ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Я хотел бы поблагодарить Sreemanti Басу за предоставление данных для рисунке 1. Эта работа была выполнена при частичной поддержке гранта NIH AI069358 и Фонда BloodCenter исследований.

А. Кролик Дополнение <ol><li> Дополнять со кролика должно быть разморозить при комнатной температуре, а затем аликвоты в 0,5 и / или 1 мл объема и замораживают при -20-80 ° С в течение длительного хранения. </li><li> Каждая партия дополнение следует титровать для определения оптимальной рабочей концентрации. Как правило, разбавления 1:10-1:20 является оптимальным. </li><li> Кролик дополнением не всегда presterilized до продажи, в зависимости от конечного использования клеток, дополнения должны быть отфильтрованы стерилизовать при аликвоты и замороженных или перед добавлением к клеткам. </li></ol> Б. Антитела выбора <ol><li> Не все антитела эффективны при активации комплемента, таким образом, антитела должны быть сначала проверены на активность. </li><li> Обе мыши и крысы мАт эффективны при активации комплемента. </li><li> IgM антитела, как правило, наиболее эффективные для использования в дополнение вызванного лизиса клеток следуют IgG. IgG изотипов лучше для активации комплемента отличаются между видами. </li><li> Каждое антитело следует титровать для оптимального использования при плотности клеток 10 7 клеток / мл. </li></ol> C. Основные протокола <ol><li> Отрегулируйте начиная клеточной популяции до 5 х 10 7 клеток / мл в среде, содержащей тепла инактивированной FCS. Конечный объем клетки будет в два раза, начиная объема. Не забудьте сохранить некоторые клетки так, что истощение поддается количественной оценке. </li><li> Каждое антитело должна быть добавлена ​​к суспензии клеток на должном заданной концентрации или разведения. Смешайте клетки хорошо инверсии. </li><li> Рассчитать количество комплемента необходимо. Оттепель дополнением акции при комнатной температуре. Если дополнение не является стерильной, стерилизовать его, используя низкие связывания с белками фильтр наконечника шприца. Для шприц, добавьте несколько мл среды до того комплемента и фильтров непосредственно в пробирку, содержащую клеток и антител. </li><li> Отрегулируйте конечного объема в трубку так, что клетки на 1 х 10 7 клеток / мл. </li><li> Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение одного часа, смешивая каждые 15 минут. </li><li> Центрифуга клетки и отбросить супернатант. </li><li> Промыть среду в два раза. Сотовые мусора будет придерживаться стороны полистирола труб. Мертвые клетки и мусор может быть устранено при использовании фильтра ячейку или центрифугирования в градиенте плотности. </li><li> Проверьте чистоту ячейки путем сравнения клеточной популяции интереса до и после истощения. Проточной цитометрии и иммуногистохимии два хороших методов определения ячейки чистоты. </li></ol> Представитель Результаты При использовании МКА, что очень эффективно при активации дополнения, сотовые истощения после одного раунда больше чем 95%. Это показано на рисунке 1, где мы начали с мышью спленоцитов состоит из 32,2% клеток αβ T, которая была определена по выражению TCRβ (eBioscience, Сан-Диего, Калифорния) с помощью проточной цитометрии. Мы обедненной T клеток с помощью МКА, специфичные для Thy1, белка, выраженные всеми Т-клетки, но не других лейкоцитов. Антител мы использовали, была Y-19 крыс IgG2c 2. После процедуры, описанной, TCRβ населения сократилась на 1,56%, более чем 95%-ное снижение. <img src="/files/ftp_upload/1487/1487fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Истощение thy1 + Т-клеток селезенки к активации комплемента. Всего спленоцитов мыши были получены путем гомогенизации селезенки и лизис РБК. Анти-thy1 и ребенка кролика дополнения в заранее определенных концентрациях были добавлены к суспензии отдельных клеток спленоцитов, что конечная концентрация ячейки 1 х 10 7 клеток / мл. После инкубации в течение 1 часа при температуре 37 ° C, клетки промывают два раза и оценивается трипанового синего исключения для жизнеспособности клеток. Эффективность истощения оценивали с помощью проточной цитометрии сравнивая процент TCRβ + клеток до истощения (слева) и после истощения (правая панель). Горизонтальная полоса указывает на положительное окрашивание и выше номер бара процентов положительный.

