импульсным полем или PFGE, ваша цель - выделить молекулы ДНК в диапазоне от 30 до 60. Килооснования PFGE — это электрофоретический метод для расчленения этих крупных фрагментов, которые объединяются во время стандартного электрофореза. Для начала приготовьте 1%-ный гель с использованием низкоплавких аров в 150 миллилитрах одного рабочего буфера XTAE.

Выбирайте гребни, которые позволят вам загрузить весь 80 микролитров образца ДНК восстановления конца плюс буфер загрузки в одну или две лунки. Будьте особенно осторожны с гелем в качестве малоплавких агро гелей. Очень легко разламывать, пока гель застывает.

Подготовьте камеру электрофореза. Добавьте в камеру 2,2 литра одного XTAE и и включите машину для циркуляции работающего буфера. Установите охлаждающее устройство на 14 градусов Цельсия и установите насос на 70 оборотов в минуту.

Включите маркер среднего уровня с одним PFG также от NEB. Чтобы не порезать гель слишком высоко, выдавите арош из гелевого шприца и разрежьте скальпелем маленькую пробку с конца. Поместите пробку в переднюю часть колодца и загерметизируйте ее расплавленным аросом.

Перед загрузкой геля убедитесь, что буфер для работы охладился до 14 градусов по Цельсию. В первую скважину загружают пять микролитров New England Biolabs Lambda Hindi три диверса. Во вторую скважину загружают один микролитр маркера контрольного размера Smid, разведенный в 10 микролитрах стерильной воды плюс загрузочный буфер.

Затем загрузите отремонтированную и нагретую неактивированную смесь плюс буфер для загрузки. Закройте крышку и запрограммируйте машину. Гель будет действовать в течение ночи или 12 часов.

Когда гель закончит течь, используйте пятно для кибер-золота, чтобы визуализировать, как ДНК разбавляет кибер-золото. В 250 миллилитрах одного XTAE поместите свой гель в раствор и окрашивайте в течение одного часа в темноте киберг золото светочувствительно, пока гель окрашивается. Приготовьте водяную баню при температуре 70 градусов Цельсия и одну F 45 градусов Цельсия для следующего этапа экстракции геля.

Следующий шаг – акциз и гелеобразный. Очистите ДНК в желаемом диапазоне размеров от 30 до 60 килооснований. Возьмите испачканный гель вместе с пустой разорванной и помеченной пробиркой для микроуловок и стерильным скальпелем к транслюминатору синего света.

Накройте транслюминатор полиэтиленовой пленкой, чтобы избежать перекрестного загрязнения геля. Закройте очки для просмотра и включите синий свет. Теперь вы можете увидеть свой конец восстановленной геномной ДНК и маркер контрольного размера FO smid С помощью скальпеля вырежьте гелевый ломтик шириной от пяти до семи миллиметров, который мигрировал с маркером контрольного размера smid и немного выше него.

Используйте маркер PFG в качестве верхней границы для среза. Переложите ломтик в разорванную трубку. Вы можете хранить ломтики при температуре минус 20 градусов Цельсия до одного года, прежде чем продолжить.

Теперь пришло время склеивать. Очистите свой срез от ДНК. Взвесьте тюбик с гелевым ломтиком и рассчитайте вес среза, вычтя вес разрыва.

Далее растопите ломтик на водяной бане при температуре 70 градусов Цельсия в течение 10 – 15 минут. После того как гелевый ломтик полностью растает, быстро перенесите тюбик на водяную баню при температуре 45 градусов Цельсия. Имея в виду, что один миллиграмм твердого геля имеет объем в один микролитр после плавления.

Добавьте одну единицу или один микролитр ферментного препарата Jase на 100 микролитров расплавленного препарата. Выдерживать при температуре 45 градусов Цельсия в течение одного часа. Затем добавьте еще два-четыре микролитра леса и выдерживайте при температуре 45 градусов Цельсия еще один час тепла.

Инактивируйте гель при температуре 70 градусов Цельсия в течение 10 минут после нагревания. Инактивировав фермент, помещают пробирку на лед на 10 минут, после чего центрифугируют на максимальной скорости. 13 000 об/мин в течение 15 минут для удаления любых нерастворимых частиц.

