Анализ для Возбудитель-Associated молекулярной Pattern (PAMP)-Triggered Иммунитет (PTI) в растениях

Здравствуйте, я Сума ТИ из лаборатории Грега Мартина в Институте исследований растений Voice Thompson. Сегодня мы покажем вам процедуру анализа на основе клеточной смерти на иммунитет, вызванный PAM или PTI. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для поиска участия гена в PTI.

Итак, приступим. Начните процедуру с выращивания Nicotiana ANA до семинедельного возраста. За четыре-пять дней до начала.

PAM запускал тест на иммунитет или PTI. Обрежьте растения, чтобы удалить все пазушные ветви и цветы. Попробуйте удалять пазушные ветви вскоре после того, как они появятся, чтобы сделать растения более управляемыми.

После подготовки растений приступают к выращиванию бактерий. В этой процедуре используются непатогенные бактерии для индукции иммунитета растений перед повторной инокуляцией провокационными бактериями, которые инициируют рост всех бактерий, используемых в анализе. При этом используйте замороженные стебли глицерина бактерии Pseudomonas для каждого стебля бактерии Pseudomonas.

Распределите небольшое количество бактерий по центру планшета KBM, содержащего соответствующий антибиотик, и инкубируйте планшет при температуре 30 градусов Цельсия в течение примерно 18-24 часов. Для борьбы с агробактерией используйте заранее подготовленную свежую тарелку, чтобы начать жидкую культуру в два миллилитра лл. Выращивайте за ночь при 30 градусах Цельсия с встряхиванием на следующий день.

Добавьте от 150 до 200 микролитров жидкого KBM в пластины бактерий Pseudomonas. Распределите бактерии по всей тарелке. С помощью стерильного гретера.

Поставьте пластины обратно в инкубатор еще на 20 – 24 часа. Четыре агробактерии. Начните вторичное культивирование примерно с 5-10 миллилитров LB, содержащего 20 микромолярного ацетона.

Выращивайте культуру на ночь при 30 градусах тепла с встряхиванием. После подготовки бактерий приступают к подготовке растений к анализу за день до проведения ПТИ анализа. После подготовки бактерий переместите растения в помещение с температурой от 22 до 24 градусов по Цельсию с относительной влажностью от 35 до 40% и постоянным светом.

Далее с помощью толстого черного маркера отметьте круги на листьях. Выбирайте хорошо разросшиеся листья и избегайте старых или жестких на ощупь листьев. Избегайте маркировки нижних частей листа.

Круги имеют диаметр не менее 1,5 сантиметра, и на каждом листе можно отметить от двух до четырех кругов. Круги должны быть хорошо расположены друг от друга и желательно не пересекать крупную жилку. Начните анализ PTI со сбора бактерий, используемых при индукции PTI.

Используемые виды Pseudomonas должны были образовывать бактериальную лужайку, свидетельствующую о хорошем росте. Соберите их с тарелки, соскребая стерильной длинной деревянной палочкой и повторно суспензируйте примерно от 20 до 25 миллилитров 10 миллимоляров. Раствор хлорида магния для центрифуг для агробактерий.

Культуру для сбора клеток и ресузи суспендируют примерно в 20-25 миллилитров 10 миллимолярных хлоридов магния плюс 10 миллимоляров. MES pH 5,6, повторите центрифугирование и снова, восстановите суспензию примерно в 20-25 миллилитров хлорида магния плюс раствор MES. Теперь, когда индуцирующие синегнойные палочки и агробактерии ресуспендированы.

Измерьте оптическую плотность всех трех культур на длине волны 600 нанометров. Отрегулируйте ОРВ, разбавив клетки хлоридом магния для псевдомонады и MES плюс хлорид магния для агробактерий. Окончательные требуемые значения OD находятся в сопроводительном письменном протоколе.

Общий объем в 25 миллилитров бактериальной культуры достаточен для посева примерно от 40 до 50 пятен. Теперь начните анализ с введения индукторов PTI в заранее отмеченные круги на листьях с помощью одномиллилитрового шприца без иглы. Запишите порядок, в котором растения были инфильтрированы, и точное время, когда началось проникновение после индукции.

Приступайте к провокационной инокуляции через несколько часов после индукционной инокуляции. Соберите штаммы бактерий, необходимые для провокационной инокуляции, как это было показано ранее для индуцирующих штаммов Pseudomonas. Опять же, измерьте OD и отрегулируйте концентрацию культур в соответствии с прилагаемым протоколом GR.

Начните провокационную инокуляцию через семь часов после инфильтрации индуктора. Используйте следующие комбинации индукторов-претендентов. Выберите точку на периферии первого круга прививки в качестве центра второго круга прививки.

Выполняйте провокационную инфильтрацию в том же порядке растений, что и при индукции. Если на листе есть несколько пятен, то убедитесь, что инфильтраты не перекрываются. Наконец, планшетное серийное разведение всех культур, использованных в анализе, на планшетах KBM или LB, содержащих соответствующие антибиотики.

Через два дня после провокационной инокуляции можно начинать оценку ответа PTI через два дня после индукции, и провокационные прививки ищут появление гибели клеток из-за иммунного эффекта, или ETI в местах, которые были опровергнуты PST DC 3000. Гибель клеток внутри перекрывающейся области инфильтрации указывает на разрушение PTI и должна быть оценена как положительный фенотип через четыре-пять дней после индукции и провокационной инфекции. Инокуляция направлена на выявление признаков гибели клеток из-за болезни в местах, которые были поражены мутантом DC 3000 hop Q1 или PS снова высоким. Ищите распад ЧТИ, который указывает на гибель клеток из-за заболевания в перекрывающейся области инфильтрации. Продолжайте наблюдать за растениями до тех пор, пока у тех, которые не скомпрометированы на PTI, не начнут проявляться клеточная гибель в перекрывающейся области инфильтрации.

Растения, замолчавшие для FLS two, подвергаются воздействию PTI через два дня после инокуляции комбинацией PFDC. Гибель клеток видна в перекрывающейся области, что указывает на разрушение контрольных растений PTI, которые не были подавлены для какого-либо гена. Они также были инокулированы комбинацией PFDC и обследованы через два дня после проведения анализа, поскольку гибель клеток проявляется снаружи, но не внутри перекрывающейся области из-за нормального ответа PTI.

Мы только что показали вам, как во время этой процедуры провести анализ на основе клеточной смерти на иммунитет, вызванный пневмодействием, или PTI. Важно помнить о том, что растения должны содержаться в тех условиях окружающей среды, которые мы рекомендуем. Более высокий уровень влажности негативно повлияет на растения и ускорит проведение анализа.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.