Name: Количественные Phosphoproteomics в жирные кислоты Вынужденное Saccharomyces CEREVISIAE /em (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-12T23:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: Узнайте метод количественного фосфопротеомики с использованием криолиза, фракционирования HILIC и обогащения IMAC для анализа фосфопептидов в Saccharomyces cerevisiae. Этот подход позволяет изучать клеточные сигнальные механизмы.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Богатые Роджерс для оказания технической помощи с масс-спектрометрии анализа и полезные обсуждения, и д-ра. Роб-Мориц, Джефф Ranish, и Хамид Mirzai за полезные обсуждения. Эта работа финансировалась NIH Центры компетенции.

Клеточного роста и средств массовой информации <ol><li> Единственная колония BY4742Δarg4Δlys1 клетки на ночь в 100 мл богатых СМИ OD 600 на 1,0, то семя на две 1 л культур минимальной среде дрожжи (0,17% Дрожжи азотистого основания, без сульфата аммония или аминокислот, 0,5% сульфат аммония), содержащий полный набор аминокислот, дополнен 20 мг / л изотопически нормального или тяжелого аргинин (13 C 6 15 N 4; Isotec) и лизина (13 C 6 15 N 2; Isotec). </li><li> Клетки выращивались в течение 18 часов, чтобы OD 600 из 1,8. Очень важно, чтобы клетки пройти как минимум 9 поколений, чтобы добиться полного включения меченых изотопов. Свет образец осаждали, промывали стерильной водой, reseeded в олеат среде, содержащей (изотонически нормальной аргинин и лизин, 0,2% олеиновой кислоты (Sigma Chemicals) и 0,5% Твин 40 (Sigma Chemicals)) и стимулировали еще 85 минут. Это дает изотопно света, по отношению к аргинин и лизин, олеат-стимулированных образца и изотопно тяжелых глюкозы выращенных эталонного образца. </li></ol> Лизиса клеток, выделения и фракционирования пептиды <ol start="3"><li> Взвесьте центрифуги бутылку. Урожай образцы центрифугированием в течение 3 минут. Удалить СМИ и аспирации лишнюю жидкость. Взвесьте гранул и бутылки (как правило доходности между 1-2 грамма), то вспышка заморозить в жидком азоте. Добавить объеме, эквивалентном гранулы вес &quot;шлифовка&quot; буфер для замороженных гранул в жидком азоте (фосфатно-солевым буфером (PBS, Gibco), 10% глицерина, Ингибиторы протеазы (SigmaFAST Таблетки ингибитор протеазы, Sigma) и HALT фосфатазы ингибиторы (Thermo Scientific )). </li><li> Замораживание шлифовальные судна в жидком азоте. Подождите, пока жидкого азота перестает кипеть. Передача гранулы для шлифовальных судна, с замороженными шарикоподшипников. </li><li> Grind при 600 оборотах в минуту с 1 мин 20 сек цикл с направлением обращения в течение 3 минут. Замораживать шлифовальные судна в жидком азоте. Повторите 4 раза в течение 15 минут общего времени измельчения. </li><li> Сбор замороженных grindate в 50 мл Сокол трубки месте сухого льда. Хранить при температуре -80 ° С до готовности к использованию. </li><li> Сделать 10мл решение 8М мочевины, 0,1 М бикарбонат аммония, 0,1 М Трис рН 8,6. Добавить 3 объема мочевины буфера 1 объем замороженных grindate (например 3mls из мочевины буфера добавляется в 1 г гранул с 1 мл PBS буфера). Сразу же разрушать ультразвуком смеси с sonicator зонда (2 - 10 секунд импульсов). Держите наконечник в нижней части трубки для предотвращения вспенивания раствора. Grindate должны немедленно отправиться в раствор. </li><li> Очистить лизата центрифугированием в течение 5 минут при 4 ° C. </li><li> Передача супернатант на свежий труб. </li><li> Сделайте свежие аликвоту 0,5 М трис [2-карбоксиэтил] фосфин (TCEP). Добавить в образце при 1:100 для конечной концентрации 5 мМ. Инкубировать при 37 ° С в течение 1 ч. </li><li> Алкилирование снижается цистеина. Дать остыть до комнатной температуры. Сделайте свежие аликвоту 1M iodoacetamide. Хранить в темноте (мы обернуть трубу в фольге). Добавить в конечной концентрации 20 мМ. Инкубировать в темноте в течение 1 часа при комнатной температуре. </li><li> Quench iodoacetamide с 20 мМ DTT 1M от фондового при комнатной температуре в течение 1 ч. </li><li> Количественная белка со стандартным Брэдфорд или BCA анализа (не описаны). Возьмите образец для анализа с помощью SDS PAGE ниже. </li><li> Для проверки включения тяжелых изотопов, используйте 100 мкл снижается и алкилированные лизат. Развести 1:4 с дН 2 O, разрушать ультразвуком и добавить в трипсин 50:1 белка трипсином. Дайджест в течение минимум 4 часов, сухой образец вниз в вакууме скорость, а затем опреснения с C18 столбцов Ultramicrospin (гнездо Group). <ol><li> Гидратов колонку с 100 мкл ацетонитрила </li><li> Равновесие с 200 мкл 0,1% TFA. </li><li> Ресуспендируют сухого образца в 200 мкл 0,1% TFA. Нагрузка на колонну. Центрифуга при температуре ~ 200 мкг или минимальной скорости, необходимые для потока через колонку. </li><li> Промыть два раза с 200 мкл 0,1% TFA. </li><li> Элюируются в два раза с 50 мкл 60% ацетонитрила, 0,1% TFA. </li><li> Сухой образец в вакууме скорость. </li><li> Ресуспендируют