Создание химерных эмбрионов данио рерио по трансплантации

Здравствуйте, я Хиллари Кемп из лаборатории Сесилии Оуэнс. А меня зовут Сесилия Оуэнс. Мы с Хиллари работаем в отделе фундаментальных наук в Онкологическом исследовательском центре Фреда Хатчинсона в Сиэтле.

Сегодня мы покажем вам технику создания химерных эмбрионов данио-рерио, также известную как генетическая мозаика. Эта процедура позволяет оценить клеточную основу функции гена в процессе развития. Мы можем задаться вопросом, функционирует ли данный ген в клетках с мутантным фенотипом, известным как автономная функция клетки, или в этой клеточной среде, известной как клеточная неавтономия.

Мы создаем эти мозаики путем трансплантации клеток между дикими типами мутантных эмбрионов либо на стадии бластулы, либо на ранней стадии желудочно-кишечного тракта. Впоследствии мы оцениваем функцию генов, наблюдая за фенотипом и генотипом донорских клеток в их окружающей среде. Итак, приступим.

В этой части протокола в донорский эмбрион вводится линейный краситель, чтобы можно было проследить судьбу клеток, полученных от донора, после трансплантации. Любая разновидность нуклеиновых кислот также может быть введена с помощью этой техники, однако, пропустите этап декорирования при введении ДНК перед работой с эмбрионами, подготовьте чашку для инъекций, вставив предметное стекло под углом 45 градусов в самую широкую часть чашки Петри. Три четверти заполнены 1,2% аросом в загонной среде для эмбрионов стрептококка.

Снимите горку после того, как агро схватится, чтобы сделать скошенное корыто. Наполните кормушку пером для зародыша средней среды. Теперь приступаем к ферментативному декорированию эмбрионов на одной клеточной стадии.

Инкубируйте эмбрионы на стадии одной клетки в течение одной-пяти минут в концентрации 0,5 миллиграмма на миллилитр. Раствор проназы. Внимательно следите за оформлением.

Как только корион начинает заметно разрушаться, погружаем эмбрионы в воду системы И это выливает весь кориум и зародыши остаются внизу, внизу кривой клюва. И очень важно, чтобы эмбрионы не коснулись поверхности воды еще один раз, и у большинства из них корион отделился. Снаружи есть несколько закрученных, которые этого не делают.

Если что-то еще находится в его корионе, то такой акт пипетирования вытащит их наружу, а затем выпустит эмбрионы, чтобы они никогда не касались поверхности воды. Важно работать с эмбрионами в оболочке с помощью пипетки, которая была отполирована огнём для сглаживания краев. Аккуратно перенесите хрупкие эмбрионы, покрытые оболочкой, в кормушку чашки для инъекций с помощью пипетки из полированного стекла с широким каналом ствола.

А затем мы загружаем один файл в эту корыту. Теперь эмбрионы готовы к введению маркера родословной с использованием точно откалиброванного огня, стеклянной пипетки для инъекций и установки для впрыска под давлением. Мы собираемся использовать чашку, полную эмбриональной среды, чтобы сломать иглу, и чашку, полную масла, чтобы откалибровать иглу.

Это просто обычное стандартное минеральное масло лабораторного класса. Мы берем пару заточенных часовых щипцов, а затем, глядя через окуляры, чтобы определить, какой будет правильный размер, мы помещаем щипцы по обе стороны иглы, а затем аккуратно отламываем скол, что я на самом деле не могу сделать без того, чтобы определить объем доставляемого красителя или рибонуклеотида. Перед запуском.

Измерьте размер болюса в чашке с минеральным маслом. Игла должна быть отломана так, чтобы одним или двумя импульсами микроинжектора подавался болюс объемом в один нанолитр. Объем болюса можно рассчитать по его диаметру, измеренному микрометром окуляра.

Введите один нанолитр от одного до 3% раствора флуоресцентного декстрана непосредственно в илк эмбрионов, покрытых оболочкой, между одной и четырьмя клеточными стадиями. Что я собираюсь сделать, так это поместить эмбрион прямо под иглу. Я собираюсь аккуратно вонзить иглу в центр желтка и нажать на ножную педаль.

