Анализ для Возбудитель-Associated молекулярной Pattern (PAMP)-Triggered Иммунитет (PTI) в растениях

Здравствуйте, я Сума TI из лаборатории Грега Мартина в Институте исследований растений Voice Thompson. Сегодня мы продемонстрируем процедуру анализа гибели клеток для изучения иммунитета, индуцированного PAM (PTI). В нашей лаборатории мы используем этот метод для изучения роли определенного гена в процессах PTI.

Итак, приступим. Начните процедуру с выращивания Nicotiana ANA до достижения ими возраста примерно семи недель. Это следует сделать за четыре-пять дней до начала работы.

Анализ иммунитета, индуцированного паттернами (PTI). Обрежьте растения, удалив все пазушные побеги и цветки. Старайтесь удалять пазушные побеги сразу после их появления, чтобы облегчить работу с растениями.

После подготовки растений приступайте к выращиванию бактерий. Данная процедура предполагает использование непатогенных бактерий для индукции иммунитета растений перед второй инокуляцией бактериями-патогенами; инициируйте рост всех бактерий, используемых в анализе. Одновременно с этим используйте замороженные глицериновые стоки бактерий Pseudomonas для каждого штамма Pseudomonas.

Высейте небольшое количество бактерий в центр чашки с KBM-средой, содержащей соответствующий антибиотик, и инкубируйте чашку при 30 °C в течение примерно 18–24 часов. Для агробактерий используйте предварительно подготовленную свежую чашку для постановки жидкой культуры в 2 мл среды LB. Инкубируйте культуру в течение ночи при 30 °C с перемешиванием, после чего приступайте к работе на следующий день.

Добавьте от 150 до 200 µL жидкой среды KBM в чашки с бактериями Pseudomonas. Распределите бактерии по всей поверхности чашки, используя стерильный шпатель.

Поместите планшеты обратно в инкубатор еще на 20–24 часа. Для agrobacterium создайте вторичную культуру примерно в 5–10 миллилитрах среды LB, содержащей 20 µM ацетошрикона.

Культивируйте культуру в течение ночи при 30 °C с перемешиванием. После подготовки бактерий, за день до проведения анализа PTI, подготовьте растения для анализа. После подготовки бактерий переместите растения в помещение с температурой 22–24 °C, относительной влажностью примерно 35–40% и постоянным освещением.

Затем с помощью толстого черного маркера нанесите круги на листья. Выбирайте хорошо разросшиеся листья, избегая старых, а также жестких или плотных на ощупь. Не помечайте нижние части листа.

Круги должны иметь диаметр не менее 1,5 сантиметров; на одном листе можно отметить от двух до четырех таких кругов. Круги следует располагать на достаточном расстоянии друг от друга, желательно так, чтобы они не пересекали крупные жилки. Начните анализ PTI со сбора бактерий, используемых для индукции PTI.

Используемые виды pseudomonas должны образовать бактериальный газон, свидетельствующий о хорошем росте. Соберите их с чашки, соскоблив стерильной длинной деревянной палочкой, и ресуспендируйте примерно в 20–25 миллилитрах 10 миллимолярного раствора хлорида магния для центрифугирования agrobacterium.

Культуру собирают для получения клеток, после чего их ресуспендируют примерно в 20–25 мл 10 мМ хлорида магния и 10 мМ MES с pH 5.6; центрифугирование повторяют, и снова ресуспендируют клетки примерно в 20–25 мл раствора хлорида магния и MES. Таким образом, индуцирующие бактерии Pseudomonas и Agrobacterium ресуспендированы.

Измерьте оптическую плотность всех трех культур при длине волны 600 нанометров. Доведите значение OD до требуемого, разбавляя клетки хлоридом магния для Pseudomonas и смесью MES и хлорида магния для Agrobacterium. Необходимые конечные значения OD указаны в прилагаемом письменном протоколе.

Общего объема бактериальной культуры в 25 мл достаточно для инокуляции примерно 40–50 зон. Начните анализ, вводя индукторы PTI в предварительно отмеченные круги на листьях с помощью одномиллилитрового шприца без иглы. Запишите последовательность инфильтрации растений и точное время начала инфильтрации после индукции.

Приступайте к инокуляции с использованием вызывающего агента через несколько часов после индукционной инокуляции. Соберите бактериальные штаммы, необходимые для инокуляции с вызывающим агентом, как было показано ранее для индуцирующих штаммов pseudomonas. Снова измерьте OD и отрегулируйте концентрацию культур в соответствии с прилагаемым протоколом GR.

Приступайте к инокуляции возбудителем через семь часов после инфильтрации индуктором. Используйте следующие комбинации индуктора и возбудителя. В качестве центра второго круга инокуляции выберите точку на периферии первого круга инокуляции.

Проведите контрольную инфильтрацию тех же растений в том же порядке, что и при индукции. Если на листе предусмотрено несколько точек, убедитесь, что зоны инфильтрации не перекрываются. В завершение высейте серийные разведения всех культур, использованных в анализе, на чашки с KBM или LB среды, содержащие соответствующие антибиотики.

Через два дня после инокуляции-вызова можно приступить к оценке PTI-ответа; через два дня после индукции и инокуляции-вызова проверьте наличие гибели клеток, вызванной эффектор-триггерным иммунитетом (ETI), в зонах, куда была введена PST DC 3000. Гибель клеток в области перекрытия инфильтраций указывает на нарушение PTI и должна оцениваться как положительный фенотип. Через четыре-пять дней после индукции и инокуляции-вызова проверьте наличие гибели клеток, вызванной заболеванием, в зонах, куда был введен мутант DC 3000 hop Q1 или PS back high. Снова проверьте наличие нарушения PTI, на которое указывает гибель клеток вследствие заболевания в области перекрытия инфильтраций. Продолжайте наблюдение за растениями до тех пор, пока у экземпляров с ненарушенным PTI не начнет проявляться гибель клеток в области перекрытия инфильтраций.

У растений с подавленной экспрессией FLS два нарушена реакция PTI через два дня после инокуляции комбинацией PFDC. Гибель клеток наблюдается в области перекрытия, что указывает на сбой в системе PTI. Контрольные растения, в которых экспрессия ни одного из генов не была подавлена, также были инокулированы комбинацией PFDC и исследованы через два дня после проведения анализа; гибель клеток в результате воздействия наблюдается за пределами области перекрытия, но не внутри неё, что обусловлено нормальным ответом PTI.

Мы только что продемонстрировали вам, как проводить анализ гибели клеток для изучения иммунитета, запускаемого паттернами (PTI). При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости поддержания рекомендованных условий окружающей среды. Повышенный уровень влажности может негативно повлиять на растения и привести к более быстрому протеканию анализа.

На этом все. Спасибо за просмотр и успехов в ваших экспериментах.