Создание данио рерио гиногенетических диплоидных на ранних давления

Здравствуйте, я Шарлин Уокер из лаборатории Чарльза Киммела в Орегонском университете, Институт нейробиологии. А я Грегори Уолш. Я работаю в лаборатории Сесилии Моенс в Отделе фундаментальных наук в Центре исследований рака Фреда Хатчинсона.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру получения триплоидных зебраданиш методом раннего воздействия давления. В этом методе используется гидростатическое давление для деполимеризации микротрубочек в яйцеклетке, оплодотворенной сперматозоидами, подвергнутыми УФ-облучению. Важным условием является соблюдение точного времени проведения процедуры.

Это предотвращает выведение второго полярного тельца, в результате чего образуется диплоидный эмбрион, гомологичные хромосомы которого представляют собой два продукта первого мейоза. Этот метод был разработан в начале 1970-х годов, когда я работал в лаборатории Джорджа Райзингера в Орегонском университете. В нашей лаборатории мы используем эту процедуру в генетических скринингах двух поколений.

Гаметы рыб поколения F1, подвергшихся воздействию мутагена, можно подвергать прямому скринингу на наличие рецессивных мутаций, вызывающих фенотипы развития у гомозиготного гиногенетического диплоидного потомства. Поскольку у данио-рерио наблюдается высокая генетическая интерференция, мы также используем этот метод для картирования мутаций на хромосомах и оценки расстояния от этих мутаций до центромеры. Итак, приступим. Поздним днем накануне эксперимента подготовьтесь к сбору спермы, разделив самцов и самок, предназначенных для стриппинга; можно использовать старых самцов, так как они не будут вносить вклад в генетический материал.

Самки должны выглядеть крупными с раздутым брюшком, в то время как самцы должны быть желтого цвета и проявлять активность. Содержите самцов и самок в течение ночи в отдельных резервуарах, обеспечив к ним легкий доступ утром. В день эксперимента утром приготовьте раствор Хэнкса и добавьте бикарбонат натрия.

Доставьте рыбу в рыбоводный цех в ведре со льдом. Возьмите с собой раствор Хэнкса, трикальзин, таймер и пробирки для сбора спермы. По прибытии в рыбоводный цех разведите трикальзин в аквариумной воде.

Это будет использоваться для анестезии рыб на следующем этапе. Для начала сбора спермы подготовьте чистую пробирку с раствором Хэнкса на льду. Подготовьте достаточное количество охлажденного раствора Хэнкса (примерно по 50 µL на одного самца), после чего подвергайте анестезии одного или двух самцов за раз.

Погружением и с помощью трика их можно извлечь из анестетика пластиковой ложкой. Промойте самцов в воде и промокните бумажным полотенцем досуха. Это крайне важно, так как вода активирует сперматозоиды.

После высыхания закрепите рыбу в пенопластовом держателе под стереомикроскопом при малом увеличении с эпи-освещением. Разведите брюшные плавники пинцетом и поместите микрокапилляр к открытию клоаки, чтобы начать сбор спермы. Осторожно, но уверенно поглаживайте бока рыбы гладким пинцетом; когда молочная сперма начнет выходить из генитального отверстия, соберите ее в микрокапилляр с помощью легкого всасывания. Соберите таким образом сперму от нескольких самцов и поместите ее на лед.

Спермы пяти-десяти самцов в холодном сбалансированном солевом растворе Хэнкса достаточно для оплодотворения икры 20–30 самок. Сперма, хранящаяся в холодном растворе Хэнкса, сохраняет высокую эффективность оплодотворения в течение нескольких часов.

Соберите достаточное количество спермы для приготовления мутной суспензии с целью УФ-инактивации сперматозоидов. Для начала засыпьте дно стеклянной чашки Петри льдом. Поместите часовое стекло поверх льда в чашке.

Затем с помощью пипетки перенесите сперму из пробирки на часовое стекло. Постарайтесь набрать в пипетку как можно больше спермы, избегая попадания пузырьков воздуха. Крайне важно не допускать вспенивания спермы; выпустите ее на часовое стекло тонким равномерным слоем, после чего утилизируйте пипетку.

После переноса сперматозоидов поместите чашку Петри в УФ-кросслинкер. Включите кросслинкер, установив уровень энергии на 900 JUULs. После сшивания с помощью чистого пипетора удалите сперматозоиды с предметного стекла, перенесите их в микроцентрифужную пробирку с маркировкой «UV sperm» и поместите на лед.

Для начала сбора икры сначала анестезируйте по две самки за один раз. При использовании Trica крайне важно не держать рыб в растворе слишком долго, так как длительная анестезия может привести к гибели рыбы. Затем промойте рыб в аквариумной воде и промокните бумажным полотенцем досуха.

Это критически важно, так как избыток воды приведет к набуханию икринок и предотвратит оплодотворение. Поместите самку в пластическую чашку Петри диаметром 35 мм, используя влажные, но не мокрые пальцы. Осторожно, но уверенно надавите на брюшко.