<ol><li>Janeway, C., Travers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Immune+System+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">The Immune System in Health and Disease.</a> Immunobiology. , Current Biology Limited; Garland Pub. Inc. London; San Francisco; New York. (1994).</li>
<li>Jones, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+activities+of+antibodies+against+brain-associated+T+cell+antigens+II.+Stimulation+of+T+cell-induced+B+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Functional activities of antibodies against brain-associated T cell antigens II. Stimulation of T cell-induced B cell proliferation.</a> Eur J Immunol. 12, 30-37 (1982).</li>
</ol>

Очистка клеточных популяций распространенная процедура, необходимые для изучения их функций. Здесь мы опишем быстрый и эффективный метод истощения клеточных популяций использованием антиген-специфических антител и дополнения истощения. Истощение любой популяции клеток могут быть достигнуты, если комплемент-активации антител доступна для линии специфическим маркером. Здесь мы показали истощение Т клеток с помощью МКА, специфичные для Thy1, белок, выраженных по существу, все Т клеточные популяции. Мы обедненного более 95% αβ Т-клеток и оставшиеся спленоцитов были увеличены с 68% до 98%. Этот уровень клеточного чистоты похож на другие стратегии, в том числе очистка FACS и магнитные бусины разделения. Дополнение истощение быстрый метод, который может быть выполнен в 1,5 часов после начала клеточной популяции получается. Еще одно преимущество дополнением истощения в том, что каждая лаборатория может выполнять технику, поскольку она не требует дорогостоящего оборудования и реактивов. Только основные части оборудования, необходимого являются водяной бане и центрифуги. Кролик дополнение можно приобрести у различных производителей по разумным ценам (см. таблицу реагентов) и многие мАт можно приобрести у ATTC и выращенного для управления затратами. В отличие от этого, FACS требует потока цитометр с соты сортировки, которая будет стоить в шесть цифр и дорогих флуоресцентно меткой МАБ. Магнитный шарик разделение умеренным ценам, но требует покупки магнита и магнитных бус, который может быть дорогостоящим. Кроме того, некоторые магнитные бусины стратегии разделения также требуют покупки колонок. Основным камнем преткновения для использования дополнением для сотовых истощения является наличие комплемента активации МАБ с антигенной специфичности требуется. Хотя человека, мыши и крысы антител у всех есть возможность исправить дополнением, некоторые изотипов лучше, чем другие. Хотя IgM из всех трех видов является весьма эффективным при фиксации дополнением IgG изотипов меняться. Таким образом, каждый МКА должны быть сначала протестированы в рамках пилотного исследования с целью определения его эффективности. Для антитела, которые не являются высокоэффективными, два раунда дополнением истощения могут быть выполнены без ущерба для жизнеспособности оставшихся клеточных популяций. Как экономии средств, антитела следует титровать для оптимальной эффективности. Кроме того, антитела использоваться не должны быть очищены. Гибридома супернатанты и асцит жидкости работать так же эффективно, что особенно удобно для IgM антитела, которые трудно очистить. Как и антитела, крайне важно, чтобы дополнять титровать в экспериментальном исследовании. Слишком высокой концентрации может привести к потере жизнеспособности нецелевых клеточных популяций. Также важным является то, что инкубационный период не превышает 60 минут. В нашем протокол, мы сотрудничаем инкубировать антител и дополнять друг с другом. Тем не менее, клетки могут быть помечены с антителами в течение 15-30 минут и промывают до того комплемента. При использовании этой стратегии, убедитесь, что для выполнения антител инкубации на льду, чтобы предотвратить потерю ячейки антигеном на поверхности клетки, как это происходит с некоторыми белков исправлений и укупорки или интернализация рецепторов. Хотя высокоэффективным, главный недостаток в дополнение к истощению, по сравнению с другими методами является то, что она не может быть использована для положительного отбора. Таким образом, трудно получить субпопуляций клеток. Например, было бы трудно очистить маргинальной зоне В-клеток фолликулярного В-клеток, которые лучше всего сделать, FACS. В этой ситуации, активации комплемента могут быть использованы для Т-клеток, разрушающих уменьшить количество клеток быть отсортированы. Эта стратегия позволит снизить рода времени, что позволит сэкономить деньги и будут менее суровыми клеток. После очистки конкретных клеточных популяций является общим требованием ряд стратегий были разработаны. Основные преимущества стратегии истощения дополнением являются его доступность, техническая простота и экономия времени.