После инъекции важно ввести в желтковые струи, чтобы краситель транспортировался в клетки. Этой инъекции будет достаточно, чтобы отслеживать клетки химерных эмбрионов в течение нескольких дней развития. В идеале мы делаем это до того, как клетки достигнут четырехклеточной стадии, выращивая введенные эмбрионы с низкой плотностью в чашке Петри, покрытой покрытием, заполненной свежим эмбрионом стрептококка. Терпимая.

Обратите внимание, что инъецированные эмбрионы, как правило, имеют немного замедленный темп развития, инкубируют эмбрионы при разных температурах, 25, 28 и 31 градус Цельсия, чтобы замедлить их развитие и максимизировать временное окно, в течение которого может быть выполнена трансплантация. Аппарат, используемый для трансплантации клеток у рыбы данио-рерио, состоит из управляемого приводом шприца Гамильтона, прикрепленного трехходовым стопорным краном к резервуару минерального масла и к держателю микропипетки через длинную гибкую трубку. Устраните все пузырьки воздуха из системы, так как они разрушат вашу способность контролировать всасывание и давление.

Используйте стереомикроскоп, который имеет высококачественную оптику с увеличением не менее DX. Для управления положением держателя микропипетки и иглы мы предлагаем ручной микроманипулятор NARA shige. Убедитесь, что он закреплен на скамейке с помощью магнитного основания, чтобы предотвратить передачу вибраций на трансплантат.

Иглы для трансплантации игл изготавливаются из стеклянных капиллярных пипеток, которые притягиваются к мягкому конусу на поляре электрода. Смотрите протокол JoVE из лаборатории Мириам Гудман для получения подробной информации о том, как протягивать пипетки под препарирующим микроскопом, отламывать кончик вытянутой иглы. Для трансплантации стадии бластулы внешний диаметр иглы должен составлять примерно от 50 до 60 микрон или от 30 до 40 микрон для переноса на гастростадию.

Для переноса гастроступени для улучшения проникновения необходимо сначала натянуть острый заусенец на конец иглы с помощью микрокорма, затем разгладить кончик иглы, поднеся его близко к нити микрокузницы. Затем поверните иглу так, чтобы передний край скоса мог соприкасаться с нитью. Как только передний край иглы соприкоснется с нитью, быстро оттяните ее, чтобы получилась заусеница.

Чтобы избежать повреждения клеток, бородка должна быть прямой, а кончик иглы не должен изгибаться С подготовленной оснасткой и иглами для трансплантации вы готовы к созданию химерных эмбрионов. Трансплантаты бластулы используются для пересадки клеток между эмбрионами, когда не требуется точная информация о карте судьбы. За исключением первичных зародышевых клеток, большинство клеток, как правило, не обречены на судьбу на этой стадии.

Карта судьбы бластулы такова, что мы можем различать клетки, которые дадут начало эктодерме, и клетки, которые дадут начало мезодерме. Мезодермальные и эндодермальные находятся вблизи края эмбриона стадии бластулы, в то время как кожные предшественники, которые дают начало нервной системе и поверхностной коже, лежат дальше от края эмбриона. Поэтому, когда мы пересаживаем клетки в эмбрионы стадии бластулы, мы можем нацелить эти клетки на предполагаемую мезодерму или на предполагаемую эктодерму.

Но мы не можем нацелить клетки на какую-либо конкретную область эктодермы или мезодермы, потому что мы не знаем об этом. На стадии бластулы, где находится дорсальная сторона эмбриона, заранее подготовьте чашки для инъекций, поместив пластиковую форму с парными рядами клиновидных выступов в чашку Петри, наполовину заполненную расплавленным 1,2% аросом в среде эмбриона. Как только арос застынет, снимите шаблон, оставив ряды лунок треугольной формы, каждый из которых достаточно велик, чтобы вместить один эмбрион.

