Antifouling самоорганизующихся монослоев на микроэлектродов для структурирования биомолекул

Данная процедура начинается с изготовления микроэлектрода на силиконовой подложке. На микроэлектроде и подложке формируется самоорганизующийся монослой полиэтиленгликоля для предотвращения адсорбции микротрубочек. Затем подготавливаются микротрубочки, меченные рубином.

Наконец, микротрубочки наносятся на модифицированные электроды с помощью электрофореза. Здравствуйте, я Джон Ноэль из лаборатории Нана факультета физики и из лаборатории молекулярной биомеханики факультета биомедицинской инженерии Техасского университета A&M. Я Уилфрид Теза с факультета физики и директор Центра науки и технологий в области навыков Техасского университета A&M.

Меня зовут Хуан Куанг, я директор Лаборатории молекулярной биомеханики кафедры биомедицинской инженерии Техасского университета A&M. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру изготовления микроэлектродов с покрытием из антифоулингового самоорганизующегося монослоя. В нашей лаборатории мы используем этот метод для изучения электрофоретического перемещения микротрубочек.

Итак, приступим. Для начала с помощью scribera или резака для пластин разрежьте кремниевые пластины на фрагменты размером 1 см на 1,5 см, которые будут использоваться в качестве подложек. Затем очистите подложки, поместив их в стакан с достаточным количеством ацетона, чтобы полностью покрыть их, и обработайте ультразвуком в течение пяти минут, не допуская высыхания подложек.

Промойте их в свежем ацетоне, затем сразу же повторно промойте в изопропаноле и высушите потоком азота. С помощью стандартной фотолитографии с позитивным тоном или электронно-лучевой литографии нанесите золотые микроэлектроды на чистые подложки. При проектировании геометрии рисунка поддерживайте диаметр каждого электрода в пределах 100 микрон. Для обеспечения покрытия самоорганизующимся монослоем полиэтиленгликоль-триметоксисилана (peg Sam) предусмотрите контактные площадки, расположенные на расстоянии 300–500 микрометров от рисунка, с соединяющей площадку и электрод линией шириной один миллиметр.

После формирования рисунка в слое резиста с помощью пинцета процарапайте линию в резисте от контактной площадки до края подложки. При напылении металла эта царапина обеспечит электрический контакт между электродом и краем подложки. Для осаждения металлического слоя используется камера напыления, предпочтительно с двумя источниками.

Электроды формируют путем осаждения 2 nm хрома, за которым следует осаждение 6 nm золота. Для измерения толщины пленок в процессе осаждения можно использовать кварцевые микровесы, установленные внутри камеры, не нарушая вакуума. Теперь можно приступить к подготовке самоорганизующегося монослоя в хорошо проветриваемом помещении, предварительно разогрев печь до 75 °C. Приготовьте раствор для функционализации, добавив 1 mL PEG-тиола к 20 mL толуола в стеклянном стакане объемом 250 mL.

Тщательно перемешайте раствор, перенося его пипеткой вверх и вниз от 5 до 10 раз, а затем перемешивая пипеткой в течение 30 секунд. Поместите образцы с рисунком в стакан рисунком вверх, убедившись, что они полностью погружены в раствор и равномерно распределены по дну стакана. Поместите стакан в печь и выдерживайте при температуре запекания от 18 до 21 часа до формирования SAM.

Подготовьте вспомогательный электрод, нанеся слой хрома толщиной 1 нм, а затем слой золота толщиной 4 нм на стеклянное покровное стекло размером 22 × 50 мм. Вспомогательный электрод должен быть почти прозрачным с легким серым или розовым оттенком. Храните вспомогательный электрод в чашке Петри покрытой стороной вверх, чтобы избежать загрязнения.

После 18–21 часа выдержки в печи извлеките стакан из печи. Толуол должен был испариться, оставив образцы шаблонов в вязком остатке пэг-клина. Добавьте в стакан 20 milliliters толуола и выдержите образцы в нем от одной до двух минут.