<table><tbody><tr><td>Комплемент крольчат в возрасте 3–4 недель</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>31061-3</td><td></td></tr><tr><td>Водяная баня</td><td>Различные</td><td>различные</td><td>Также можно использовать инкубатор, установленный на 37 &amp;#x00B0;C.</td></tr></tbody></table>

Истощение конкретные клеточные популяции путем дополнения Истощение

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

Очистка иммунных клеточных популяций часто требуется для того, чтобы изучить их уникальные функции. В частности, молекулярные подходы, такие как ПЦР в реальном времени и микрочипов анализа требуют изоляции клеточных популяций с высокой чистоты. Обычно используемые стратегии очистки включают флуоресцентные активированный сортировки клеток (FACS), магнитно-бусинка разделения и дополнения истощения. Из трех стратегий, дополняют истощения предлагает преимущества быть быстрой, недорогой, нежный на клетки и высокий выход ячейки. Системы комплемента состоит из большого количества белков плазмы, что при активации инициировать каскад протеолитических кульминацией в формировании мембран-атаки комплекс, который формирует поры на поверхности клетки, что приводит к гибели клеток<sup&gt; 1</sup&gt;. Классический путь активируется IgM и IgG антител и был впервые описан в качестве механизма для уничтожения бактерий. С поколения моноклональных антител (МКА), каскад комплемента могут быть использованы для лизиса любой популяции клеток в антиген-специфической манере. Истощение клеток каскад комплемента достигается за счет того комплемента фиксации антиген-специфические антитела и кролика дополнением к начальной клеточной популяции. Клетки инкубировали в течение одного часа при температуре 37 ° С и лизировали клетки впоследствии удалены два этапа стирки. MAb с высокой эффективностью для связывания комплемента обычно разрушающих 95-100% целевой популяции клеток. В зависимости от очистки стратегии целевых популяции клеток, дополняют истощения могут быть использованы для клеточной очистки или для обогащения популяции клеток, которые затем могут быть дополнительно очищают последующий метод.

Для эффективного исследования функции иммунной клеточной популяции их очистки часто требуется. Дополнение истощение быстрый и недорогой метод для изоляции иммунных клеточных популяций с высокой чистоты.

Для изучения уникальных функций популяций иммунных клеток часто требуется их очистка. В частности, такие молекулярные подходы, как ...