Будьте осторожны, чтобы не потревожить гранулу. Удалите верхний надосадочный ток, содержащий очищенную ДНК, и перенесите его в 15-миллилитровую соколиную пробирку. Затем промойте его тремя миллилитрами стерильной воды, чтобы промыть и сконцентрировать ДНК.

Переведите раствор из 15-миллилитровой пробирки Falcon в четырехцентробежный фильтрующий блок Ancon Ultra с мембраной Ultra Cell 10. Поместите фильтрующий блок в качающийся ротор ведра, используя 50-миллилитровую трубку Falcon в качестве адаптера, и вращайте при давлении 4000 GS в течение шести-восьми минут. Центрифугируйте примерно до 100-500 микролитров раствора.

Оставайтесь на фильтре и отбрасывайте сквозной поток. Затем добавьте в пустую трубку сокола еще три миллилитра стерильной воды. Переложите раствор в пробирку Амона и повторите этап центрифугирования.

Промойте трубку сокола в третий раз и уменьшите итоговый объем, собранный на фильтре, до 50 – 100 микролитров. Вам не нужно беспокоиться о потере образца. Фильтр будет удерживать 50 микролитров жидкости даже после длительного центрифугирования.

Перелейте оставшийся раствор ДНК из пробирки AmCon в предварительно промытый центробежный фильтрующий блок MicroCon YM 50 и промойте пробирку Amon еще 50 микролитрами стерильной воды, чтобы восстановить всю ДНК-центрифугу. Центробежный фильтрующий блок MicroCon YM 50 в микроцентрифуге при давлении 10 000 GS до тех пор, пока фильтр не станет еще слегка покрытым жидкостью. Проверяйте каждую минуту.

Если на фильтре осталось лишь небольшое количество жидкости. Переверните фильтр вверх дном и восстановите раствор ДНК путем второго этапа центрифугирования при давлении 1000 GS в течение трех минут в свежей микроцентрифужной пробирке. Полученный объем не должен превышать от 10 до 15 микролитров в общей сложности.

В противном случае ваша ДНК может быть слишком разбавлена для лигирования. Проверьте концентрацию полученного раствора ДНК с помощью NanoDrop или Pico Green Assay. Восстановлен и отремонтирован.

Теперь ДНК готова к лигированию к PCC одному вектору клонирования FO SMID для лигирования, размораживания всех реагентов на льду. Затем соедините в указанном здесь порядке, перемешивая после каждого добавления. Сначала добавьте стерильную воду до достижения реакционного объема 10 микролитров.

Затем 10 x буфер для лигирования быстрого звена, 10 миллимоляров A-T-P-P-C-C один вектор SMID и вставка в соотношении 10 к одному моляру. И, наконец, быстрая линка DNA Ligase. Кратковременно центрифугируйте пробирку, чтобы вся жидкость опустилась на дно.

Постучите по трубке и снова вращайте. Инкубируйте реакцию лигирования при комнатной температуре в течение двух часов и нагревайте инактивацию фермента в течение 10 минут при температуре 70 градусов Цельсия. На этом этапе вы можете либо хранить реакцию лигирования при температуре минус 20 градусов Цельсия, либо перейти к этапу упаковки фагов.

Следующим шагом является создание бактериальных фагов, которые будут функционировать для введения вашей библиотеки FO SMID в кишечную палочку за два или три дня до того, как вы планируете сделать этап упаковки фагов, выделить предоставленный EPI 300 T одноустойчивый штамм покрытия на простую пластину LB и инкубировать в течение ночи при температуре от 37 до градусов Цельсия для получения одиночных колоний. Вы можете запечатать эту пластину и хранить ее при температуре четыре градуса Цельсия для дальнейшего использования. За день до реакции упаковки инокулируйте 50 миллилитров бульона Альби плюс 10 миллимолярных сульфатов магния одной колонией из вашей пластины Epi 300 Встряхните при 225 об/мин и 37 градусах Цельсия в течение ночи.

