Antifouling самоорганизующихся монослоев на микроэлектродов для структурирования биомолекул

Эта процедура начинается с изготовления микроэлектрода на силиконовой подложке. Над микроэлектродом и подложкой формируется самоорганизующийся монослой полиэтиленгликоля для предотвращения загрязнения микротрубочек. Затем подготавливаются меченые рубцом микротрубочки.

Наконец, микротрубочки наносятся на электроды с помощью электрофореза. Здравствуйте, я Джон Ноэль из лаборатории Нана на факультете физики и из лаборатории молекулярной биомеханики на факультете биомедицинской инженерии в Техасском университете. Я Уилл Фри Теза с физического факультета и директор Центра навыков науки и технологий в Техасском университете.

Меня зовут Хуан Куанг, я директор Лаборатории молекулярной биомеханики в Техасском университете и на факультете биомедицинской инженерии. Сегодня мы покажем вам процедуру изготовления микроэлектродов, покрытых незагрязняющим самоорганизующимся монослоем. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения микротрубок с помощью электрофореза.

Итак, приступим. Для начала используйте писец или резак для вафель, чтобы разрезать силиконовые пластины на кусочки размером один сантиметр на 1,5 сантиметра для использования в качестве подложки. Теперь очистите подложку, поместив ее в стакан с достаточным количеством ацетона, чтобы покрыть их, и обрабатывайте ультразвуком в течение пяти минут, не давая основанию высохнуть.

Промойте их в свежем ацетоне, а затем сразу же промойте снова в изопропаноле и используйте азот для сушки. Используя стандартную фотолитографию с положительным тоном или электронно-лучевую литографию, изготовьте золотые микроэлектроды на чистых подложках. При проектировании геометрии шаблона следите за тем, чтобы диаметр каждого электрода не превышал 100 микрон Чтобы обеспечить покрытие самоорганизующимся монослоем полиэтиленгликоля trimeth oxy seline или штифтом Sam, включите контактные площадки, расположенные на расстоянии от 300 до 500 микрометров от шаблона, с линией в один миллиметр, соединяющей прокладку с электродом.

После создания рисунка в слое резиста с помощью пинцета процарапайте линию на резисте от контактной площадки до края подложки. При осаждении металла царапина допускает электрический контакт между электродом и краем подложки. Для нанесения слоя металла используется камера осаждения, предпочтительно с двумя источниками.

Электроды формируются путем осаждения двух нанометров хрома, за которым следует шесть нанометров золота Без нарушения вакуума для измерения толщины пленок во время осаждения можно использовать кварцевые кристаллические микровесы, установленные внутри камеры. Теперь можно приступать к подготовке самостоятельно собранного монослоя в хорошо проветриваемом помещении, разогреваем и духовке до 75 градусов Цельсия. Приготовьте раствор, добавив один миллилитр колышка селина на 20 миллилитров толуола в стеклянный стакан объемом 250 миллилитров.

Хорошо перемешайте, делая пипетку вверх и вниз от пяти до 10 раз, а затем помешивая пипеткой в течение 30 секунд. Поместите образцы узора в узор стакана стороной вверх, убедившись, что они полностью погружены в раствор и равномерно распределены по дну стакана. Поместите стакан в духовку и запекайте его от 18 до 21 часа, пока Сэм формируется.

Подготовьте противоэлектрод, нанеся один нанометр хрома, а затем четыре нанометра золота на стеклянную крышку размером 22 на 50 миллиметров. Противоэлектрод должен быть почти прозрачным со светло-серым или розовым оттенком. Храните покрытый противоэлектродом стороной вверх в чашке Петри, чтобы поддерживать ее в чистоте.

После 18-21 часа в духовке достаньте стакан из духовки. Толуол должен был испариться, оставив образцы рисунка в вязком остатке колышка. Добавьте в стакан 20 миллилитров толуола и замочите образцы на одну-две минуты.

