Визуализация бьющееся сердце в Drosophila

Здесь будут представлены две техники визуализации бьющегося сердца у дрозофилы для вскрытия сердца взрослого человека. Сначала удаляют голову и грудную клетку одним разрезом по указанной линии. Далее удаляются гениталии и с помощью щипцов вскрывается брюшная полость кишки, а в случае самки мухи удаляются яичники.

Брюшное жировое тело в третьем и четвертом сегментах брюшной полости осторожно отсасывается, чтобы обнажить взрослое сердце для иммобилизации личинового сердца. Одну личинку, помещенную в буферный раствор, фиксируют путем нанесения сначала гистоакрального клея вокруг области головы личинки. Личинки аккуратно растягиваются и больше клея наносится на задний конец, а затем на боковые стороны стенки тела личинки.

Привет, я GI Fler. Привет, меня зовут Карен Эр. Мы оба являемся участниками программы «Развитие и старение» в Институте медицинских исследований Бернхема.

Сегодня мы покажем вам процедуры, которые мы разработали для визуализации бьющегося сердца Лаваля и взрослой дрозофилы. Мы используем оба этих препарата для визуализации, изучения и количественной оценки параметров сердцебиения у плодовой мушки. Дрозофила. Прежде чем приступить к работе, мы сначала готовим раствор искусственной гемолимфы.

Этот раствор содержит сахарозу входа, хело, которую следует добавлять в искусственную гемолимфу из охлажденных исходных растворов непосредственно перед использованием. Чтобы предотвратить бактериальное заражение, доведите искусственную гемолимфу до комнатной температуры и насытьте раствор кислородом путем барботирования воздуха в течение не менее 15 минут. Далее вытяните несколько тонких капилляров с помощью стандартного съемника пипетки, который понадобится для удаления жировых тел у мухи.

После того, как все будет подготовлено, взрослых мух необходимо обезболить. Это можно сделать с помощью кратковременного пребывания во время дневного сна от двух до пяти минут, но будьте осторожны, чтобы не оставлять мух в спете от мух дольше пяти минут. Кратковременное воздействие холода также может быть использовано для обезболивания мух, но углекислый газ не рекомендуется, поскольку он оказывает более длительное воздействие на частоту сердечных сокращений и здоровье.

Далее мух под наркозом помещают спинным боком вниз в чашку Петри, покрытую тонким слоем вазелина. Гидрофобная кутикула в крыльях и на теле должна обратимо прилипать к желе, но при необходимости муху можно переместить. Первоначальный разрез делается с помощью изогнутых пружинных ножниц.

Для этого лезвия ножниц помещаются под ноги мухи и наклоняются вниз к тыльной поверхности ближней шеи. Голова, вентральный нервный канатик и ноги удаляются одним разрезом после разреза. Затем препарат погружают в насыщенный кислородом раствор искусственной гемолимфы с помощью пружинных ножниц.

Задний кончик брюшной полости, который состоит из седьмого и восьмого сегментов брюшной полости, удаляется с помощью одного разреза. Это обеспечивает доступ для выполнения боковых разрезов по обоим краям живота и служит для разрыва связи между задней кишкой и кутикулой живота. Вставьте лезвия ножниц в небольшое отверстие на кончике живота и разрежьте кутикулу сбоку.

При этом освобождается один край вентральной кутикулы. Обхватите лоскут щипцами и сделайте аналогичный разрез по противоположному боковому краю живота. Теперь можно удалить освобожденный лоскут вентральной кутикулы живота.

Кишечник и другие органы брюшной полости обычно можно удалить как единое образование с помощью ювелирных щипцов и легкого перетягивания. При удалении внутренних органов обнаруживается бьющаяся сердечная трубка, которая все еще прикреплена к дорсальной кутикуле небольшими мышцами и окружена жировыми телами. Вытянутые капилляры вставляются в пластик, одна 16-дюймовая трубка подключается к источнику вакуума.

Сила всасывания пропорциональна диаметру наконечника, поэтому не следует использовать пипетки с наконечниками диаметром более 40 микрон после установки. Эта система отсасывания используется для отсасывания лишнего жира вокруг сердечной трубки. Его также можно использовать для удаления пузырьков воздуха, которые скапливаются вокруг кутикулы и любого мусора.

Необходимо проявлять крайнюю осторожность, чтобы не прикасаться к самому сердцу, а поскольку задняя часть сердца очень хрупкая, следует избегать этой области вместе. Сердечная трубка взрослой дрозофилы теперь обнажена и при необходимости должна биться. Кутикулу и прикрепленное сердце можно переместить, аккуратно вытащив кутикулу из вазелина и осторожно утрамбовав ее обратно.