В день реакции упаковки инокулируют свежим 50 миллилитровым бульоном LB плюс 10 миллимолярного сульфата магния пятью миллилитрами ночной культуры. Культивируя бактерии при температуре 37 градусов Цельсия при наружном диаметре 600 от 0,8 до 1,0. Не превышайте наружный диаметр 600 от 1,0.

Разбавьте образец перед измерением на спектрофотометре, чтобы получить точный результат. Хранить на льду или при температуре четыре градуса Цельсия, пока вы не будете готовы продолжить, или до 72 часов. Теперь, когда бактерии готовы к заражению, пришло время подготовить фаговую разморозку.

Максимальное количество бляшек Lambda Packaging вытягивает на льду. При использовании одной пробирки на реакцию лигирования размораживание займет от 10 до 15 минут. Тем временем снова охладите пустую 1,5-миллилитровую пробирку на льду, используя одну пробирку за реакцию.

Как только экстракты упаковки Lambda оттают, немедленно переложите по 25 микролитров каждого упаковочного экстракта в предварительно охлажденную 1,5-миллилитровую микропробирку и положите на лед. Верните оставшийся экстракт упаковки при температуре минус 80 градусов Цельсия. Если оставить оттаявшие экстракты упаковки на льду слишком долго, эффективность инфекции снизится.

Далее в каждые 25 микролитров размороженных на льду экстрактов добавляют 25 микролитров реакции лигирования, перемешанных пипетированием раствора несколько раз без введения пузырьков воздуха. Кратковременно центрифугируйте для консолидации всей жидкости на дне пробирок и инкубируйте упаковочные реакции на водяной бане при температуре 30 градусов Цельсия в течение 90 минут. После 80 минут инкубации разморозьте остатки упаковки экстракта на льду.

После завершения 90-минутной реакции упаковки добавьте оставшиеся 25 микролитров упаковочного экстракта в каждую реакционную пробирку. Инкубируйте реакции еще 90 минут при температуре 30 градусов Цельсия. После второй инкубации добавьте по 100 микролитров приготовленного буфера для разведения фагов в каждую упаковочную пробирку и аккуратно перемешайте, добавьте в каждую пробирку по пять микролитров хлороформа.

Теперь у вас должен получиться общий объем 165 микролитров в тюбике. После выделения хлороформа может образоваться вязкий осадок. Избегайте этого осадка, а также органической хлороформной фазы при пипетировании фаговых частиц

На этом этапе вы можете хранить упакованные фаговые частицы при температуре четыре градуса в течение нескольких дней, если это необходимо, но для достижения наилучших результатов используйте свежеприготовленный фаг. Теперь вы готовы заразить клетки-хозяева, которые вы выращивали на всех этапах упаковки фагов с помощью упакованного фага. Добавьте упакованный фаг к EPI 300 T one resistant host cells OD 600,8 to 1,0 в соотношении 400 микролитров эпи 300 T one резистентных клеток на каждые 10 микролитров фаговых частиц.

Чтобы избежать пипетирования хлороформа со дна пробирки упакованного фага, мы используем 125 микролитров упакованных фаговых частиц и пять миллилитров приготовленных эпи 300 Т однорезистентных клеток хозяина, которые аккуратно перемешивают, а затем инкубируют при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут. Следующим этапом является определение титра упакованного фага. Вы делаете это, помещая инфицированные бактерии в среду для выбора инфицированных клеток.

Затем подсчитайте полученные колонии и разделите на объем фага, добавленного к бактериям, которые вы нанесли. Cone SMID содержит ген устойчивости к хлорамфениколу. Таким образом, для отбора инфицированных клонов бактерии должны быть вытеснены на пластины, содержащие хлорамфеникол

Распределите два раза по 50 микролитров и два раза по 10 микролитров зараженные фагом EPI 300 T однорезистентные клетки на четыре отдельные пластины и поместите пластины вверх дном в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на 16-24 часа, не более чем на 48 часов, пока не сформируются колонии. Тем временем соберите остаточные устойчивые к EPI 300 T клетки из пятимиллилитровой инфекции путем центрифугирования при 3500 GS в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость.