образца в 20 мкл 0,1% муравьиной кислоты. Выполните 2 мкл на масс-спектрометре. Проверьте включение изотопно тяжелых аргинин и лизин сдвигом 10 и 8 Далтон в соответствующих т / г спектров. Включения для каждой аминокислоты должны быть в пределах от 96 - 98%. </li></ol></li><li> Смешайте эквивалентные суммы (мг белков) изотопически тяжелые и легкие образцы. </li><li> Разбавьте образцы 1:04 с 20% метанола. </li><li> Добавить трипсина на 1:200. Выдержите в течение ночи при температуре 37 ° C. </li><li> Убедитесь, что пищеварение отправился в завершение СТРАНИЦА SDS. Выполните 2 и 4 мкл предварительное переваривание образца и 8D 16 мкл сообщение трипсина переварить. Визуализируйте окрашиванием Кумасси, что пищеварение завершена. Если он не является полным, разрушать ультразвуком образца с sonicator кратко кончика зонда и переварить снова трипсином. </li><li> Сухой образец вниз в скорости вакцины. При сухой добавить 200 мкл с фильтром дН 2 O и вихревые до гранул переходит в раствор. Сухой образец вниз в скорости вакцины. Ресуспендируют снова дН 2 O. Сухой образец снова. </li><li> Ресуспендируют гранулы в 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФУ; Sigma). Убедитесь, что рН составляет около 3 с помощью рН полоски. При необходимости подкисляют 10% TFA. </li><li> Гранул из любой осадок. </li><li> Опреснения образцов на водах Sep-Pak Vac 500 мг C18 колонке. Не перегружайте этих столбцов. Максимальная сумма составляет 5 мг, но лучше, чтобы загрузить немного меньше. Разделить между образцом несколько столбцов, если необходимо. <ol><li> Гидратов колонки с 5 мл на 100% ацетонитрила. Центрифуга при температуре ~ 200 мкг или минимальной скорости, необходимые для потока через колонку. </li><li> Равновесия колонка с 5 мл 0,1% TFA. Нагрузка образца. Сбор потока и загрузить снова. </li><li> Промыть 5 мл 0,1% TFA. Повторить. </li><li> Элюции с 2 мл 60% ацетонитрила, 0,1% TFA. </li><li> Сухой образец вниз в скорости вакцины. </li></ol></li></ol> Пептидов Фракционирование и выделение фосфопептидов <ol><li> Пептиды фракционируют на HILIC колонке. Мы используем Tosoh TSK-гель Амид-80 4,6 мм х 25 см аналитическую колонку с охраной колонке. Не торопитесь с этим шагом, запустить колонку в течение 2 часов при 90% запустить две пустые градиенты до загрузки вашего образца. Максимальная нагрузка на колонки такого размера, как считается, около XX, мы обычно не загружайте более 5 мг в перспективе. </li><li> Растворитель - 98% ACN/0.1% TFA Растворитель B - 2% ACN/0.1% TFA Нагрузка в 90% в течение 20 &#39;, 90% до 85% в течение 5, 85% до 60% в течение 40&#39;, 60% до 0% в течение 5 &#39;, 0% до 90% в течение 5 &#39;. </li><li> Расход 1ml/min и фракций были собраны на 2 минуты интервалы, начиная с 85% до 60% градиент. </li><li> Комбинат фракций уменьшить количество фракций до 10. Увеличение фракций, скорее всего, принесет больше охват phosphoproteome. </li></ol> Обогащение фосфопептидов <ol><li> Фосфопептиды обогащенного использованием PHOS-Select Железный Affinity лари. Мы аликвоту нашей IMAC смолы, чтобы избежать повторного замораживания оттаивания. Сделайте 50 мл 250 мМ уксусной кислоты, 30% раствор АКС нагрузки. Довести рН до 2,7 с HCl. Ресуспендируют гранул в 500 мкл нагрузка решение. Проверьте рН, отрегулируйте с HCl или NaOH по мере необходимости. </li><li> Предварительная стирка 200 мкл IMAC бисером в соответствующую графу. Мы используем Molbiotec столбцов спина. Добавить 15 мкл 50% раствора (гель для загрузки раствора) в каждой фракции, и инкубировать образцы для 30 &#39;с конца по конец вращения. Держите потока для анализа. </li><li> Вымойте образцы 3 раза с грузом решение и один раз с 500 мкл фильтруется дН 2 O. </li><li> Элюции пептидов с 2 - 3 мин при 400 мкл 50 мМ Na 2 HPO 4 (рН 8,4) буфера. Трансфер в стеклянный пузырек. </li><li> Подкисляют до рН 3 с 5 мкл 100% муравьиной кислоты, флэш заморозить в жидком азоте, и высушенного образца вниз в скорости вакцины. </li><li> Ресуспендируют фосфопептидов в 200 мкл 0,1% TFA и C18 чист, как описано выше. Сухой вниз элюировали образцов в вакууме скорость. </li><li> Ресуспендируют пептидов в 20 мкл 0,1% муравьиной кислоты. Используйте 2 мкл на масс-спектрометре анализа или по мере необходимости. </li></ol> Примечания На протяжении большей части этого протокола вы будете работать «слепым». Лизиса клеток можно контролировать с помощью западных промокательной и Брэдфорда или BCA анализы, и пищеварение трипсина также может быть легко оценена. HILIC столбец дал след, подобный этому, или, как показано в других работах [1, 2] в зависимости от жидкой хроматографии машина, которая используется. Образцы контролируются масс-спектрометрии; тестирование образцов на недорогих машин, таких как LCQs или Мальдис перед отходом ко высокой анализ стоимости на высокой точностью массы, высокий машина разрешения. Наконец, если вы вниз сушки образца с кислотой в нем, использование стекла.