Деплеция комплемента представляет собой быстрый, эффективный и недорогой метод очистки популяций иммунных клеток. Деплеция комплемента начинается с добавления к популяции клеток моноклональных антител IGM или IgG, которые воздействуют на определенный тип клеток. В данном примере мы будем проводить деплецию T-клеток.Затем добавляют систему комплемента, что запускает протеолитический каскад, приводящий к гибели Т-клеток. После этого популяцию клеток промывают путем центрифугирования и фильтруют для удаления погибших клеток и клеточного детрита. Данный метод деплеции с помощью комплемента обычно позволяет элиминировать от 95 до 100% целевой популяции клеток.Здравствуйте, я Бонни Диттл, исследователь из Института исследований крови при Центре крови Висконсина в Милуоки. Сегодня я продемонстрирую вам метод комплемент-деплеции — быстрый и недорогой способ удаления специфических популяций клеток.В моей лаборатории мы используем этот метод для значительного обогащения популяций иммунных клеток, которые затем применяются в ряде биоанализов, включая исследования активации клеток и экспрессии белков. Итак, приступим. Перед началом эксперимента подготовьте аликвоты комплемента кролика объемом 0.5 или 1 мл и храните их в морозильной камере при температуре -20 или -80 °C.Обязательно проведите титрование комплемента для подбора оптимального разведения в диапазоне от 1:10 до 1:20. В данной процедуре мы регулярно используем высококачественный коммерческий комплемент от Pereze biologicals; моноклональные антитела мыши и кролика обычно эффективно активируют комплемент, однако не все антитела будут подходящими. Антитела IgM, как правило, являются наиболее эффективными для индуцированного комплементом лизиса клеток.Антитела IgG являются вторыми по эффективности и обычно используются потому, что большинство моноклональных антител относятся к классу IgG; титруйте каждое антитело для определения оптимальной концентрации при плотности клеток от 10⁷ клеток на мл, которая определяется эмпирически. Большинство антител используются в диапазоне от 0,1 до 10 µg/mL. Для деплеции Т-клеток селезенки мы используем моноклональное антитело, специфичное к TH1.Для начала процедуры обеднения комплемента разведите клетки в культуральной среде, содержащей 5% инактивированной сыворотки теленка, так чтобы исходная концентрация клеток составляла 2 × 10⁷ клеток/мл. Например, 5 × 10⁷ клеток следует развести в 2,5 мл среды. Данный объем клеточной суспензии составляет одну половину конечного объема, и, следовательно, концентрация клеток в два раза превышает концентрацию, используемую при обеднении, которая будет составлять 1 × 10⁷ клеток/мл.На данном этапе сохраните до 1 × 10⁶ клеток, чтобы в конце эксперимента можно было количественно определить степень их истощения. Кроме того, разморозьте необходимое количество комплемента при комнатной температуре. Мы установили, что при использовании кроличьего комплемента от Pereze Biologicals для 5 × 10⁷ клеток подходящим является разведение 1:15; при этом достаточно 1,5 мл замороженного Eloqua.Теперь добавьте соответствующее количество антител в клеточную суспензию и перемешайте. Для стерилизации комплемента используйте наконечник-фильтр для шприца с низкой белковой адсорбцией. Наберите в шприц от 1 до 2 мл среды.Перед добавлением комплемента к 5 × 10⁷ клеткам необходимо подготовить 340 мл комплемента в разведении 1:15. Затем профильтруйте комплемент непосредственно в пробирку, содержащую клетки и антитела. Теперь доведите конечный объем в пробирке до такой концентрации, чтобы содержание клеток составило 1 × 10⁷ клеток/мл.Затем инкубируйте клетки в водяной бане при 37 °C в течение одного часа. Не забывайте перемешивать клетки каждые 15 минут путем осторожного переворачивания пробирки. После инкубации центрифугируйте клетки со скоростью, которая не повлияет на их жизнеспособность.Затем вернитесь к ламинарному шкафу и удалите супернатант. Далее дважды промойте клетки 10 миллилитрами среды. Обратите внимание, как клеточный дебрис собирается в осадок, при этом часть его прилипает к стенкам полистирольных пробирок.После последнего промывания профильтруйте клетки через стерильный нейлоновый фильтр для клеток с размером пор 70 micron. В завершение проверьте чистоту популяции клеток, сравнив количество целевых клеток до и после проведения проточной деплеции.Цитометрия и иммуногистохимия являются предпочтительными методами определения чистоты клеток перед началом экспериментов. При использовании моноклонального антитела с высокой эффективностью активации комплемента первый раунд деплеции комплемента удаляет более 95% клеток. Например, при использовании проточной цитометрии для измерения процента αβ T-клеток в препарате плеоцитов мыши мы обнаружили, что после деплеции комплемента с помощью анти-CD51, который экспрессируется всеми T-клетками, но не другими лейкоцитами, их содержание составило 32,2% αβ T-клеток. Популяция TCR beta была сокращена на 95% до конечной концентрации 1,56%.Я только что продемонстрировал вам быстрый и эффективный метод истощения специфических популяций клеток с использованием антигенспецифических антител при комплемент-зависимом удалении. При выполнении этой процедуры не забудьте проверить эффективность каждого антитела и титровать комплемент в предварительном эксперименте перед началом работы. На этом всё.Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.

depletion-of-specific-cell-populations-by-complement-depletion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Иммунология и инфекции

Макрофаги играют центральную роль в поддержании гомеостаза и патологии во многих тканях. Протокол, представленные здесь описываются методы истощения...

Истощение и разведения макрофагов у мышей

Здесь мы опишем два анализы для измерения активации комплемента, вызванное антителами против красных кровяных клеток. Основным преимуществом над текущими анализов является их количественный и природа простой в интерпретации.

