Высокая пропускная метод для криоконсервации спермы и данио рерио In Vitro Оплодотворение

Здравствуйте, я Брюс Дрейпер из Калифорнийского университета в Дэвисе, факультет молекулярной и клеточной биологии, и я Сесилия Стоанс из отдела фундаментальных наук в Онкологическом исследовательском центре Фреда Хатчинсона в Сиэтле. Сегодня мы с Сесилией продемонстрируем протокол сохранения спермы рыбок данио-рерио, который является модификацией оригинального протокола Брайана Харви. Мы покажем вам, что, работая в команде из двух человек, можно криоконсервировать сперму 100 отдельных самцов менее чем за два часа.

Несмотря на то, что существует широкий диапазон фертильности после размораживания, в среднем мы получаем 25% фертильности, и это из библиотеки, которая криоконсервировалась более семи лет. Итак, приступим. Перед выполнением этой процедуры, во-первых, сделайте из спермы замораживающие растворы.

Раствор Гинзбурга для рыбы обновляется каждые три дня, а замораживающий материал ежедневно обновляется с использованием метанола и без него. Состав этих растворов можно найти в онлайн-дополнительной информации, прилагаемой к этому протоколу. Материалы, используемые в этой процедуре, могут влиять на скорость замораживания и размораживания, что, в свою очередь, может повлиять на фертильность замороженной спермы.

По этой причине список рекомендуемых материалов также предоставляется в качестве дополнительной информации в Интернете. Лучше всего замораживать сперму на мелко измельченном сухом льду, а не на гранулах сухого льда. Один из простых способов измельчить сухой лед – завернуть его в полотенце и измельчить молотком.

Более эффективным методом является использование измельчителя сухого льда, такого как когти, и модели RE 2 для замораживания спермы данио-рерио. Сначала разметьте 10 микролитровыми капиллярными трубками лабораторной ручкой на уровне 3,33 микролитра или примерно в 16,7 миллиметрах от дна, для обезболивания самцов поместите от двух до четырех самцов в стакан, содержащий трику разведенной и рыбьей воды. Рецепт можно найти в книге данио-рерио.

После обезболивания выньте рыбок из анестетика с помощью пластиковой ложки и аккуратно промокните их насухо на бумажном полотенце. Особое внимание уделите прорисовке подфюзеляжной стороны. Вода активизирует сперматозоиды, поэтому очень важно тщательно высушить вокруг ика.

Расположите рыбу на держателе губки брюшной стороной вверх. Если область вокруг брюшных плавников еще влажная, аккуратно высушите ее салфеткой Ким. Поместите маркированную капиллярную трубку в адаптер для пипетки с резиновым горлышком, который входит в комплект поставки капиллярных трубок.

Адаптер представляет собой резиновый шланг, который имеет мундштук на одном конце и капиллярный держатель на другом. В качестве альтернативы капиллярная трубка может быть подключена к шприцу Hamilton объемом 50 микролитров. С помощью короткого отрезка трубки тигон соответствующего диаметра поместите самца под прицел и обнажите мочеполовое отверстие, осторожно раздвинув брюшные плавники в стороны.

Используя конец капиллярной трубки, сцедите сперму, осторожно поглаживая бока рыбы гладкими щипцами или осторожно сжимая бока рыбы указательным и большим пальцами, соберите сперму в капиллярную трубку по мере ее выталкивания с помощью мягкого отсасывания. Избегайте каловых масс, которые могут выделяться вместе со спермой. Целевой объем спермы составляет 3,3 микролитра.

Минимальное допустимое количество сперматозоидов варьируется в зависимости от качества спермы. Хорошая сперма белая и непрозрачная, в то время как пористая сперма выглядит водянистой. В целом, минимально допустимое количество сперматозоидов составляет один микролитр хорошей спермы или одну треть от цели, и два микролитра поровой спермы или две трети от цели.

Если объем спермы не достигает целевого объема в 3,3 микролитра, то необходимо нормализовать объем до отметки пера с помощью замораживающей среды без метанола. Если объем сперматозоидов уже достигает или превышает отметку ручки на капиллярной трубке, то приступайте к следующему этапу. Теперь добавьте криопротектор к сперме.

Всасываем замораживающую среду с метанолом до оранжевой отметки. Примерный общий объем теперь составляет 20 микролитров. Выдавите смесь спермы и криопротектора на чистую поверхность стекла часов, осторожно перемешайте пипетированием вверх и вниз около четырех раз, не допуская образования пузырьков.

Распределите сперматозоиды по двум криопробиркам, впрыснув 10 микролитров раствора криопротектора спермы на дно каждого меченого флакона. Двигаясь быстро, закупорьте флаконы и опустите каждый криофлакон в отдельную 15-миллилитровую соколиную пробирку. При комнатной температуре закройте трубки сокола крышками и вставьте их в мелко измельченный сухой лед.