Добавьте один миллилитр LB с 20% глицерином в резонатор пробирки. Суспензируйте клеточную гранулу и измельчите по 100 микролитров каждая в двухмиллилитровые криопробирки, заморозьте сразу и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия. Для дальнейшего использования на этапе сбора колонии на следующий день подсчитайте количество клонов на четырех планшетах в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия и определите титр упакованного фага, который вы используете на следующем этапе.

Замороженный глицериновый запас EPI 300 T с одним сопротивлением содержит клетки, трансдуцированные всеми различными плазмидами в вашей библиотеке. Затем распределите соответствующее количество в зависимости от титра вируса и размера пластины каждой частицы. Клонировать на 2 45 на 2 45 миллиметров квадратным.

Биопробные планшеты LB с хлорамфениколом с использованием стеклянных шариков. Также добавьте в тарелку небольшое количество бульона LB, чтобы равномерно распределить клетки. Имейте в виду, что приготовление запасов глицерина дополнительно концентрирует ваши клетки примерно в пять раз.

Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов в дни сбора колонии, приготовьте 96 или 3 84 луночных планшета, заполненных 200 микролитрами или 70 микролитрами на лунку LB бульона. Дополнен 12,5 мкг хлорамфеникола на миллилитр бульона для выбора антибиотика и 10% глицерина для замораживания. Для этого этапа мы используем автоматизированную систему заполнения трех пластин qfi.

Следующим шагом является отбор колоний из подготовленных пластин LB CHLORAMPHENICOL в подготовленные 96 или 3 84 луночные планшеты для замораживания. На этом этапе мы используем робота для сбора клонов qix two, в соответствии с руководством пользователя, для создания стерильной среды вокруг зоны сбора клонов. Включите ультрафиолетовую лампу на 30 минут, пока она включена.

Приготовьте 500 миллилитров 1%-ной отбеливателя, 500 миллилитров стерильной деионизированной воды и 500 миллилитров 80%-ного этанола. Когда УФ-излучение погаснет, заполните лотки в соответствии с маркировкой сзади наперед. Залейте в передний лоток 1% отбеливателя, затем автоклавную деионизированную воду и 80% этанола.

Убедитесь, что они заполнены, так как иглы для сбора нельзя мыть должным образом без достаточного количества моющего раствора. После настройки параметров для оптимального отбора снимите крышки с бактериальных планшетов и заполненных 96 или 3 84 луночных планшетов LB и расположите их между стойками в Q пиках. Пластины рабочей зоны должны быть плотно прилегать к переднему правому углу, чтобы они не могли смещаться во время захвата.

Затем закройте переднюю панель. После того, как все параметры заданы, можно приступать к процедуре комплектации. Когда все сборы будут завершены, промойте щетки и лотки деионизированной водой и поставьте на стол для просушки.

Уберите все разливы, которые могли произойти, и протрите внутреннюю часть CICS 80% этанолом. Убедитесь, что все глицериновые пластины промаркированы и поместите их в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на 24 часа, чтобы вырастить культуру из каждой выбранной колонии. Оставьте на инкубаторе заметку, в которой указана дата, количество инкубированных планшетов, время инкубации, время извлечения и ваши инициалы.

После инкубации у вас есть библиотека. Каждая лунка содержит культуру одного бактериального клона, содержащего PCC, одну из сред лигированную до одного участка чистой ДНК из исходного образца. Заморозьте тарелки при температуре минус 80 градусов по Цельсию для длительного хранения и поздравьте себя с хорошо выполненной работой.

Представленный протокол описывает процедуру создания экологической библиотеки smid для фиксации генетического содержимого микробного сообщества в данной среде обитания. Этот протокол должен создать библиотеку SMID, которая является репрезентативной для генетического содержимого выборочной среды и должна позволить читателю оптимизировать критические шаги. Если количество полученных клонов FO smid в конце всей процедуры слишком мало.

Мы только что показали вам, как построить библиотеку FO SMID из геномной ДНК, полученной из образца морской воды. При проведении этой процедуры важно начать с геномной ДНК высокого качества. Перед началом работы подготовьте все планшеты и реагенты и запланируйте достаточно времени для этого многоэтапного процесса.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.