Методы количественного определения антител-индуцированной активации комплемента по ЭРИТРОЦИТОВ

Руководство представлены для генерации убийцы искусственного антигенпредставляющих клеток, KaAPC, эффективным инструментом для истощения в пробирке человеческих антиген-специфических Т клеток и альтернативного решения сотовой иммунотерапии для лечения Т-клеточного аутоиммунных заболеваний в антиген конкретного способа без ущерба оставшуюся иммунную систему.

Убийца Искусственный антигенпредставляющих клеток (KaAPC) для эффективного In Vitro Истощение человека антиген-специфических Т-клеток

Микроглия может влиять на нейроны и другие глии в культуре с помощью различных неклеточных автономных механизмов. В этой статье мы представляем протокол селективного истощения микроглии из первичных нейронных культур. Этот метод имеет потенциал для выяснения роли микроглиально-нейронных взаимодействий с последствиями для нейродегенеративных состояний, где нейровоспаление является отличительной чертой.

Селективный Истощение микроглии от мозжечка ЗК культур, используя L-лейцина

Человеческие ксенотрансплантаты опухоли и развитую сосудистую сеть инфильтрирована клетками мыши происхождения во время фазы роста в естественных условиях. Чтобы обойти смещение, вызванное этими загрязняющими клетками во время ниже по течению анализа, мы разработали метод, позволяющий для полной истощению всех клеток мыши с помощью магнитной сортировки клеток.

Истощение мышиных клеток из ксенотрансплантатов опухолей человека значительно улучшает Downstream Анализ клеток-мишеней

Мы показали, как идентифицировать и изолировать 6 подмножеств миелоидного прародителей из мышиных костного мозга с помощью комбинации магнитных и флуоресценции, сортировка (MACS и СУИМ). Этот протокол может использоваться для в vitro assays культуры (метилцеллюлоза или жидкости культуры), в естественных условиях приемных передачи экспериментов и РНК/белка анализа.

Выявление и изоляция Oligopotent и Lineage, совершенные миелоидного предшественники костного мозга мыши

Мы описываем здесь поток цитометрия основе в естественных условиях убийства анализ, который позволяет изучение иммунодоминирования в цитотоксических т-лимфоцитов (CTL) ответы на модели опухолевого антигена. Мы предоставляем примеры того, как этот элегантный анализ может быть использован для механистических исследований и для тестирования эффективности лекарственных препаратов.

Портняжное в естественных условиях цитотоксичности исследования для изучения Иммунодоминирования в опухоль конкретных CD8+ т ячейки ответы

Этот протокол подробно описывает все этапы, связанные с получением гемопоэтических прародителей CD34+ на основе лейкофильтра и их дифференцировкой in vitro и созреванием в проплателетоносные мегакариоциты, способные высвобождать тромбоциты в культуральная среда. Эта процедура полезна для углубленного анализа клеточных и молекулярных механизмов, контролирующих мегакариопоезис.

Клетки CD34+ из лейкополетных фильтров как источник клеток для изучения дифференцировки мегакариоцитов и образования тромбоцитов

Здесь мы опишем метод создания двойных эмульсионных капель, инкапсулирующих одну Т-клетку и раковую клетку-мишень, для изучения уничтожения клеток на уровне одной клетки. Этот метод позволяет проводить двойное количественное определение как цитотоксических молекул, так и апоптоза клеток-мишеней в большой популяции Т-клеток.

Анализ цитотоксичности на основе капель для оценки химерных антигенных рецепторов Т-клеток на уровне одиночных клеток

В данной статье представлен протокол селективной абляции почечных макрофагов для изучения их регенерации с использованием инструмента для абляции клеток CD59/интермедилизина человека. Этот метод также применим для изучения функции и регенерации других клеточных популяций в почках, печени и жировой ткани.

Быстрое истощение почечных макрофагов с помощью инструмента для абляции клеток CD59/интермедилизина человека

Изучите метод истощения комплементом для выделения Т-клеток с высокой степенью чистоты. Этот быстрый и экономичный протокол использует моноклональные антитела и систему комплемента для эффективной очистки иммунных клеток.

Истощение конкретные клеточные популяции путем дополнения Истощение

Больше видео