Визуализация бьющееся сердце в Drosophila

Здесь будут представлены две методики визуализации бьющегося сердца Drosophila для препарирования сердца взрослой особи. Сначала голову и грудной отдел удаляют одним разрезом по indicated line. Затем удаляют гениталии и с помощью пинцета вскрывают брюшную полость, после чего удаляют кишечник и, в случае самки, яичники.

Жировое тело в брюшных сегментах три и четыре осторожно отсасывают, чтобы обнажить сердце взрослой особи для иммобилизации личиночного сердца. Одиночную личинку, помещенную в буферный раствор, фиксируют, нанося гистоакриловый клей сначала вокруг области головы личинки. Личинку осторожно растягивают, затем наносят клей на задний конец и на боковые стороны стенки тела личинки.

Здравствуйте, я Джи. Ай. Флер. Здравствуйте, я Карен Эр. Мы оба являемся сотрудниками программы «Развитие и старение» в Институте медицинских исследований Бернема.

Сегодня мы продемонстрируем разработанные нами процедуры для визуализации биения сердца личинок и взрослых особей Drosophila. Обе эти подготовки используются нами для визуализации, изучения и количественной оценки параметров сердечного ритма плодовой мушки Drosophila. Прежде чем приступить к работе, мы подготовим раствор искусственного гемолимфатического раствора.

Данный раствор содержит сахарозу, которую следует добавить в искусственную гемолимфу из охлажденных стоковых растворов непосредственно перед использованием. Чтобы предотвратить бактериальное загрязнение, доведите искусственную гемолимфу до комнатной температуры и насытьте раствор кислородом путем барботирования воздухом в течение не менее 15 минут. Затем с помощью стандартного вытягивателя капилляров изготовить несколько тонких капилляров, которые понадобятся для удаления жировых тел у мухи.

После завершения всех подготовительных этапов взрослых мух необходимо подвергнуть анестезии. Это можно сделать путем кратковременного воздействия fly nap в течение от двух до пяти минут; однако следует следить за тем, чтобы мухи не находились под воздействием fly nap более пяти минут. Для анестезии мух также можно использовать кратковременное охлаждение, но применение диоксида углерода не рекомендуется, так как он оказывает более длительное влияние на частоту сердечных сокращений и ити.

Затем анестезированных мух помещают спиной вниз в чашку Петри, покрытую тонким слоем вазелина. Гидрофобная кутикула крыльев и тела должна обратимо прилипать к вазелину, при этом при необходимости положение мухи можно изменить. Первый разрез делают изогнутыми подпружиненными ножницами.

Это осуществляется путем размещения лезвий ножниц под ногами мухи под углом вниз к дорсальной поверхности в области шеи. После одного разреза удаляются голова, вентральный нервный шнур и ноги. Затем препарат погружают в оксигенированный раствор искусственного гемолимфатического раствора с помощью пружинных ножниц.

Задний кончик брюшка, состоящий из седьмого и восьмого сегментов, удаляют одним разрезом. Это обеспечивает доступ для выполнения боковых разрезов вдоль обоих краев брюшка и служит для разрыва связи между задним отделом кишечника и кутикулой брюшка. Введите лезвия ножниц в небольшое отверстие на кончике брюшка и разрежьте кутикулу в латеральном направлении.

Это освобождает один край вентральной кутикулы. Захватите лоскут пинцетом и сделайте аналогичный разрез вдоль противоположного латерального края брюшка. Теперь освобожденный лоскут вентральной кутикулы брюшка можно удалить.

Кишечник и другие органы брюшной полости обычно можно удалить единой массой, используя ювелирные пинцеты и осторожно потягивая за них. Удаление внутренних органов обнажает бьющееся сердце (сердечную трубку), которое все еще прикреплено к дорсальной кутикуле небольшими мышечными волокнами и окружено жировыми телами. Вытянутые капилляры вводят в пластиковую трубку диаметром 1/16 дюйма, подключенную к источнику вакуума.

Сила всасывания пропорциональна диаметру наконечника, поэтому после настройки не следует использовать пипетки с наконечниками диаметром более 40 микрон. Эта система всасывания используется для удаления излишков жира вокруг сердечной трубки. Она также может применяться для удаления скопившихся вокруг кутикулы пузырьков воздуха и любого мусора.

Необходимо соблюдать крайнюю осторожность, чтобы не коснуться самого сердца; поскольку задняя часть сердца очень хрупкая, следует избегать воздействия и на эту область. Теперь сердечная трубка взрослой дрозофилы открыта и, при необходимости, должна сокращаться. Кутикулу с прикрепленным сердцем можно переместить, осторожно приподняв кутикулу из вазелинового масла и аккуратно прижав ее обратно.