<ol><li>Albuquerque, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multidimensional+chromatography+technology+for+in-depth+phosphoproteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).</li>
<li>McNulty, D. E., Annan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+chromatography+reduces+the+complexity+of+the+phosphoproteome+and+improves+global+phosphopeptide+isolation+and+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (5), 971-980 (2008).</li>
<li>Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nat Biotechnol. 17 (10), 994-999 (1999).</li>
<li>Ross, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Gruhler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phosphoproteomics+applied+to+the+yeast+pheromone+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (3), 310-327 (2005).</li>
<li>Wilson-Grady, J. T., Villen, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteome+analysis+of+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteome analysis of fission yeast.</a> J Proteome Res. 7 (3), 1088-1097 (2008).</li>
<li>Villen, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SCX%2FIMAC+enrichment+approach+for+global+phosphorylation+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 3 (10), 1630-1638 (2008).</li>
<li>Jensen, S. S., Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+impact+of+some+experimental+procedures+on+different+phosphopeptide+enrichment+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 21 (22), 3635-3645 (2007).</li>
<li>Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+selective+enrichment+of+phosphorylated+peptides+from+peptide+mixtures+using+titanium+dioxide+microcolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).</li>
<li>Pinkse, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+isolation+at+the+femtomole+level+of+phosphopeptides+from+proteolytic+digests+using+2D-NanoLC-ESI-MS%2FMS+and+titanium+oxide+precolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns.</a> Anal Chem. 76 (14), 3935-3943 (2004).</li>
<li>Tao, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phosphoproteome+analysis+using+a+dendrimer+conjugation+chemistry+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry.</a> Nat Methods. 2 (8), 591-598 (2005).</li>
<li>Zhou, H., Watts, J. D., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+approach+to+the+analysis+of+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation.</a> Nat Biotechnol. 19 (4), 375-378 (2001).</li>
<li>Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+isolation+of+distinct%2C+overlapping+segments+of+the+phosphoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome.</a> Nat Methods. 4 (3), 231-237 (2007).</li>
</ol>