Если самка готова к нересту, икра выйдет легко; соберите икру шпателем и верните самку в воду. Качественная икра имеет желтоватый полупрозрачный цвет, в то время как икра, слишком долго находившаяся в организме самки, становится белой и водянистой. Чтобы получить качественную икру, собирайте её в течение первых двух часов после включения освещения в рыбном цехе, поддерживая икру в закрытом состоянии для предотвращения высыхания.

После сбора икры добавьте от 30 до 50 µl суспензии спермы, облученной УФ-излучением, к икре и осторожно перемешайте кончиком пипетки. Немедленно добавьте около 1 мл рыбной воды и запустите таймер. Икра, оставленная для развития на этом этапе, будет гаплоидной.

Следующие этапы должны быть выполнены в течение 90 секунд после оплодотворения. Запустите таймер в момент активации икринок путем добавления воды.

Точное время наступления метафазы первого деления мейоза зависит от температуры. Время подачи и снятия давления оптимизировано для 28,5 °C. После запуска таймера подождите несколько мгновений, затем добавьте воды и переместите яйца в центр чашки.

Используя обрезанную и отполированную пастуровскую пипетку, при необходимости перенесите оплодотворенные яйца в виалы под давлением; добавьте в виалу больше яичной воды так, чтобы она почти переливалась, оставляя каплю воды в петле виал. Затем накройте каплю воды резиновым колпачком и зафиксируйте сверху пластиковой крышкой.

Поместите пробирки в цилиндр высокого давления вверх дном, добавив больше яичной воды. Чтобы заполнить цилиндр, надежно закройте его крышкой. После закрытия установите цилиндр в пресс поршнем вверх и приложите давление 8, 000 pounds per square inch.

Оставьте цилиндр в прессе до истечения шести минут с момента активации, чтобы общее время воздействия давления составило 4,5 минуты. Через шесть минут после активации извлеките цилиндр из пресса. Достаньте флаконы из цилиндра и аккуратно просушите их, чтобы предотвратить охлаждение эмбрионов.

Обнулите цилиндр и снова наполните его яйцевой водой. Подготовьте следующие флаконы, частично наполнив их яйцевой водой по мере необходимости. Повторите эти шаги для всех партий яиц.

Цилиндр вмещает до двух флаконов одновременно, поэтому рекомендуется подождать одну или две минуты перед оплодотворением икры, чтобы проверить, отложат ли икру другие самки, которые уже находятся в трике. Это позволит ускорить процесс, обрабатывая большее количество партий за один раз. Кроме того, если выжимать рыбу во время использования пресса, икра может пересохнуть и стать нежизнеспособной к моменту, когда пресс снова будет доступен; через 24 часа после оплодотворения гаплоидный эмбрион zebrafish будет иметь короткое плотное тело, короткий хвост и менее выраженно сформированный мозг.

Тем не менее, у всех них будут одинаковые части тела, такие как сомиты, хорда, глаза и уши. Будучи диплоидами, гаплоиды и диплоиды проявляют неограниченные сгибательные движения примерно через 24 часа. После оплодотворения диплоидные сибсы EP имеют длинные хвосты, хорошо сформированный головной мозг, а их жизнеспособность должна составлять около 60–70%.

Эти образцы очень напоминают необработанные развернутые контроли. Обычно партия гаплоэмбрионов представляет собой смесь эмбрионов с нормальным внешним видом, погибших эмбрионов и промежуточных вариантов. Соотношение эмбрионов с нормальным внешним видом к дефектным отражает наличие вредных генов в женском геноме.

Мутации относительно легко идентифицировать даже на таком фоне, поскольку несколько особей (до 50%) будут иметь один и тот же характерный фенотип. Важно убедиться, что эмбрионы, полученные этим методом, действительно являются OID; для этого в качестве контроля создают группу нормальных диплоидных яиц, отложив часть спермы без УФ-инактивации, и группу гаплоидных эмбрионов, отложив часть яиц, оплодотворенных УФ-облученной спермой без проведения процедуры EP; гаплоиды нежизнеспособны спустя два-три дня. Диплоиды, полученные путем EP, должны выглядеть как обычные диплоиды.

Несмотря на то, что могут встречаться отдельные иррегулярные монстры EP, жизнеспособность кладок диплоидов EP должна составлять примерно 70–90%. Наличие гаплоидов в кладке, подвергнутой EP, указывает на сбой в процессе EP; например, если пресс не удерживал давление. Наличие диплоидов в гаплоидной кладке свидетельствует о неполной инактивации сперматозоидов, например, об отказе кросслинкера.

Мы только что продемонстрировали, насколько просто провести In vitro оплодотворение данио-рерио и как получить генетически детерминированные диплоидные эмбрионы данио-рерио женского пола путем ингибирования второго мейотического деления. При выполнении данной процедуры важно помнить, что время воздействия давления должно быть точно рассчитано, а пресс должен поддерживать давление 8,000 pounds per square inch на протяжении всего процесса. Обязательно убедитесь, что ваш пресс откалиброван.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.