Заполните форму для трансплантации загонной средой для эмбрионов стрептококка и загрузите эмбрионы стадии бластулы по отдельности в каждую лунку с помощью стеклянной пипетки, отполированной огнем. Теперь перенесите эмбрионы в пересадочные лунки, которые изначально позволяют им лечь на бок. Расположите эмбрионы так, чтобы донорские эмбрионы были размещены вниз по одной колонке, а эмбрионы-хозяева — вниз по соседней колонке.

Расположите чашку на сцене так, чтобы при введении иглы для трансплантации в эмбрион игла прижимала эмбрион к задней стенке его лунки. С помощью микроманипулятора опустите иглу для трансплантации в чашку под достаточно крутым углом. В идеале игла для трансплантации должна входить в эмбрион примерно под углом 45 градусов.

Как только кончик иглы окажется ниже поверхности эмбриональной среды, втяните небольшое количество эмбриональной среды в иглу, поворачивая микрометрический диск, управляющий шприцем Гамильтона. Для наиболее точного контроля граница раздела между минеральным маслом и средой для эмбриона должна оставаться в тонкой конической части иглы, не слишком близко к концу. Аккуратно расположите донорский эмбрион с помощью иглы, а затем верните иглу назад и введите бластулный колпачок эмбриона в нужном положении.

Быстрый сильный удар проникнет в эмбрион, не заставив его перевернуться. Медленно и осторожно втягивайте донорские клетки в иглу, чтобы избежать срезания клеток. Избегайте попадания желтка в иглу после того, как нужное количество клеток будет занято.

Слегка измените давление, чтобы остановить всасывание, и извлеките иглу из положения эмбриона хозяина. Перемещая чашку для трансплантации, можно внести небольшие коррективы в положение эмбриона-хозяина, осторожно поворачивая его с помощью трансплантационной иглы, при условии, что при этом соблюдается осторожность, чтобы не касаться желтка. При переносе донорских клеток в эмбрион хозяина избегайте введения ylk внутрь эмбриона, так как это приведет к повреждению и гибели донорских клеток из одного донорского эмбриона, который может быть пересажен нескольким хозяевам после завершения переноса клеток.

Перенесите пары доноров-хозяев в лунки с покрытием 24-луночной пластины для продолжения разработки. Единственным исключением из правила, согласно которому клетки не обречены на определенную судьбу на стадии бластулы, являются первичные половые клетки. Первичные зародышевые клетки определяются на очень ранних стадиях развития и обречены на судьбу своего первичного зародышевого состояния.

С самой ранней стадии первичные половые клетки залегают вблизи края эмбриона стадии бластулы и гаста. Так что, если целью эксперимента по трансплантации является пересадка первичных зародышевых клеток, то очень важно, откуда эти клетки берутся в донорском эмбрионе, и не важно, куда они попадают в эмбрион хозяина. Таким образом, правило заключается в том, что для соматических клеток важно, куда они попадают в эмбрион хозяина, что определяет их судьбу.

В случае с первичными половыми клетками важно, откуда они берутся в донорском эмбрионе, потому что их судьба уже определена. Если цель состоит в том, чтобы пересадить первичные зародышевые клетки, то эти клетки должны быть отобраны с края надежды донорского эмбриона, и они расположены прямо у края эмбриона в четырех маленьких кластерах каждой из трех или четырех клеток на этом листе, на этой стадии копья или на высокой стадии развития. И подбирать их придется очень осторожно, чтобы случайно не начать всасывать желток.

Итак, вот что я там сделал, и теперь я перехожу к эмбриону-хозяину. Теперь первичные зародышевые клетки будут прикрепляться к области генитального гребня любого эмбриона, в котором они находятся. Таким образом, нет необходимости пересаживать эти первичные зародышевые клетки на ту границу, которую они получат сами.

Так что я просто пересаживаю, помещаю их обратно в любое старое место в постэмбрион. Ключевым моментом для трансплантации зародышевых клеток, которая является полной противоположностью любому другому виду трансплантации, является то, что имеет значение, откуда поступают донорские клетки. Трансплантация клеток в организм хозяина на стадии желудочно-кишечного тракта позволяет экспериментатору воспользоваться картой судьбы рыбки данио-зебры, которая появляется, когда эмбриональный щит становится видимым.

