Истощение конкретные клеточные популяции путем дополнения Истощение

Деплеция комплемента представляет собой быстрый, эффективный и недорогой метод очистки популяций иммунных клеток. Деплеция комплемента начинается с добавления к популяции клеток моноклональных антител IGM или IgG, которые воздействуют на определенный тип клеток. В данном примере мы будем проводить деплецию T-клеток.

Затем добавляют систему комплемента, что запускает протеолитический каскад, приводящий к гибели Т-клеток. После этого популяцию клеток промывают путем центрифугирования и фильтруют для удаления погибших клеток и клеточного детрита. Данный метод деплеции с помощью комплемента обычно позволяет элиминировать от 95 до 100% целевой популяции клеток.

Здравствуйте, я Бонни Диттл, исследователь из Института исследований крови при Центре крови Висконсина в Милуоки. Сегодня я продемонстрирую вам метод комплемент-деплеции — быстрый и недорогой способ удаления специфических популяций клеток.

В моей лаборатории мы используем этот метод для значительного обогащения популяций иммунных клеток, которые затем применяются в ряде биоанализов, включая исследования активации клеток и экспрессии белков. Итак, приступим. Перед началом эксперимента подготовьте аликвоты комплемента кролика объемом 0.5 или 1 мл и храните их в морозильной камере при температуре -20 или -80 °C.

Обязательно проведите титрование комплемента для подбора оптимального разведения в диапазоне от 1:10 до 1:20. В данной процедуре мы регулярно используем высококачественный коммерческий комплемент от Pereze biologicals; моноклональные антитела мыши и кролика обычно эффективно активируют комплемент, однако не все антитела будут подходящими. Антитела IgM, как правило, являются наиболее эффективными для индуцированного комплементом лизиса клеток.

Антитела IgG являются вторыми по эффективности и обычно используются потому, что большинство моноклональных антител относятся к классу IgG; титруйте каждое антитело для определения оптимальной концентрации при плотности клеток от 10⁷ клеток на мл, которая определяется эмпирически. Большинство антител используются в диапазоне от 0,1 до 10 µg/mL. Для деплеции Т-клеток селезенки мы используем моноклональное антитело, специфичное к TH1.

Для начала процедуры обеднения комплемента разведите клетки в культуральной среде, содержащей 5% инактивированной сыворотки теленка, так чтобы исходная концентрация клеток составляла 2 × 10⁷ клеток/мл. Например, 5 × 10⁷ клеток следует развести в 2,5 мл среды. Данный объем клеточной суспензии составляет одну половину конечного объема, и, следовательно, концентрация клеток в два раза превышает концентрацию, используемую при обеднении, которая будет составлять 1 × 10⁷ клеток/мл.

На данном этапе сохраните до 1 × 10⁶ клеток, чтобы в конце эксперимента можно было количественно определить степень их истощения. Кроме того, разморозьте необходимое количество комплемента при комнатной температуре. Мы установили, что при использовании кроличьего комплемента от Pereze Biologicals для 5 × 10⁷ клеток подходящим является разведение 1:15; при этом достаточно 1,5 мл замороженного Eloqua.

Теперь добавьте соответствующее количество антител в клеточную суспензию и перемешайте. Для стерилизации комплемента используйте наконечник-фильтр для шприца с низкой белковой адсорбцией. Наберите в шприц от 1 до 2 мл среды.

Перед добавлением комплемента к 5 × 10⁷ клеткам необходимо подготовить 340 мл комплемента в разведении 1:15. Затем профильтруйте комплемент непосредственно в пробирку, содержащую клетки и антитела. Теперь доведите конечный объем в пробирке до такой концентрации, чтобы содержание клеток составило 1 × 10⁷ клеток/мл.

Затем инкубируйте клетки в водяной бане при 37 °C в течение одного часа. Не забывайте перемешивать клетки каждые 15 минут путем осторожного переворачивания пробирки. После инкубации центрифугируйте клетки со скоростью, которая не повлияет на их жизнеспособность.

Затем вернитесь к ламинарному шкафу и удалите супернатант. Далее дважды промойте клетки 10 миллилитрами среды. Обратите внимание, как клеточный дебрис собирается в осадок, при этом часть его прилипает к стенкам полистирольных пробирок.

После последнего промывания профильтруйте клетки через стерильный нейлоновый фильтр для клеток с размером пор 70 micron. В завершение проверьте чистоту популяции клеток, сравнив количество целевых клеток до и после проведения проточной деплеции.

Цитометрия и иммуногистохимия являются предпочтительными методами определения чистоты клеток перед началом экспериментов. При использовании моноклонального антитела с высокой эффективностью активации комплемента первый раунд деплеции комплемента удаляет более 95% клеток. Например, при использовании проточной цитометрии для измерения процента αβ T-клеток в препарате плеоцитов мыши мы обнаружили, что после деплеции комплемента с помощью анти-CD51, который экспрессируется всеми T-клетками, но не другими лейкоцитами, их содержание составило 32,2% αβ T-клеток. Популяция TCR beta была сокращена на 95% до конечной концентрации 1,56%.

Я только что продемонстрировал вам быстрый и эффективный метод истощения специфических популяций клеток с использованием антигенспецифических антител при комплемент-зависимом удалении. При выполнении этой процедуры не забудьте проверить эффективность каждого антитела и титровать комплемент в предварительном эксперименте перед началом работы. На этом всё.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.