Этот метод даст обогащение фосфопептидов, которые могут быть количественный анализ. Число параметров может быть изменен в данном протоколе, но самый важный аспект помнить, чтобы сохранить свои фосфорилирования. Подготовка клеток для количественной может быть достигнуто в несколько различных способов, например, если вы не можете этикетку ваши клетки в живом организме, теги, например ICAT [3] или ITRAC [4] может быть использован после добычи до дифференциально этикетке двух культур для количественного целей. ...

<table><tbody><tr><td>Isotec&amp;#8482; L-Arginine-&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;,&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>608033</td><td></td></tr><tr><td>Isotec&amp;#8482; L-Lysine-&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>609021</td><td></td></tr><tr><td>GIBCO&amp;#8482; Фосфатно-солевой буфер (PBS) 7.4 (10X), жидкий</td><td>Invitrogen</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Таблетки с ингибитором протеаз SigmaFAST</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Коктейль ингибиторов фосфатаз Pierce Halt</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>Шаровая мельница Retsch PM100</td><td>Retsch</td><td>20.540.0001</td><td></td></tr><tr><td>Стальная измельчающая чаша Retsch объемом 125 ml</td><td>Retsch</td><td>01.462.0148</td><td></td></tr><tr><td>Колонка Ultramicrospin C18</td><td>The Nest Group</td><td>SUM SS10</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak Vac 500 mg C18</td><td>Waters</td><td>WAT043395</td><td></td></tr><tr><td>Аналитическая колонка TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm</td><td>Tosoh Corp.</td><td>13071</td><td>Это хроматографическая колонка для HILIC.</td></tr><tr><td>Предохранительная колонка 4.6 mm ID x 1 cm</td><td>Tosoh Corp.</td><td>19021</td><td>Мы рекомендуем использовать эту предохранительную колонку для продления срока службы вашей HILIC-колонки.</td></tr><tr><td>Железоаффинный гель PHOS-Select&amp;#8482;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9740</td><td>Это смола для IMAC. Разделить на аликвоты и хранить.</td></tr></tbody></table>

Количественные phosphoproteomics в жирные кислоты Вынужденное saccharomyces cerevisiae</em