Избегание любого контакта с сердечными тканями. На этом этапе раствор для купания препарата следует заменить свежим искусственным гемолимфом. Перед любыми манипуляциями этому препарату следует дать сбалансироваться в течение 20-30 минут с оксигенацией.

Если препарат должен сохраняться дольше 60 минут, его следует реперфузировать свежей искусственной гемолимфой. В настоящее время этот препарат готов к использованию для оптической регистрации, а также может быть использован для электрофизиологической регистрации или для гистологических манипуляций. Для визуализации бьющегося сердца внутри личинки требуется другая методика.

Во-первых, подготовьте чехлы за день до процедуры. Это делается с помощью зубочистки, чтобы перенести от 50 до 70 микролитров раствора Сарда на крышку размером 22 на 22 миллиметра. Дайте защитному кожуху затвердеть при температуре 65 градусов Цельсия в течение ночи.

Затем сделайте буфер Броуди и Бейтса после приготовления, аликвоты можно хранить при температуре минус 20 градусов Цельсия и размораживать при необходимости. Наконец, подготовьте инструменты, необходимые для нанесения гистоакрального клея. Сначала оттягиваем несколько мелких капилляров.

Затем соедините наконечник для пипетки объемом 1,5 миллилитра с небольшой пластиковой трубкой диаметром около 32 дюймов. Вставив меньший конец в трубку, введите капилляр с широким его отверстием на другой конец. После установки загрузите капилляр гистоклеем, окунув капилляр в каплю клея и осторожно всасывая пластиковый наконечник.

При работе с клеем следует иметь под рукой второй стеклянный капилляр для удаления излишков клея с кончика клеевого капилляра. Клей является жидким до тех пор, пока не вступит в контакт с буферным физиологическим раствором, где он затвердеет в течение нескольких секунд. Тем не менее, он обычно остается пластичным достаточно долго, чтобы его можно было удалить с капиллярного наконечника клея или во время нанесения его на образец.

Теперь, чтобы начать обездвиживание личинок, поместите каплю гистоакрального клея близко к каждому углу силгарда. Покровные листы добавляем в капли клея по 50 микролитров буфера Б и В, которые затвердевают моментально заполнят пространство между приклеенными местами с б и б. Клей будет удерживать буфер на предметном стекле

Возьмите блуждающую L трех личинок и положите ее на лист влажной папиросной бумаги на лед на две минуты. Это замедлит его движение. Далее перенесите личинок в буфер и ориентируйте его спинной стороной вверх.

Это та сторона личинок, на которой отсутствуют идентичные ремни. Быстро нанесите немного клея между областью головы и защитным кожухом порога. Клей очень быстро затвердеет и не даст голове личинки двигаться.

С помощью щипцов осторожно возьмите животное за задние блестки и аккуратно растяните его. Зафиксируйте личинки в таком положении, нанеся клей по обе стороны от личинок на задней половине. Чтобы уменьшить дальнейшее движение кутикулы по стенкам тела, мышцы добавьте больше клея на бока животного.

Теперь личинка зафиксирована в таком положении. Чехол можно поместить в маленькую чашку Петри, наполненную искусственной гемолимфой, или теперь можно записывать сердцебиение PBS без помех от движений стенок тела. Полунеповрежденное сердце взрослой дрозофилы будет ритмично биться в течение нескольких часов после вскрытия, если его содержать в свежей искусственной гемолимфе, насыщенной кислородом.

Показательный пример показан здесь, а в дополнительном фильме показано одно сердце с третьего места в звездчатых личинках, показанных здесь, и молодые мухи, которые через одну-три недели после эло, обычно демонстрируют регулярное сердцебиение с частотой от одного до трех герц; мухи старше трех недель обычно более аритмичны. Тем не менее, эти сердца все еще способны спонтанно биться в течение нескольких часов в насыщенных кислородом искусственных гемолимфических сердцах, и взрослые мухи, поврежденные в результате процедуры вскрытия, обычно демонстрируют локализованные области крайней суженности, которые не могут расслабиться и часто находятся неконтролируемо. Частота сердцебиения медленнее одного герца редко наблюдается у мух моложе трех недель.

Следовательно, такие препараты считаются поврежденными и выбрасываются. Мы только что продемонстрировали, как подготовить сердечки ровных и взрослых плодовых мушек для оптической визуализации. Помните, что при изготовлении полунеповрежденного препарата никогда не прикасайтесь к самому сердцу.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.