Трубки должны быть вставлены достаточно глубоко, чтобы только крышки могли следить за трубками с соколом. Пронумеруйте их и запишите время, за которое каждая трубка погружается в сухой лед. Дайте сперме застыть в сухом льду в течение 20 минут.

После того, как сперма будет заморожена, переложите два криопробирки в колбу, содержащую жидкий азот. Для временного хранения. Поместите морозильную камеру в ванну с жидким азотом, чтобы образцы не нагревались.

Используйте длинные металлические щипцы, чтобы извлечь флаконы из колбы исполнителя, и обращайтесь с ними в криоперчатках. Кроме того, криофлаконы можно переносить непосредственно из сухого льда в морозильную камеру. Если морозильная камера хранится погруженной в жидкий азот в контейнере из пенополистирола для длительного хранения, поместите криопробирки в криогенную морозильную камеру с жидким азотом.

Для поддержания жизнеспособности сперматозоидов крайне важно, чтобы флаконы хранились погруженными в пробирки с жидким азотом, хранящиеся в паровой фазе, могут со временем потерять жизнеспособность. Скорость также имеет решающее значение для поддержания жизнеспособности сперматозоидов. Время между добавлением криопротектора и помещением флаконов со спермой на сухой лед должно составлять не более 30 секунд Экстракорпоральное оплодотворение.

Использование криоконсервированной спермы лучше всего работает с двумя людьми. Один человек выдавливает яйцеклетки из самок, в то время как другой размораживает сперму. Установите водяную баню на 33 градуса Цельсия.

Достаньте криопробирку из морозильной камеры с жидким азотом и переложите ее в жидкий азот, содержащий D, или колбу до тех пор, пока она не будет готова к оттаиванию. Выдавите яйца самок, находящихся под наркозом, в 35-миллиметровую пластиковую чашку Петри. Это подробно описано в протоколе JoVE под названием «Making Gyno Genetic» развернуло данио-рерио методом раннего давления, в котором содержится подробное описание данио-рерио.

При экстракорпоральном оплодотворении хорошая кладка содержит более 150 яйцеклеток, которые имеют однородный и желтоватый оттенок. Любой белый мусор свидетельствует о деградации. Если есть возможность, постарайтесь получить три кладки яиц и объединить их в одно блюдо.

Если в течение одной минуты после первого сцепления не получилось три хороших сцепления, то переходите к следующему этапу. Держите чашку накрытой, пока сперма размораживается. Тем временем извлеките флакон из жидкого азота и снимите крышку.

Быстро погрузите флакон наполовину в водяную баню с температурой 33 градуса на восемь-10 секунд. Быстро добавьте в флакон 70 микролитров буферного раствора соли Ганка комнатной температуры и перемешайте пипеткой вверх и вниз, сразу же добавьте к яйцам в чашке Петри и аккуратно перемешайте наконечником пипетки. Затем немедленно активируйте сперматозоиды и яйцеклетки, добавив 750 микролитров рыбьей воды для смешивания и инкубации в течение пяти минут при комнатной температуре.

Через пять минут наполните блюдо рыбой, водой и выдерживайте при температуре 28 градусов Цельсия. Через два-три часа подсчитайте и перенесите жизнеспособные эмбрионы в 100-миллиметровые чашки по 50 эмбрионов на чашку. Также рассчитывайте на оплодотворенные яйцеклетки, чтобы можно было определить фертильность образца спермы.

Фертильность сперматозоидов – это отношение жизнеспособных эмбрионов к общему количеству яйцеклеток, которое было использовано для экстракорпорального оплодотворения. Яйцеклетки можно сортировать в любое время от двух до шести часов после экстракорпорального оплодотворения. Если бесплодные яйца легко отличить от жизнеспособных эмбрионов, то бесплодные яйца прозрачные и неразделенные.

При наблюдении с помощью транс-освещения на стереомикроскопе средняя фертильность криоконсервированных сперматозоидов колеблется в широких пределах. Тем не менее, должна быть возможность получить в среднем 25% фертильности, которая стабильна в течение нескольких лет. На этом графике показан средний процент фертильности сперматозоидов, замороженных в период с 2001 по 2003 год и считавшихся еще в 2008 году.

Мы только что продемонстрировали высокопроизводительный метод для сохранения отсутствия рыбьих сперматозоидов. При выполнении этого протокола важно использовать все рекомендуемые износостойкие пластики и оборудование, а также использовать измельченный дробленый сухой лед, а не гранулы сухого льда. Очень важно использовать действительно высококачественную сперму и яйцеклетки, а в случае яйцеклеток при экстракорпоральном оплодотворении, после обработки сперматозоидов, важно использовать как можно большее количество яйцеклеток, чтобы увеличить количество фертильных эмбрионов, которые вы получаете на другом конце, что может занять от трех до четырех самок. Правильно?

Еще одним ключевым компонентом протокола является скорость. От сцеживания спермы самца до помещения ее в сухой лед никогда не должно проходить более минуты. Ну, я думаю, что на этом все.

Удачи в ваших экспериментах.