Извлеките образцы из стакана и промойте их толуолом, затем изопропанолом и, наконец, высушите азотом. На этом этапе образцы должны выглядеть чистыми, а слой Сэма должен быть невидимым невооруженным глазом. Приготовленные таким образом Sam's можно использовать до двух дней при хранении в прохладных сухих условиях.

Неудачное образование Sam приводит к появлению мутного или неравномерного оттенка остатков на поверхности. Теперь, когда Sams подготовился, мы можем начать полимеризацию тубулина в микротрубочки. Начните с размораживания немеченого тубулина и r доминного тубулина, и немедленно объедините их в соотношении два к одному, немеченые к меченым, чтобы получить яркие микротрубочки.

Хорошо перемешайте их, несколько раз перемешав пипеткой вверх и вниз. Затем полимеризуйте тубулин в течение 20-40 минут на водяной бане, нагретой при температуре 37 градусов Цельсия, пока тубулин полимеризуется. Приготовьте трубчатый буфер Таксол, смешав 20 микромоляров Таксола с трубочным буфером.

Хорошо перемешайте, несколько раз передавая пипеткой вверх и вниз и вортексом, а затем поместите трубку в нагретую ванну при температуре 37 градусов Цельсия. После полимеризации разведите микротрубочки в теплом буфере Таксол и защитите их от света. Убедитесь, что полимеризация микротрубочек прошла успешно и что микротрубочки стабильны при возбуждении флуоресценции в течение нескольких минут.

Путем визуализации подготовленных микротрубочек с кислородной продуцирующей смесью с полимеризацией тубулина в микротрубочки в полном составе. Давайте начнем моделирование MTS с помощью электрофореза. Для начала разрежьте кусок двустороннего скотча на тонкие полоски, поместив его на предметное стекло и с помощью лезвия бритвы разрежьте две полоски двустороннего скотча поперек образца с узорчатым покрытием Sam таким образом, чтобы электрод находился между полосками, а соединительная дорожка проходила перпендикулярно ленте.

Поместите противоэлектрод на двустороннюю ленту так, чтобы металлическая сторона соприкасалась с лентой так, чтобы край образца нависал над противоэлектродом примерно на три миллиметра. Отрежьте несколько отрезков по 15 сантиметров изолированного медного магнитного провода и снимите по одному сантиметру изоляции с обоих концов. Используйте небольшую каплю серебряной краски, чтобы прикрепить провод к открытому золотому участку подложки, стараясь при этом избегать электрического контакта с противоэлектродом.

Теперь с помощью серебряной краски прикрепите второй провод к стойке. Электродные провода, прикрепленные серебряной краской, могут быть дополнительно прикреплены к образцам с помощью скотча. Затем с помощью пипетки введите микротрубочки с желаемым изображением разбавления при 20-кратном увеличении и найдите рисунок на кремниевой пластине перед подачей напряжения.

Из-за глубины проточной камеры могут потребоваться объективы с большим рабочим расстоянием для отображения верхней поверхности проточной камеры. Расстояние от поверхности образца до верхней поверхности проточной камеры определяется толщиной ленты и должно составлять от 60 до 100 микрометров. Подайте напряжение до одного вольта и понаблюдайте за миграцией микротрубочек.

Если желателен обратимый захват микротрубочек. Используйте лак для ногтей, чтобы герметизировать проточную камеру, чтобы предотвратить боковой дрейф, и используйте более низкое напряжение примерно до 0,5 вольт. Миграцию можно отследить путем регулировки вертикальной плоскости фокуса микроскопа при приложенном напряжении от 0,9 до 1,2 вольт, которые микротрубочки локализуются на электродных поверхностях.

Более высокое напряжение ускорит миграцию и усилит адгезию, но чрезмерное напряжение вызовет электролиз и деполимеризацию. Микротрубочки, мы только что показали вам, как подготовить микроэлектроды с покрытием Sam для моделирования МТ, потому что покрытие SAM предотвращает поглощение микротрубок на микроэлектродах. Эта процедура также может быть использована для обратимого структурирования микротрубочек.

Кроме того, этот процесс не ограничивается только микротрубочками, но также может быть использован для моделирования биомолекул в целом. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.