Избегайте любого контакта с тканями сердца. На этом этапе раствор, в котором находится препарат, следует заменить свежей искусственной гемолимфой. Перед проведением любых манипуляций препарату необходимо дать стабилизироваться в течение 20–30 минут при подаче кислорода.

Если препарат необходимо поддерживать в течение более 60 минут, следует провести реперфузию свежим искусственным гемолимфой. Теперь препарат готов к использованию для оптической регистрации; он также может быть использован для электрофизиологической регистрации или гистологических манипуляций. Для визуализации сердцебиения непосредственно в личинках требуется иная методика.

Сначала, за день до проведения процедуры, подготовьте покровные стекла. Для этого с помощью зубочистки перенесите около 50–70 µL раствора Sylgard на покровное стекло размером 22 × 22 мм. Оставьте Sylgard затвердевать при температуре 65 °C на ночь.

Затем приготовьте буфер Броди и Бейтса; после приготовления аликвоты можно хранить при температуре -20 °C и размораживать по мере необходимости. В завершение подготовьте инструменты, необходимые для нанесения гистоакрального клея. Сначала вытяните несколько тонких капилляров.

Затем соедините наконечник дозатора объемом 1,5 мл с небольшой пластиковой трубкой диаметром примерно 1/32 дюйма. Вставьте капилляр узким концом в трубку, чтобы широкое отверстие было направлено в другую сторону. После этого заполните капилляр гистологическим клеем, погрузив его в каплю клея и осторожно втянув жидкость в пластиковый наконечник.

При работе с клеем следует иметь под рукой второй стеклянный капилляр, чтобы удалять излишки клея с кончика наносящего капилляра. Клей остается жидким до момента контакта с буферным физраствором, в котором он затвердевает в течение нескольких секунд. Тем не менее, обычно он остается пластичным достаточно долго, чтобы его можно было удалить с кончика капилляра или нанести на образец.

Теперь для начала иммобилизации личинок нанесите каплю гистоакрилового клея рядом с каждым углом покровного стекла Sylgard. Добавьте по 50 µL буфера B&B на капли клея; клей затвердеет мгновенно. Заполните пространство между местами склейки буфером B&B. Клей удержит буфер на предметном стекле.

Возьмите личинку стадии L3 в фазе активного перемещения и поместите ее на кусочек влажной салфетки на льду на две минуты. Это замедлит ее движение. Затем перенесите личинку в буфер и расположите ее дорсальной стороной вверх.

Это сторона личинки, на которой отсутствуют идентичные пояски. Быстро нанесите немного клея между областью головы и защитным бортиком. Клей затвердеет очень быстро, что предотвратит смещение головы личинки.

С помощью пинцета осторожно захватите животное за задние щетинки и аккуратно растяните его. Зафиксируйте личинку в этом положении, нанося клей вдоль обеих сторон задней половины тела. Чтобы уменьшить дальнейшее движение кутикулы под воздействием мышц body wall, нанесите дополнительный клей на бока животного.

Теперь личинка зафиксирована в этом положении. Предметное стекло можно поместить в небольшую чашку Петри, наполненную искусственным гемолимфоподобным раствором или PBS; теперь можно регистрировать сердцебиение без помех со стороны движений стенок тела. Полуинтактное сердце взрослой мухи Drosophila будет ритмично сокращаться в течение нескольких часов после диссекции при условии поддержания в свежем оксигенированном искусственном гемолимфоподобном растворе.

Репрезентативный пример показан здесь и в дополнительном видеоролике 1; сердца личинок третьей стадии, представленные здесь, и молодых мух в возрасте от одной до трех недель после вылупления обычно демонстрируют регулярное сердцебиение с частотой от 1 до 3 Hz. У мух старше трех недель сердцебиение обычно более аритмично. Тем не менее, такие сердца все еще способны спонтанно сокращаться в течение нескольких часов в оксигенированном искусственном гемолимфе. Сердца взрослых мух, поврежденные в результате процедуры диссекции, обычно имеют локализованные области экстремального сужения, которые не способны расслабиться и часто сокращаются бесконтрольно. Частота сердцебиения ниже 1 Hz редко наблюдается у мух моложе трех недель.

Следовательно, такие препараты считаются поврежденными и утилизируются. Мы только что продемонстрировали способ подготовки сердец личинок и взрослых особей дрозофилы для оптической визуализации. Помните, что при создании полуинтактного препарата нельзя касаться самого сердца.

На этом все. Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.