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Этот протокол описывает роста и стимулирования, с жирной олеиновой кислоты, изотопно-тяжелой и легкой клетки С. CEREVISIAE. Клетки местности с помощью криодеструкции процедура в мясорубку шаровой мельнице и в результате grindate приведены в растворе мочевины солюбилизации. Эта процедура позволяет лизис клетки в метаболически неактивное состояние, сохраняя фосфорилирования и предотвращения переориентации phosphoproteome во время клеточного лизиса. После сокращения, алкилирования, трипсина переваривание белков, образцы обессоленной на C18 колонны и образец сложности сократились на фракционирования использованием гидрофильной хроматографии взаимодействия (HILIC). HILIC колонн преимущественно сохраняют гидрофильных молекул, которые хорошо подходят для phosphoproteomics. Фосфорилированных пептиды, как правило, элюируются позднее в хроматографического профиля, чем не фосфорилированных аналогов. После фракционирования, фосфопептиды обогащенного использованием иммобилизованных металла хроматографии, которая опирается на заряд основе сродство к фосфопептидов обогащения. В конце этой процедуры образцы готовы к количественному анализу методом масс-спектрометрии.

Описание процедуры количественного фосфорилирования использованием криодеструкция, мочевина solubilziation, HILIC фракционирования и IMAC обогащения фосфорилированных пептиды.

Количественные Phosphoproteomics в жирные кислоты Вынужденное Saccharomyces CEREVISIAE</em

В данном протоколе описывается процесс выращивания и стимуляции олеатом (жирной кислотой) изотопно тяжелых и легких клеток S. cerevisiae. Клетки растирают ...

