Количественные Phosphoproteomics в жирные кислоты Вынужденное Saccharomyces CEREVISIAE

Фосфорилирование является ключевым механизмом клеточной сигнализации, регулирующим процессы от локализации белков до транскрипции ДНК, и изучение самих фосфогрупп с помощью масс-спектрометрии представляет собой перспективное новое достижение в области исследования как сигналинга, так и протеомики. Дифференциально меченые клетки лизируют в шаровой мельнице, затем подвергают восстановлению, алкилированию, смешиванию и перевариванию. Переваренные пептиды фракционируют методом гидрофильной ионной хроматографии, после чего фосфопептиды обогащают из фракций с помощью метода iMac-обогащения.

Затем фракции, обогащенные фосфопептидами, идентифицируют с помощью масс-спектрометрии. Здравствуйте, я Рэмси Селин из группы E Института биологии персистенции. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру экстракции метаболически меченных фосфопептидов.

Мы используем данную процедуру в нашей лаборатории для количественного изучения протеома фоссы. Итак, приступим. Эта процедура начинается с выращивания изотопно легких и тяжелых дрожжевых клеток.

Сначала инокулируйте 100 миллилитров богатой среды одной колонией дрожжевых клеток. Выращивайте эту культуру в течение ночи до достижения OD 600 равной 1,0. Затем используйте ее для посева двух однолитровых культур минимальной среды, содержащей полный набор аминокислот и дополненной 20 миллиграммами на литр изотопно-помеченной формы.

Обычные или изотопно-тяжелые аргинин и лизин используются для выращивания двух культур объемом по одному литру в течение 18 часов до достижения OD 600 равной 1.8. Крайне важно, чтобы клетки прошли через как минимум девять поколений для полного включения меченых изотопов. После того как клетки полностью включили меченые изотопы, центрифугируют клетки, выращенные в среде с изотопно-нормальными аргинином и лизином.

Для получения клеточного осадка промойте осадок стерильной водой, перенесите в среду, содержащую олеат, с изотопно легким аргинином и лизином, и стимулируйте в течение 85 минут. Это позволит получить изотопно легкий образец, стимулированный олеатом. Другая культура, выращенная в среде с изотопно тяжелым аргинином и лизином, не стимулируется олеатом и будет служить изотопно тяжелым контрольным образцом, выращенным на глюкозе.

Для сбора одного литра культура распределяется по четырем центрифужных флаконам объемом 250 мл. После центрифугирования клетки собирают в одну пробирку, удаляя среду, оставляя лишь 100 мл, ресуспендируя клетки и перенося их в следующую пробирку. В итоге собирают один крупный осадок в одной центрифужной пробирке, центрифугируя в течение трех минут при 4 000 об/мин.

После удаления среды вес центрифужной пробирки с осадком сравнивают с весом пустой центрифужной пробирки. После центрифугирования удалите среду и аспирируйте избыток жидкости из пробирок, взвесьте осадки; типичный выход составляет от одного до двух граммов. Затем подвергните осадки быстрому замораживанию в жидком азоте и добавьте к ним буфер для гомогенизации, содержащий ингибиторы протеаз и фосфатаз.

Объем добавляемого буфера для гомогенизации должен быть эквивалентен массе осадка. Заморозьте сосуд для измельчения в жидком азоте. Дождитесь прекращения кипения жидкого азота.

С помощью скальпеля отколите часть таблетки и перенесите ее в измельчительный сосуд, содержащий замороженные шариковые подшипники. Перетирайте таблетки при 600 RPM, используя 22-секундный цикл с реверсом направления в течение трех минут. Повторно заморозьте измельчительный сосуд в жидком азоте.

Повторите измельчение еще четыре раза, чтобы общее время составило 15 минут. Время измельчения должно быть одинаковым для обоих образцов. Соберите замороженный измельченный материал в 50 мл центрифужные пробирки Falcon и храните в замороженном состоянии либо в жидком азоте, либо на сухом льду.

Храните измельченный образец при температуре -80 °C до начала использования. Изоляция и фракционирование пептидов начинаются с их алкилирования. Первый шаг заключается в растворении вашего образца в растворе мочевины.

Растворите каждую пробу измельченного образца, добавив три объема мочевинного буфера на один объем замороженного измельченного образца. Например, к пеллету массой одного грамма добавляют три миллилитра буфера для RIA. С одним миллилитром буфера PBS.

Немедленно обработайте смесь ультразвуком с помощью зонда. Используйте зондирование. Держите наконечник зонда близко к дну пробирки, чтобы предотвратить вспенивание раствора.

Измельченный образец должен немедленно быть перенесен в раствор. Очистите лизаты путем центрифугирования при 6 000 RPM в течение пяти минут. При температуре четыре градуса Цельсия перенесите супернатант в новые пробирки.

Для запуска реакции восстановления добавьте в каждый образец свежеприготовленный 0,5 молярный Трис с двумя карбоксильными LITAL PHOSPHINE или TCEP в разведении 1:100. Для достижения конечной концентрации TCEP 5 мМ инкубируйте образцы при 37 °C в течение одного часа. После инкубации при 37 °C дайте образцам остыть до комнатной температуры.

Затем добавьте свежеприготовленный 1 M iodoacetamide до конечной концентрации 20 mM и инкубируйте в темноте в течение одного часа при комнатной температуре. После часовой инкубации остановите реакцию с iodoacetamide, добавив 20 mM DTT. Оставьте пробу при комнатной температуре на один час.