Извлеките образцы из стакана и промойте их толуолом, затем изопропанолом, и в конце высушите потоком азота. На этом этапе образцы должны выглядеть чистыми, а слой SAM должен быть невидим при обычном осмотре. SAM, подготовленные таким образом, при хранении в прохладном сухом месте остаются пригодными для использования до двух дней.

Неудачное формирование САМ приводит к образованию мутного или неоднородного по цвету осадка на поверхности. После подготовки САМ можно приступать к полимеризации тубулина в микротрубочки. Начните с размораживания немаркированного тубулина и тубулина, меченного родомином, и немедленно смешайте их в соотношении двух частей немаркированного к одной части меченого для получения ярких микротрубочек.

Тщательно перемешайте смесь, несколько раз пропипетировав ее вверх-вниз. Затем полимеризуйте тубулин в течение 20–40 минут в водяной бане при 37 °C. Пока тубулин полимеризуется, приготовьте буфер с Taxol, смешав 20 µM Taxol с буфером Pips.

Тщательно перемешайте содержимое, несколько раз пропипетировав раствор и подвергнув его вортексированию, после чего поместите пробирку в водяную баню при 37 °C. После полимеризации разбавьте микротрубочки теплым буфером с Taxol и защитите их от света. Убедитесь, что полимеризация микротрубочек прошла успешно и что микротрубочки остаются стабильными в течение нескольких минут флуоресцентного возбуждения.

После визуализации подготовленных микротрубочек с использованием смеси для поглощения кислорода, когда полимеризация тубулина в микротрубочки завершена, приступим к созданию паттернов MTS методом электрофореза. Для начала нарежьте двусторонний скотч на узкие полоски, поместив его на предметное стекло и используя лезвие бритвы; наклейте две полоски двустороннего скотча поперек образца с нанесенным паттерном Sam так, чтобы электрод находился между полосками, а соединительный путь проходил перпендикулярно скотчу.

Поместите вспомогательный электрод на двусторонний скотч металлической стороной к ленте так, чтобы край образца выступал за пределы вспомогательного электрода примерно на три миллиметра. Нарежьте несколько отрезков изолированного медного магнитного провода длиной 15 сантиметров и снимите один сантиметр изоляции с обоих концов. С помощью небольшой капли серебряной краски прикрепите провод к открытому золотому участку подложки, стараясь избежать электрического контакта со вспомогательным электродом.

Теперь с помощью токопроводящей серебряной краски прикрепите второй провод к противоэлектроду. Провода электродов, закрепленные серебряной краской, можно дополнительно зафиксировать на образцах с помощью клейкой ленты. Затем с помощью пипетки внесите микротрубочки в нужном разведении, при увеличении 20х найдите структуру на кремниевой пластине, после чего приложите напряжение.

Из-за глубины проточной камеры для визуализации ее верхней поверхности могут потребоваться объективы с большим рабочим расстоянием. Расстояние от поверхности образца до верхней поверхности проточной камеры определяется толщиной ленты и должно составлять примерно от 60 до 100 micrometers. Подайте напряжение до одного вольта и наблюдайте за миграцией микротрубочек.

Если требуется обратимое захватывание микротрубочек, используйте лак для ногтей, чтобы герметизировать проточную камеру для предотвращения бокового дрифта, и используйте более низкое напряжение, вплоть до 0,5 вольт. Миграцию можно отслеживать, регулируя вертикальную плоскость фокусировки микроскопа; при приложенном напряжении примерно от 0,9 до 1,2 вольт микротрубочки локализуются на поверхностях электродов.

Более высокое напряжение ускоряет миграцию и усиливает адгезию, однако чрезмерное напряжение вызовет электролиз и деполимеризацию. Микротрубочки. Мы только что продемонстрировали способ подготовки микроэлектродов с SAM-покрытием для паттернирования микротрубочек, так как SAM-покрытие предотвращает адсорбцию микротрубочек на микроэлектродах. Данную процедуру также можно использовать для обратимого паттернирования микротрубочек.

Более того, этот процесс ограничен не только микротрубочками, но может быть использован и для паттернирования биомолекул в целом. На этом все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.