Фосфорилирование является ключевым механизмом клеточной сигнализации, регулирующим процессы от локализации белков до транскрипции ДНК, и исследование только фосфогрупп с помощью масс-спектрометрии представляет собой многообещающее новое достижение в изучении как сигналинга, так и протеомики. Дифференциально меченные клетки подвергаются лизису в шаровой мельнице, после чего проводится восстановление, алкилирование, смешивание и переваривание. Переваренные пептиды фракционируют методом гидрофильной ионной хроматографии, а фосфопептиды обогащают из фракций с помощью метода iMac-обогащения.Затем фракции, обогащенные фосфопептидами, идентифицируют с помощью масс-спектрометрии. Здравствуйте, я Рэмси Селин из группы Е Института биологии персистенции. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру экстракции метаболически меченых фосфопептидов.Мы используем данную процедуру в нашей лаборатории для количественного изучения протеома фосса. Итак, приступим. Данная процедура начинается с культивирования изотопно-легких и изотопно-тяжелых клеток дрожжей.Сначала инокулируйте 100 миллилитров богатой среды одной колонией дрожжевых клеток. Выращивайте эту культуру в течение ночи до достижения OD 600 равной 1,0. Затем используйте её для посева двух однулитровых культур минимальной среды, содержащей полный набор аминокислот и дополненной 20 миллиграммами на литр изотопно.Обычный или изотопно-тяжелый аргинин и лизин используют для культивирования обеих однолитровых культур в течение 18 часов до достижения OD 600 1,8. Крайне важно, чтобы клетки прошли как минимум через девять поколений для полного включения меченых изотопов. После полного включения меченых изотопов центрифугируют клетки, выращенные в среде с изотопно-обычными аргинином и лизином.Для получения осадка клеток промойте осадок стерильной водой, затем перенесите в среду, содержащую олеат, с изотопно нормальными аргинином и лизином, и стимулируйте в течение 85 минут. Таким образом получается изотопно легкий образец, стимулированный олеатом. Другая культура, выращенная в среде с изотопно тяжелыми аргинином и лизином, не стимулируется олеатом и будет служить изотопно тяжелым контрольным образцом, выращенным на глюкозе.Для сбора одного литра культура распределяется по четырем центрифужных флаконам объемом 250 мл. После центрифугирования клетки собирают в одну пробирку, удаляя всё, кроме 100 мл среды, ресуспендируя клетки и перенося их в следующую пробирку. В итоге один большой осадок собирается в одной пробирке путем центрифугирования в течение трех минут при 4 000 об/мин.После удаления среды вес бутыли центрифуги с осадком сравнивают с весом пустой бутыли центрифуги. После центрифугирования удалите среду и аспирируйте избыток жидкости из бутылей, взвесьте осадки; типичный выход составляет от одного до двух граммов. Затем подвергните осадки шоковой заморозке в жидком азоте и добавьте к ним буфер для гомогенизации, содержащий ингибиторы протеаз и фосфатаз.Объем добавляемого буфера для гомогенизации должен быть эквивалентен массе осадка. Заморозьте сосуд для гомогенизации в жидком азоте. Дождитесь прекращения кипения жидкого азота.С помощью скальпеля отколите часть пеллета и перенесите его в измельчающий сосуд, содержащий замороженные шарики-измельчители. Измельчайте пеллеты при 600 RPM, используя цикл продолжительностью одна минута с изменением направления вращения каждые 22 секунды в течение трех минут. Повторно заморозьте измельчающий сосуд в жидком азоте.Повторите растирание еще четыре раза, чтобы общее время составило 15 минут. Время растирания фиксируют по завершении процедуры для обоих образцов. Соберите замороженную измельченную массу в фалькон-пробирки объемом 50 мл и храните в замороженном состоянии либо в жидком азоте, либо на сухом льду.Храните измельченный образец при температуре -80 °C до момента использования. Изоляция и фракционирование пептидов начинаются с их алкилирования. Первым шагом является растворение вашего образца в растворе мочевины.Растворите каждый образец измельченной ткани, добавив три объема мочевинного буфера на один объем замороженного образца. Например, к грануле массой 1 г добавляют 3 мл буфера для RIA. С одним миллилитром буфера PBS.Немедленно обработайте смесь ультразвуком с помощью зонда. Используйте зондирование. Держите наконечник зонда близко к дну пробирки, чтобы предотвратить вспенивание раствора.Измельченный материал должен немедленно попасть в раствор. Осадите лизаты путем центрифугирования при 6 000 RPM в течение пяти минут. При температуре четырех градусов Цельсия перенесите супернатант в чистые пробирки.Для запуска реакции восстановления добавьте в каждый образец свежеприготовленный 0,5 M Трис, два карбоксила LITAL PHOSPHINE или TCEP в разведении 1:100. Для достижения конечной концентрации TCEP 5 mM инкубируйте образцы при 37 °C в течение одного часа. После инкубации при 37 °C дайте образцам остыть до комнатной температуры.Затем добавьте свежеприготовленный 1 M раствор иодацетамида до конечной концентрации 20 mM и инкубируйте в темноте в течение одного часа при комнатной температуре. После часовой инкубации остановите реакцию иодацетамида, добавив 20 mM DTT. Оставьте пробу при комнатной температуре на один час.