Восстановленные и алкилированные лизаты теперь готовы к перевариванию трипсином. На данном этапе образцы лизатов могут быть использованы для количественного определения белков, анализа методом ЭСД-ПАГЭ для проверки лизиса клеток и масс-спектрометрического анализа для подтверждения включения тяжелых изотопов. Чтобы начать переваривание трипсином, смешайте эквивалентные количества изотопно тяжелых и легких образцов.

Разбавьте образец в четыре раза 20% метанолом и добавьте трипсин в разведении 1:200. Инкубируйте образец в течение ночи при 37 °C. На следующий день, убедившись в полном протеолизе с помощью SDS-PAGE и окрашивания кумазином, высушите образец в вакуум-центрифуге (speed vac) до полного высыхания.

Добавьте 200 µL фильтрованной дистиллированной воды и перемешайте на вортексе до полного растворения осадка. Высушите образец в вакуум-концентраторе (speed vac) и снова ресуспендируйте его в дистиллированной воде. После повторного высушивания образца снова ресуспендируйте осадок в 0,1% трифторуксусной кислоте (TFA); при необходимости проверьте с помощью pH-полосок, что значение pH составляет около 3. Подкислите 10% TFA, чтобы осадить любые преципитаты.

Теперь образец после переваривания трипсином будет обессолен с использованием колонки C 18 VAC 500 mg от Water SET Pack. Для начала гидратируйте колонку пятью миллилитрами 100% ацетонитрила, центрифугируя при примерно 200 ×g или при минимальной скорости, необходимой для прохождения жидкости через колонку. Затем уравновесьте колонку пятью миллилитрами 0,1% TFA и нанесите образец.

Будьте осторожны, чтобы не перегрузить колонку; при необходимости разделите образец между несколькими колонками. Соберите фильтрат в контейнер для отходов и при необходимости повторно загрузите колонку, промыв ее пятью миллилитрами 0,1% TFA. Повторите эту промывку, затем элюируйте двумя миллилитрами 60% ацетонитрила с 0,1% TFA. Элюат необходимо собрать путем центрифугирования.

Высушите образец в вакуум-концентраторе (speed vac), затем ресуспендируйте высушенный образец в 200 µL растворителя B. Теперь ресуспендированный образец готов к фракционированию пептидов. Проведите фракционирование пептидов на аналитической колонке TSK gel AMIDE 80 с предварительным использованием защитной колонки. Выполняйте каждый этап внимательно и без спешки.

Пропускайте элюент через колонку в течение двух часов при содержании solvent A 90%, затем проведите два холостых градиента перед нанесением образца. Как правило, мы не наносим более five milligrams за один цикл на колонку такого размера; современные и даже не самые современные системы жидкостной хроматографии позволяют автоматизировать ввод образца, сбор фракций, контроль скорости потока и смешивание градиентов.

Эти параметры устанавливаются в начале запуска согласно описанию. Проведите загрузку при 90%A в течение 20 минут, переход от 90%A до 85%A в течение пяти минут, от 85%A до 60%A в течение 40 минут, от 60%A до 0%a в течение пяти минут и от 0%A до 90%a в течение пяти минут. Установите скорость потока 1 мл/мин и собирайте фракции с интервалом в две минуты.

Начиная с градиента от 85%A до 60%A, объединяйте фракции, чтобы сократить их количество до 10; большее число фракций, вероятно, обеспечит более широкий охват фосфопротеома. Фосфопептиды обогащают методом иммобилизованной металл-хелатной хроматографии. В качестве смолы для IMAC мы используем гель Phos Select Iron Affinity.

Сначала Resus суспендирует осадок в 500 µL загрузочного раствора. Затем в каждую фракцию добавляют 15 µL 50%-й суспензии и инкубируют образцы в течение 30 минут при вращении в режиме «конец в конец». Полученный поток сохраняют для анализа.

Трижды промойте образец загрузочным раствором, затем один раз 500 мкл фильтрованной дистиллированной воды; после промывок элюируйте пептиды в течение двух-трех минут 400 мкл 50 мМ натрий-фосфатного буфера. Перенесите элюированные пептиды в стеклянный флакон. Добавьте к пептидам 5 мкл 100% муравьиной кислоты для подкисления до pH 3, ресуспендируйте фосфопептиды в 200 мкл 0,1% TFA и повторно проведите обессоливание с помощью колонки C 18, как описано ранее; высушите элюированные образцы в вакуум-концентраторе (speed vac).

Наконец, ресуспендируйте фосфопептиды в 20 µL 0,1% муравьиной кислоты. Теперь образцы готовы к количественному анализу методом масс-спектрометрии. Здесь представлена хроматограмма фракционирования общего пула клеточных пептидов с использованием H-I-L-I-C хроматографии.

На данной хроматограмме видно, что хотя фосфопептиды обнаруживаются на всем протяжении профиля элюции, основная часть фосфорилированных остатков удерживается почти до самого конца профиля элюции. Мы только что продемонстрировали вам процесс измельчения клеток, переваривания белков, фракционирования пептидов и обогащения фосфопептидов с помощью металлохелатной аффинной хроматографии. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости сохранения фосфорилирования и проверять pH буферных растворов.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.