Становится возможным различать различные типы тканей, а также домены в пределах предполагаемой центральной нервной системы. При переносе клеток между эмбрионами на стадии гастролиста есть некоторые вариации в протоколе, но общая процедура схожа с работой с бластосами для монтирования гастро. Сначала намажьте вертикальную полосу метилцеллюлозы в углублении стеклянного предметного стекла, затем залейте обильным количеством зародышевой среды для перьевого стрептококка, используя отполированный огнем пипетка.

Один донор и три носителя стадии щита для депрессионного слайда. Отбирайте донорские эмбрионы, которые немного моложе хозяев. Требуется новый инструмент для манипуляций с гастроклеем, концы короткой длины в два фунта тестовой лески в конец капиллярной трубки.

Таким образом делаем небольшую петлю. С помощью петли аккуратно сверните эмбрионы донора и хозяина на верхнюю часть полоски метилцеллюлозы и набейте их в метилцеллюлозу до упора. Раскатайте их так, чтобы выбранная область была самой верхней.

Так как во время трансплантации игла будет входить в эмбрион по касательной, чтобы доставить донорские клетки, не повреждая ylk. Трансплантацию гастроэнтерета лучше всего проводить под микроскопом с фиксированной стадией. Используйте органы управления микроманипулятора, чтобы сфокусировать кончик иглы для трансплантации.

Расположите держатель микропипетки и иглу под довольно небольшим углом так, чтобы игла находилась как можно ближе к горизонтали, насколько это позволяет край углубления на предметном стекле. Далее прокалывают донорский эмбрион. Если он установлен правильно, он не будет скатываться при входе иглы для трансплантации, если только эмбрион не слишком стар для легкого проникновения иглы.

Чтобы избежать прокола YLK, игла должна входить в эмбрион в фокальной плоскости, которая находится чуть глубже, чем у EDL. После прокалывания у донора может быть удалено большое количество клеток для трех инъекций клеток-хозяев. При вытягивании клеток избегайте всасывания желтка, перемещая иглу по мере того, как ячейки захватываются, если это необходимо.

Дополнительные эмбрионы могут быть собраны для получения большего количества клеток с помощью той же иглы перед выбросом клеток в хозяина, во время выброса клеток в организм хозяина эмбрион изгоняет клетки, пока игла проходит через целевую область, а не откладывает клетки в один сгусток. Это повысит вероятность того, что донорские клетки внесут свой вклад в желаемую ткань. Как только перенос клеток будет завершен, поместите все предметное стекло в чашку Петри и осторожно залейте его эмбрионом стрептококка. Терпимая.

В течение следующих нескольких часов метилцеллюлоза растворится, высвобождая эмбрионы. Количество переносимых клеток зависит от конкретной цели эксперимента. Клетки от одного донора могут быть пересажены трем или четырем хозяевам на следующее утро после трансплантации.

Хозяева могут быть исследованы, чтобы определить, было ли нацеливание на донорские клетки успешным. Успешная трансплантация первичных половых клеток из возраста бластулы приводит к получению флуоресцентно меченых клеток, вентрально расположенных рядом с соединением между ylk и расширением ylk. Итак, мы только что показали вам, как проводить трансплантацию гаструлы и бластулы.

При выполнении этой техники важно выбрать правильный метод трансплантации для целевой ткани, на которую вы надеетесь нацелиться с помощью своих клеток. Таким образом, трансплантация стадии бластулы достаточна для определения того, какие клетки попадают в дерму по сравнению с эктодермой. И вы также можете использовать эту технику для нацеливания на первичные зародышевые клетки.

Если вы хотите провести более тонкое картирование, лучше использовать возрастную трансплантацию желудочно-кишечного тракта, где дорсальная сторона уже определена. Таким образом, с помощью этой методики можно воздействовать на клетки различных отделов нервной системы, в частности, на передний мозг, средний мозг, задний и спинной мозг. Вот и все.

Большое спасибо за просмотр и удачи во всех ваших экспериментах.