Восстановленные и алкилированные лизаты теперь готовы к перевариванию трипсином. На данном этапе образцы лизатов можно использовать для количественного определения белка, анализа методом SDS-ПАГЭ для проверки лизиса клеток и масс-спектрометрического анализа для подтверждения включения тяжелых изотопов. Чтобы начать переваривание трипсином, смешайте эквивалентные количества изотопно-тяжелых и легких образцов.Разбавьте образец в четыре раза 20% метанолом и добавьте трипсин в разведении 1:200. Инкубируйте образец в течение ночи при 37 °C. На следующий день, после подтверждения полного переваривания с помощью SDS-ПАГЕ и окрашивания кумасси, высушите образец в вакуум-концентраторе (speed vac) до полного испарения.Добавьте 200 µL фильтрованной дистиллированной воды и перемешайте на вортексе до полного растворения осадка. Высушите образец в вакуум-концентраторе (speed vac) и снова ресуспендируйте его в дистиллированной воде. После повторного высушивания образца еще раз ресуспендируйте осадок в 0,1% трифторуксусной кислоте (TFA); при необходимости проверьте с помощью pH-полосок, чтобы pH составлял около 3. Подкислите 10% TFA, чтобы осадить любые преципитаты.Образец, подвергнутый действию трипсина, теперь будет обессолен с использованием колонки Waters Set Pack VAC 500 mg C18. Сначала гидратируйте колонку, используя 5 mL 100% ацетонитрила, центрифугируя при примерно 200 ×g или минимальной скорости, необходимой для прохождения раствора через колонку. Затем уравновесьте колонку, используя 5 mL 0,1% TFA, и внесите образец.Следите за тем, чтобы не перегрузить колонку; при необходимости разделите пробу между несколькими колонками. Соберите проскок в контейнер для отходов и, если требуется, загрузите колонку повторно, затем промойте ее пятью миллилитрами 0.1% TFA. Повторите промывку, затем элюируйте двумя миллилитрами 60% ацетонитрила с 0.1% TFA. Элюат следует собрать путем центрифугирования.Высушите образец в вакуум-концентраторе (speed vac), затем ресуспендируйте высушенный образец в 200 µL растворителя B. Теперь ресуспендированный образец готов к фракционированию пептидов. Проведите фракционирование пептидов на аналитической колонке TSK gel AMIDE 80 с предварительным использованием защитной колонки. Выполняйте данный этап внимательно и без спешки.Пропускайте элюент через колонку в течение двух часов при содержании растворителя A 90%, затем проведите два холостых градиента перед нанесением образца. Обычно мы не наносим более пяти миллиграммов за один цикл на колонку такого размера. Современные и даже не самые новые системы жидкостной хроматографии позволяют автоматизировать ввод образца, сбор фракций, контроль скорости потока и смешивание градиентов.Данные параметры устанавливаются в начале запуска, как описано выше. Проведите градиентное элюирование следующим образом: 90%A в течение 20 минут, от 90%A до 85%A за пять минут, от 85%A до 60%A за 40 минут, от 60%A до 0%a за пять минут и от 0%A до 90%a за пять минут. Установите скорость потока 1 мл в минуту и собирайте фракции с интервалом в две минуты.Начиная с градиента от 85%A до 60%A, объединяйте фракции, чтобы сократить их число до 10; увеличение количества фракций, вероятно, обеспечит более широкий охват фосфопротеома. Фосфопептиды обогащают с помощью иммобилизованной металл-хелатной хроматографии. В качестве смолы для iMac мы используем гель Phos Select Iron Affinity.Сначала ресуспендируйте осадок в 500 µL нагрузочного раствора. Затем добавьте по 15 µL 50%-й суспензии в каждую фракцию и инкубируйте образцы в течение 30 минут при перемешивании в режиме «конец в конец». Сохраните поток для анализа.Промойте образец трижды загрузочным раствором, а затем один раз 500 µL фильтрованной дистиллированной воды; элюируйте пептиды в течение двух-трех минут, используя 400 µL 50 mM натрий-фосфатного буфера. Перенесите элюированные пептиды в стеклянный флакон. Добавьте к пептидам 5 µL 100% муравьиной кислоты для доведения pH до 3, ресуспендируйте фосфопептиды в 200 µL 0,1% TFA и повторно проведите обессоливание с помощью колонки C 18, как описано ранее, затем высушите полученные образцы в вакуум-концентраторе.В завершение ресуспендируйте фосфопептиды в 20 µL 0,1% муравьиной кислоты. Теперь образцы готовы к количественному анализу методом масс-спектрометрии. Здесь представлена хроматограмма фракционирования всех клеточных пептидов с использованием H-I-L-I-C хроматографии.На этой хроматограмме видно, что хотя фосфопептиды обнаруживаются на протяжении всего профиля элюции, основная масса фосфорилированных остатков удерживается почти до самого конца профиля элюции. Мы только что продемонстрировали вам, как измельчать клетки, расщеплять белки, фракционировать пептиды и проводить обогащение фосфопептидов с помощью иммобилизованной металл-аффинной хроматографии. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости сохранения фосфорилирования и проверки pH используемых буферных растворов.На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.

quantitative-phosphoproteomics-fatty-acid-stimulated-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Здесь мы опишем новые количественные техники протеомики для идентификации белковых комплексов в CEREVISIAE Saccharomyces. В данном исследовании мы использовали метод SILAC вместе с аффинной очистки следует тандемной масс-спектрометрии для определения с высокой специфичностью обязательными партнерами ER белков, Scs2p.

Идентификация белковых комплексов с количественной протеомики в CEREVISIAE С.

Мы описываем новый количественный метод lipidomics для выявления многочисленных видов липидов в дрожжах использованием обследований сканирования электрораспылением ионизации масс-спектрометрии (ESI / MS). Этот метод в настоящее время превышает методов идентификации и количественного определения липидного в способности для решения самых разных молекулярных форм липидов, чувствительность и скорость.

Количественная оценка Дрожжи Lipidome использованием Электроспрей ионизации масс-спектрометрии

Два дополнительных методы, основанные на цитометрии потока и микроскопии представлены которые позволяют количественно, в уровне одной клетки, динамики экспрессии генов, вызванных активацией MAPK пути в дрожжах.

Временная Количественная оценка МАРК индуцированной экспрессии в единичных дрожжевых клеток

В этой статье описывается анализ на основе роста дрожжей для определения генетических потребностей для деградации белка. В нем также демонстрируется метод быстрой экстракции дрожжевых белков, пригодный для вестерн-блоттинга для биохимического подтверждения требований к деградации. Эти методы могут быть адаптированы для мониторинга деградации различных белков.

Определение на основе экономического роста и биохимическая Подтверждение генетическим требованиям белка деградации в<em&gt; Saccharomyces Cerevisiae</em

Многие предсказанные (фосфо)липазы плохо характеризуются с точки зрения их субстратной специфичности и физиологических функций. В этой статье мы приводим протокол для оптимизации активности ферментов, поиска природных субстратов и предполагаем физиологические функции этих ферментов.

Определение субстрата специфичностью для липазы и фосфолипазы кандидатов

Этот протокол описывает процедуру для извлечения и обогатить phosphopeptides от линий клеток рака простаты или тканей для анализа phosphoproteome через массы на основе спектрометрии протеомики.

Phosphopeptide обогащения, в сочетании с Label бесплатно количественного масс-спектрометрии для расследования Phosphoproteome рака простаты

Мы представляем протокол с использованием жидкой хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией для выявления и количественной оценки основных клеточных липидов в Saccharomyces cerevisiae. Описанный метод количественной оценки основных классов липидов в дрожжевой клетке является универсальным, надежным и чувствительным.

Количественный анализ клеточного липидома Сахаромиса Церевизии с использованием жидкой хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией

Представлено здесь фосфопротеомный подход, а именно остановить и пойти экстракции отзыв основе фосфопротеом, который обеспечивает высокую пропускную способность и глубокий охват фосфопротеом Arabidopsis. Такой подход разграничивает обзор осмотического стресса, сигнализируемого в арабидопсисе.

Фосфопротеомная стратегия профилирования осмотического стресса Сигнализация в Арабидопсис

Представлен протокол идентификации и количественного определения основных классов водорастворимых метаболитов в дрожжевых Saccharomyces cerevisiae. Описанный метод является универсальным, надежным и чувствительным. Позволяет отделить структурные изомеры и стереоизомерные формы водорастворимых метаболитов друг от друга.

Количественная метаболомика Saccharomyces Cerevisiae с использованием жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией

Здесь представлен протокол метаболической маркировки дрожжей 14С-уксусной кислотой, которая сочетается с тонкослойной хроматографией для разделения нейтральных липидов.

Анализ синтеза нейтральных липидов в Saccharomyces cerevisiae методом метаболической маркировки и тонкослойной хроматографии

Здесь мы представляем протокол использования поверхностных субстратов дрожжей для анализов ферментативной модификации. Платформа была продемонстрирована с использованием анализа активности дефосфорилирования тирозинфосфатазы SHP-2 в отношении одного из ее субстратов в качестве репрезентативного анализа ферментативной модификации.

Ферментативная модификация и проточная цитометрия оценки белков, отображаемых на поверхности дрожжей

Узнайте метод количественного фосфопротеомики с использованием криолиза, фракционирования HILIC и обогащения IMAC для анализа фосфопептидов в Saccharomyces cerevisiae. Этот подход позволяет изучать клеточные сигнальные механизмы.

Количественные Phosphoproteomics в жирные кислоты Вынужденное Saccharomyces CEREVISIAE

Больше видео